Визуализация развития рубцов с помощью анализа SCAD - анализ рубцевания кожи Ex-situ

Резюме

Этот протокол описывает генерацию эксплантата кожи-фасции, называемого «SCar like tissue in A Dish» или SCAD. Эта модель позволяет беспрецедентно визуализировать одиночные фибробласты при образовании рубцов.

Аннотация

Глобальная реакция млекопитающих на герметизацию глубоких тканевых ран заключается в образовании рубцов и сокращении тканей, опосредованных специализированными фибробластами фасций. Несмотря на клиническое значение образования рубцов и нарушения заживления ран, наше понимание динамики фибробластов фасций в заживлении ран является поверхностным из-за отсутствия соответствующих анализов, которые позволяют непосредственно визуализировать хореографию и динамику фибробластов в сложных средах, таких как в кожных ранах. В этой статье представлен протокол для создания шрамов на коже ex-situ с использованием SCAD или «SCar-подобной ткани в чашке», которые имитируют сложную среду кожных ран. В этом анализе кожа полной толщиной 2 мм иссекается и культивируется вверх ногами в средах в течение 5 дней, в течение которых рубцы и контрактуры кожи развиваются равномерно. Эта методология в сочетании с трансгенными моделями мышей, специфичными для линии фибробластов, позволяет визуализировать отдельные линии фибробластов на протяжении всего процесса заживления ран. В целом, этот протокол помогает исследователям понять фундаментальные процессы и механизмы заживления ран, непосредственно изучая влияние модуляторов на результаты заживления ран.

Введение

Заживление ран – это процесс восстановления нарушенных ран. Повреждения тканей у беспозвоночных приводят к частичной или полной регенерации. Напротив, млекопитающие реагируют на глубокие повреждения рубцеванием, процессом, предназначенным для быстрого уплотнения ран плотными пробками матричных волокон, которые минимизируют нарушенную область и в то же время постоянно деформируют поврежденный участок ^1,2,3. Большие ожоги кожи или глубокие открытые раны у млекопитающих приводят к патологическим фенотипам, таким как гипертрофические или келоидные рубцы ^4,5. Эти обильные шрамы создают огромную нагрузку на клинические и глобальные системы здравоохранения. Только в США управление шрамами стоит около 10 миллиардов долларов в год ^6,7. Поэтому разработка соответствующих методологий необходима для лучшего понимания основополагающих процессов и механизмов, связанных с образованием рубцов.

В последние годы широкий спектр исследований на мышах выявил гетерогенные популяции фибробластов с различными функциональными потенциями, основанными на их происхождении в определенных местах кожи ^8,9,10. В коже спины Rinkevich et al., 2015, определили, что специфическая популяция фибробластов с ранней эмбриональной экспрессией Engrailed-1 (En1), называемая EPF (Engrailed positive fibroblast), способствует кожному рубцеванию при ранении. И наоборот, другая линия фибробластов без истории энгральсированной экспрессии, энгралированный отрицательный фибробласт (ENF), не способствует образованию рубцов⁸. Картирование судьбы этих линий En1 с использованием cre-управляемых трансгенных линий мыши, скрещенных с флуоресцентными репортерными линиями мыши, такими как R26^mTmG (En1Cre x R26^mTmG), позволяет визуализировать популяции EPF и ENF.

Изучение миграции фибробластов in vivo в течение нескольких дней ограничено этическими и техническими ограничениями. Кроме того, комбинированные, вирусные и нейтрализующие экраны библиотеки антител для модуляции путей, участвующих в рубцевании, являются технически сложными. Ранее использовавшиеся модели in vitro или ex vivo не обладают способностью визуализировать миграцию фибробластов и образование рубцов в подлинных микросредах кожи, однородность в развитии рубцов, а также сложность тканей, которая имитирует in vivo кожные среды^11,12. Чтобы преодолеть вышеуказанные ограничения, мы разработали анализ рубцевания ex vivo, называемый SCAD (SCar-подобная ткань в A Dish)^13,14. Этот простой анализ может быть выполнен путем иссечения кожи полной толщины 2 мм, содержащей эпидермис, дерму и подкожные участки фасций, и культивирования их в сывороточных средах ДМСО на срок до 5 дней. Шрамы, полученные из SCAD, надежно реплицируют транскриптомные и протеомные признаки рубцов in vivo. Кроме того, SCAD, генерируемые соответствующими трансгенными линиями мышей (например, мышей En1), скрещенных с флуоресцентными репортерными линиями мыши, позволяют визуализировать динамику миграции фибробластов и развитие рубцов с беспрецедентным разрешением. Кроме того, эта модель может быть легко адаптирована для любых приложений с высокой пропускной способностью (например, библиотека соединений, библиотека антител или вирусный скрининг)^13,14. В этой статье мы опишем оптимизированный протокол для генерации SCAD и последующих приложений последующей обработки для изучения клеточной и матричной динамики при развитии рубцов.

протокол

Модель, представленная ниже, предоставляет подробное пошаговое описание генерации анализа SCAD, как кратко описано в Jiang et al., 2020¹³. Пробоподготовка SCAD проводилась после жертвоприношения животных в соответствии с международными руководящими принципами и руководящими принципами правительства Верхней Баварии. Животные были размещены в центре для животных Центра Гельмгольца в Мюнхене. Помещения поддерживались с оптимальной влажностью и постоянной температурой с 12-часовым световым циклом. Животные снабжались пищей и водой ad libitum.

1. Подготовка тканей SCAD

1. Жертвоприношение новорожденных щенков на постнатальный день 0 или день 1 (P0 или P1).
2. Осторожно иссечь не менее 1,5 см х 1,5 см полной толщины спинной кожи до слоя скелетных мышц с помощью стерильного хирургического скальпеля.
3. Очистите кожу с помощью стерильных изогнутых щипцов, гарантируя, что поверхностная фасция неповреждена с нижележащей мышцей panniculus carnosus.
4. Промыть иссеченную ткань 50-100 мл холодной среды DMEM/F-12 для удаления загрязняющей крови.
5. Вымойте один раз сбалансированным солевым раствором Хэнкса (HBSS) для поддержания жизнеспособности тканей и клеток.
6. Поместите кожу вверх ногами (поверхностная фасция сверху) в 10 см чашку Петри, содержащую среду DMEM/F12.
7. Используя одноразовый 2-миллиметровый биопсийный перфоратор, иссекайте круглые кусочки кожи полной толщины, гарантируя, что поверхностная фасция нетронута с подлежащей мышцей panniculus carnosus до эпидермиса для генерации тканей SCAD.
8. Подготовьте и заполните 200 мкл DMEM/F12 (без фенольного красного) полной среды DMEM/F12 с добавлением 10% FBS, 1x GlutaMAX, 1x MEM заменимых аминокислот и 1x пенициллина/стрептомицина в отдельные лунки 96-луночной пластины.
9. Используя стерильные щипцы, аккуратно перенесите и полностью погружайте отдельные ткани SCAD вверх ногами (фасции, обращенные вверх) в колодцы 96-луночной плиты.
10. Переложите пластину в инкубатор клеточной культуры, поддерживаемый в стандартных условиях (37 °C, 21% (v/v) кислорода, 5% (v/v) C0₂ и влажность 95%).

2. SCAD - Культура тканей

1. Культивирование SCAD в инкубаторе на срок до 5 дней.
2. На 2-й и 4-й день посева замените среду 200 мкл свежей предварительно подогретой полной среды DMEM/F12 для обеспечения непрерывной жизнеспособности клеток и тканей. Заменяйте лечебные соединения во время каждой смены среды.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в колодце остается 10 мкл среды, чтобы избежать прилипания тканей к лункам.
3. Подготовьте SCAD для следующих экспериментов: Живая визуализация (раздел 3) и Сбор тканей и окрашивание иммунофлуоресценции 2D / 3D (раздел 4).

3. Визуализация SCAD в реальном времени

1. Приготовьте не менее 30 мл 2%-3% (мас./об.) низкоплавкого раствора агарозы в ПБС в стеклянной бутылке, нагревая его в микроволновой печи до кипения.
2. Немедленно переложите флакон и охладите жидкий раствор агарозы на водяной бане с температурой 40 °C.
3. Перенесите ткань SCAD с фасцией/шрамом вверх на центр 35-миллиметровой тарелки.
4. Встраивайте SCAD при комнатной температуре (RT), медленно перенося жидкую агарозу 40 °C на 35-миллиметровую посуду с помощью пипетки Пастера. Агароза полимеризуется в течение 2 мин.
5. Добавьте 2 мл предварительно нагретой полной среды DMEM/F12 (без индикатора фенольного красного цвета).
6. Получайте покадровые снимки 0 суток ДО 48 ч с помощью конфокального или многофотонного микроскопа, оснащенного подходящей инкубационной системой, установленной на 37 °C, 21% (v/v) кислорода, 5% (v/v) C0₂ и влажность 95%.

4. Сбор тканей и 2D/3D иммунофлуоресцентное окрашивание

1. Промывайте ткани в соответствующие моменты времени, заменяя среду стерильным PBS.
2. Используя стерильные щипцы, осторожно перенесите отдельные SCAD в микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл, содержащие 500 мкл 2% параформальдегида, чтобы зафиксировать ткани на ночь при 4 °C.
3. Трижды вымойте ткани PBS и приступайте к 2D/3D иммунофлуоресцентному окрашиванию.
4. 3D иммунофлуоресцентное окрашивание
   1. Пермеабилизируют ткани путем инкубации в микроцентрифужной трубке объемом 1,5 мл, содержащей 500 мкл PBS, дополненной 0,2% желатина, 0,5% Triton-X100 и 0,01% тимеросала (PBSGT) при RT в течение 24 ч.
   2. Приготовьте достаточное количество первичных антител в соответствии с инструкциями производителя и инкубируйте ткани SCAD в 150 мкл раствора PBSGT в течение 24 ч при RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если оптимальная концентрация антител для иммунной флуоресценции не указана производителем, предварительное титрование антител должно быть выполнено на контрольных тканях с использованием различных концентраций (например, 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000).
   3. Осторожно промыть SCAD три раза PBS, чтобы удалить несвязанное первичное антитело.
   4. Инкубировать ткань с 1:1000 соответствующими вторичными антителами Alexa Fluor в PBS в течение ночи в RT.
   5. Аккуратно промыть ткань в течение 30 мин в PBS три раза, чтобы удалить излишки несвязанных вторичных антител.
   6. Перенесите ткань на стеклянную тарелку толщиной 35 мм для конфокальной или многофотонной визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании объективов погружения в воду встраивайте SCAD в агарозу с низкой температурой плавления 2%, чтобы обездвижить ткань для предотвращения дрейфа во время получения изображения
5. 2D иммунофлуоресцентное окрашивание
   1. Перенесите ткань в криоформу и аккуратно заполните соединение оптимальной температуры резания (OCT), чтобы полностью погрузить ткань.
   2. Аккуратно отрегулируйте ориентацию ткани, обеспечив отсутствие пузырьков воздуха для получения поперечного сечения или вертикального сечения.
   3. Поместите форму на сухой лед на 20-30 мин и высиживайте блок при -80 °C в течение ночи.
   4. Установите температуру лезвия на -25 °C и температуру блока образца на -17 °C. Подготовьте 6-мкм криосекцию с помощью криостата, перенесите секции на адгезионный слайд и храните слайды в морозильной камере при температуре -20 °C.
   5. Промойте слайды три раза в PBS и инкубируйте слайды в 5% бычьем сывороточном альбумине (BSA) с / в PBST (PBS, дополненный 0,05% Tween) в течение 1 ч.
   6. Добавьте соответствующее количество первичного антитела к 150 мкл PGST и инкубируйте в течение ночи при 4 °C
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если оптимальная концентрация антител для иммунной флуоресценции не указана производителем, предварительное титрование антител должно быть выполнено на контрольных участках с использованием различных концентраций (например, 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000).
   7. Аккуратно промыть участки три раза PBS, чтобы удалить несвязанное первичное антитело.
   8. Инкубировать ткань с 1:1000 соответствующими вторичными антителами Alexa Fluor в PBS на ночь при RT в течение 2 ч.
   9. Осторожно промыть ткань в течение 5 мин в PBS три раза, чтобы удалить излишки несвязанных вторичных антител.
   10. Установите слайды с помощью монтажного носителя, содержащего DAPI, и высушите слайды в темноте в RT.
   11. Изобразите участки с помощью флуоресцентного микроскопа.

Результаты

Генерация SCAD может быть разделена на три основных этапа: сбор обратной кожи у мышей P0-P1, генерация биопсийных пуншей полной толщины и последующая культивирование отдельных скадов до 5 дней в 96-луночных пластинах. В качестве считывания этот анализ может быть дополнительно применен для а?...

Обсуждение

Несколько моделей уже были разработаны, чтобы понять образование рубцов после травмы. Хотя в этом отношении было достигнуто много успехов, но фактические механизмы все еще не ясны. В отличие от предыдущей методики, модель SCAD включает в себя все типы клеток и кожные слои, тем самым сохран...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Tween 20, Nonionic Detergent	Biorad Laboratories	1610781
Bovine serum albumin, Cold ethanol fract	Sigma	A4503-50G
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL	LIFE Technologies	11039021
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190169
Epredia Cryostar NX70 Cryostat	Thermo Scientific
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides	Fisher scientific	J1800AMNZ	Adhesion slides
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL	LIFE Technologies	10500064
Fluoromount-G with DAPI	Life Technologies	00 4959 52	Mounting medium with DAPI
Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length	Fisher Scientific	12381369
Gelatin from porcine skin	Sigma	G2500-100G
GlutaMAX Supplement-100 mL	LIFE Technologies	35050038
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL	LIFE Technologies	14025092
Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2	Ibidi	11922
Ibidi Heating system	Ibidi	10915
Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680–1300 nm	Leica		Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single)
Non Essential Amino Acids	LIFE Technologies	11140035
NuSieve GTG Agarose ,25 g	Biozym /Lonza	859081
OCT Embedding Matrix	Carlroth	6478.1
Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL	VWR International	43368.9M
Pen-Strep	Gibco	15140122
Stiefel Biopsy-Punch 2 mm	Stiefel	270130
Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm	Fisher Scientific	15654444
Thimerosal Bioxtra, 97%–101%	Sigma-Aldrich	T8784-1G
Zeiss Axioimager M2 upright microscope	Zeiss