Visualisierung der Narbenentwicklung mit SCAD Assay - einem Ex-situ Hautnarbentest

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung eines Haut-Faszien-Explantats, das als "SCar-ähnliches Gewebe in einer Schale" oder SCAD bezeichnet wird. Dieses Modell ermöglicht eine beispiellose Visualisierung einzelner Fibroblasten während der Narbenbildung.

Zusammenfassung

Die globale Reaktion von Säugetieren auf die Versiegelung tiefer Gewebewunden erfolgt durch Narbenbildung und Gewebekontraktion, vermittelt durch spezialisierte Faszienfibroblasten. Trotz der klinischen Bedeutung der Narbenbildung und der gestörten Wundheilung ist unser Verständnis der Faszienfibroblastendynamik in der Wundheilung aufgrund des Fehlens relevanter Assays, die eine direkte Visualisierung der Fibroblastenchoreografie und -dynamik in komplexen Umgebungen wie in Hautwunden ermöglichen, oberflächlich. Dieses Papier stellt ein Protokoll zur Erzeugung von Ex-situ-Hautnarben mit SCAD oder "SCar-ähnlichem Gewebe in A Dish" vor, die die komplexe Umgebung von Hautwunden nachahmen. Bei diesem Assay wird 2 mm dicke Haut 5 Tage lang in Medien ausgeschnitten und auf den Kopf gestellt, wobei sich Narben und Hautkontrakturen gleichmäßig entwickeln. Diese Methodik, gepaart mit fibroblastenlinienspezifischen transgenen Mausmodellen, ermöglicht die Visualisierung einzelner Fibroblastenlinien über den gesamten Wundreparaturprozess hinweg. Insgesamt hilft dieses Protokoll den Forschern, grundlegende Prozesse und Mechanismen der Wundreparatur zu verstehen und die Auswirkungen von Modulatoren auf die Wundheilungsergebnisse direkt zu untersuchen.

Einleitung

Wundheilung ist ein Prozess der Wiederherstellung von gebrochenen Wunden. Gewebeverletzungen bei Wirbellosen führen zu einer teilweisen oder vollständigen Regeneration. Im Gegensatz dazu reagieren Säugetiere auf tiefe Verletzungen durch Narbenbildung, ein Prozess, der darauf zugeschnitten ist, Wunden schnell mit dichten Pfropfen aus Matrixfasern zu versiegeln, die den durchbrochenen Bereich minimieren und gleichzeitig die verletzte Stelle dauerhaft verformen ^1,2,3. Große Hautverbrennungen oder tiefe offene Wunden bei Säugetieren führen zu pathologischen Phänotypen wie hypertrophen oder keloiden Narben ^4,5. Diese überschwänglichen Narben verursachen eine enorme Belastung für die klinischen und globalen Gesundheitssysteme. Allein in den USA kostet das Narbenmanagement jährlich^etwa 10 Milliarden US-Dollar ^6,7. Daher ist die Entwicklung relevanter Methoden erforderlich, um die grundlegenden Prozesse und Mechanismen, die an der Narbenbildung beteiligt sind, besser zu verstehen.

In den letzten Jahren hat eine breite Palette von Studien an Mäusen heterogene Fibroblastenpopulationen mit unterschiedlichen funktionellen Potenzen basierend auf ihrer Herkunft an bestimmten Hautstellen^{gezeigt 8,9,10}. In der Rückenhaut identifizierten Rinkevich et al., 2015, dass eine spezifische Fibroblastenpopulation mit einer frühen embryonalen Expression von Engrailed-1 (En1), genannt EPF (Engrailed positive Fibroblast), zur kutanen Narbenbildung bei der Wunde beiträgt. Umgekehrt trägt eine andere Fibroblastenlinie ohne Geschichte der engrailed expression, Engrailed negative fibroblast (ENF), nicht zur Narbenbildung^{bei 8}. Die Schicksalskartierung dieser En1-Linien unter Verwendung von Cre-gesteuerten transgenen Mauslinien, die zu Fluoreszenzreporter-Mauslinien wie R26^mTmG (En1Cre x R26^mTmG) gekreuzt wurden, ermöglicht die Visualisierung von EPF- und ENF-Populationen.

Die Untersuchung der Fibroblastenmigration in vivo über mehrere Tage ist durch ethische und technische Einschränkungen begrenzt. Darüber hinaus sind zusammengesetzte, virale und neutralisierende Antikörperbibliotheks-Screens zur Modulation von Signalwegen, die an der Narbenbildung beteiligt sind, technisch eine Herausforderung. Zuvor verwendete In-vitro- oder Ex-vivo-Modelle sind nicht in der Lage, die Migration von Fibroblasten und die Narbenbildung in echten Hautmikroumgebungen, die Gleichmäßigkeit der Narbenentwicklung sowie die Gewebekomplexität, die in vivo-Hautumgebungen emuliert, zu visualisieren ^11,12. Um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden, haben wir einen Ex-vivo-Narbenuntersuchungsassay namens SCAD (SCar-like tissue in A Dish)^13,14 entwickelt. Dieser einfache Assay kann durchgeführt werden, indem 2 mm dicke Haut, die die Epidermis, die Dermis und die subkutanen Faszienregionen enthält, entfernt und in serumergänzten DMSO-Medien für bis zu 5 Tage kultiviert werden. Narben, die durch SCAD erzeugt werden, replizieren zuverlässig transkriptomische und proteomische Merkmale von In-vivo-Narben. Darüber hinaus ermöglichen SCADs, die aus relevanten transgenen Mauslinien (z. B. En1-Mäusen) erzeugt werden, die mit fluoreszierenden Reporter-Mauslinien gekreuzt sind, die Visualisierung der Migrationsdynamik und Narbenentwicklung von Fibroblasten mit einer beispiellosen Auflösung. Darüber hinaus kann dieses Modell leicht an alle Anwendungen mit hohem Durchsatz angepasst werden (z. B. Substanzbibliothek, Antikörperbibliothek oder virales Screening)^13,14. In diesem Artikel beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur Generierung von SCADs und nachgelagerten Verarbeitungsanwendungen zur Untersuchung der Zell- und Matrixdynamik bei der Narbenentwicklung.

Protokoll

Das unten vorgestellte Modell bietet eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Beschreibung der Generierung des SCAD-Assays, wie in Jiang et al., 2020¹³, kurz beschrieben. SCAD-Probenvorbereitungen wurden nach der Opferung der Tiere gemäß den internationalen und der Regierung von Oberbayern durchgeführt. Tiere wurden in der Tieranlage des Helmholtz-Zentrums München untergebracht. Die Räume wurden mit optimaler Luftfeuchtigkeit und konstanter Temperatur mit einem Lichtzyklus von 12 h gepflegt. Die Tiere wurden ad libitum mit Futter und Wasser versorgt.

1. SCAD-Gewebepräparation

1. Opfern Sie neugeborene Welpen ampostnatalen Tag 0 oder Tag 1 (P0 oder P1).
2. Entfernen Sie vorsichtig mindestens 1,5 cm x 1,5 cm dicke dorsale Rückenhaut bis zur Skelettmuskelschicht mit einem sterilen chirurgischen Skalpell.
3. Schälen Sie die Haut mit sterilen gekrümmten Pinzetten und stellen Sie sicher, dass die oberflächliche Faszie mit dem darunter liegenden Musculus panniculus carnosus intakt ist.
4. Waschen Sie das ausgeschnittene Gewebe mit 50-100 ml kalten DMEM/F-12-Medien, um kontaminierendes Blut zu entfernen.
5. Einmal mit Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) waschen, um die Lebensfähigkeit von Gewebe und Zellen zu erhalten.
6. Die Haut kopfüber (oberflächliche Faszie oben) in eine 10 cm große Petrischale mit DMEM/F12-Medien geben.
7. Schneiden Sie mit einem Einweg-2-mm-Biopsiestempel runde Hautstücke in voller Dicke aus, um sicherzustellen, dass die oberflächliche Faszie mit dem darunter liegenden Musculus panniculus carnosus bis zur Epidermis intakt ist, um SCAD-Gewebe zu erzeugen.
8. Bereiten Sie 200 μL DMEM/F12 (ohne Phenolrot) komplette Medien-DMEM/F12-Medien vor und füllen Sie sie mit 10% FBS, 1x GlutaMAX, 1x MEM nicht-essentiellen Aminosäuren und 1x Penicillin/Streptomycin in einzelne Vertiefungen einer 96-Well-Platte.
9. Verwenden Sie sterile Pinzetten, übertragen und tauchen Sie vorsichtig einzelnes SCAD-Gewebe kopfüber (Faszie nach oben) in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte.
10. Überführung der Platte in einen Zellkulturinkubator, der unter Standardbedingungen (37 °C, 21 %(v/v) Sauerstoff, 5 % (v/v) C0₂ und 95 % Luftfeuchtigkeit) gewartet wird.

2. SCAD - Gewebekultur

1. Kultur-SCADs in einem Inkubator für bis zu 5 Tage.
2. Ersetzen Sie an Tag 2 und Tag 4 der Kultur die Medien durch 200 μl frische, vorgewärmte DMEM/F12-Vollmedien, um die Lebensfähigkeit von Zellen und Geweben weiterhin zu gewährleisten. Ersetzen Sie die Behandlungsverbindungen bei jedem Medienwechsel.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie 10 μL Medien im Brunnen belassen, um zu vermeiden, dass Gewebe an den Vertiefungen haftet.
3. Bereiten Sie SCADs für die folgenden Experimente vor: Lebendbildgebung (Abschnitt 3) und Gewebeentnahme und 2D/3D-Immunfluoreszenzfärbung (Abschnitt 4).

3. Live-Imaging von SCADs

1. Bereiten Sie mindestens 30 ml 2%-3% (w/v) niedrig schmelzende Agaroselösung in PBS in einer Glasflasche vor, indem Sie sie in einer Mikrowelle bis zum Kochen erhitzen.
2. Sofort die Flasche umfüllen und die flüssige Agaroselösung in einem 40 °C warmen Wasserbad abkühlen.
3. Übertragen Sie das SCAD-Gewebe mit Faszien / Narben nach oben auf die Mitte einer 35-mm-Schale.
4. Betten Sie das SCAD bei Raumtemperatur (RT) ein, indem Sie mit einer Pasteur-Pipette langsam 40 °C flüssige Agarose auf die 35-mm-Schale übertragen. Agarose polymerisiert innerhalb von 2 min.
5. Fügen Sie 2 ml vorgewärmtes DMEM/F12-Komplettmedium hinzu (ohne Phenolrot-Indikator).
6. Erfassen Sie Zeitrafferbilder von Tag 0 SCADs bis zu 48 h mit einem konfokalen oder einem Multiphotonenmikroskop, das mit einem geeigneten Inkubationssystem ausgestattet ist, das auf 37 °C, 21% (v/v) Sauerstoff, 5% (v/v) C0₂ und 95% Luftfeuchtigkeit eingestellt ist.

4. Gewebeentnahme und 2D/3D-Immunfluoreszenzfärbung

1. Waschen Sie die Taschentücher zu relevanten Zeitpunkten, indem Sie die Medien durch steriles PBS ersetzen.
2. Übertragen Sie einzelne SCADS vorsichtig mit steriler Pinzette auf 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die 500 μL 2% Paraformaldehyd enthalten, um das Gewebe über Nacht bei 4 °C zu fixieren.
3. Waschen Sie die Taschentücher dreimal mit PBS und fahren Sie mit der 2D / 3D-Immunfluoreszenzfärbung fort.
4. 3D-Immunfluoreszenzfärbung
   1. Permeabilisieren Sie das Gewebe durch Inkubation in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 μL PBS, ergänzt mit 0,2% Gelatine, 0,5% Triton-X100 und 0,01% Thimerosal (PBSGT) bei RT für 24 h.
   2. Bereiten Sie eine ausreichende Menge an primären Antikörpern gemäß den Anweisungen des Herstellers vor und inkubieren Sie SCAD-Gewebe in 150 μL PBSGT-Lösung für 24 Stunden bei RT.
      HINWEIS: Wenn der Hersteller nicht die optimale Antikörperkonzentration für die Immunfluoreszenz angibt, muss eine vorherige Antikörpertitration an Kontrollgeweben mit unterschiedlichen Konzentrationen (z. B. 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000) durchgeführt werden.
   3. Waschen Sie die SCADs dreimal vorsichtig mit PBS, um den ungebundenen primären Antikörper zu entfernen.
   4. Inkubieren Sie Gewebe mit 1:1000 relevanten Alexa Fluor Sekundärantikörpern in PBS über Nacht bei RT.
   5. Waschen Sie das Gewebe 30 Minuten lang dreimal vorsichtig in PBS, um überschüssige ungebundene sekundäre Antikörper zu entfernen.
   6. Übertragen Sie das Gewebe auf eine 35 mm Glasbodenschale für konfokale oder Multiphotonen-Bildgebung.
      HINWEIS: Wenn Sie Wassertauchobjektive verwenden, betten Sie die SCADs in 2 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt ein, um das Gewebe zu immobilisieren und ein Abdriften während der Bildaufnahme zu verhindern.
5. 2D-Immunfluoreszenzfärbung
   1. Überführen Sie das Gewebe in eine Kryoform und füllen Sie es vorsichtig mit einer optimalen Schnitttemperaturverbindung (OCT), um das Gewebe vollständig einzutauchen.
   2. Stellen Sie die Ausrichtung des Gewebes vorsichtig ein und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind, um einen Querschnitt oder einen vertikalen Schnitt zu erhalten.
   3. Legen Sie die Form für 20-30 min auf Trockeneis und inkubieren Sie den Block bei -80 °C über Nacht.
   4. Stellen Sie die Blatttemperatur auf -25 °C und die Probenblocktemperatur auf -17 °C ein. Bereiten Sie den 6-μm-Kryoschnitt mit einem Kryostaten vor, geben Sie die Abschnitte auf einen Haftobjektträger und lagern Sie die Objektträger in einem Gefrierschrank von -20 °C.
   5. Spülen Sie die Objektträger dreimal in PBS und inkubieren Sie die Objektträger in 5% Rinderserumalbumin (BSA) w/v in PBST (PBS ergänzt mit 0,05% Tween) für 1 h.
   6. Eine geeignete Menge primärer Antikörper zu 150 μl PGST geben und über Nacht bei 4 °C inkubieren
      HINWEIS: Wenn der Hersteller nicht die optimale Antikörperkonzentration für die Immunfluoreszenz angibt, muss eine vorherige Antikörpertitration an Kontrollabschnitten mit unterschiedlichen Konzentrationen (z. B. 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000) durchgeführt werden.
   7. Waschen Sie die Abschnitte dreimal vorsichtig mit PBS, um den ungebundenen primären Antikörper zu entfernen.
   8. Inkubieren Sie Gewebe mit 1:1000 relevanten Alexa Fluor Sekundärantikörpern in PBS über Nacht bei RT für 2 h.
   9. Waschen Sie das Gewebe vorsichtig für 5 Minuten in PBS dreimal, um überschüssige ungebundene sekundäre Antikörper zu entfernen.
   10. Montieren Sie die Dias mit einem DAPI-haltigen Montagemedium und trocknen Sie die Dias im Dunkeln bei RT.
   11. Bilden Sie die Schnitte mit einem Fluoreszenzmikroskop ab.

Ergebnisse

Die Generierung von SCADs kann in drei wesentliche Schritte unterteilt werden: Ernte der Rückenhaut von P0-P1-Mäusen, Erzeugung von Biopsiestempeln in voller Dicke und anschließende Kultur einzelner Scads bis zu 5 Tage in 96-Well-Platten. Als Auslesung kann dieser Assay weiter angewendet werden, um die räumlichen und zeitlichen Aspekte der Narbenbildung zu analysieren. Die räumliche Analyse verwendet 2D- und 3D-Immunmarkierung von Geweben, um die räumliche Lokalisation von Zell- und Matrixkomponenten innerhalb des ...

Diskussion

Mehrere Modelle wurden bereits entwickelt, um die Narbenbildung nach Verletzungen zu verstehen. Während in dieser Hinsicht viele Fortschritte erzielt wurden, sind die tatsächlichen Mechanismen noch nicht klar. Im Gegensatz zur bisherigen Technik bezieht das SCAD-Modell alle Zelltypen und Hautschichten mit ein, wodurch die Komplexität der nativen Haut^18,19 erhalten bleibt. Diese Methodik ist in der Lage, grundlegende Datensätze zu generieren, die für das Vers...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Tween 20, Nonionic Detergent	Biorad Laboratories	1610781
Bovine serum albumin, Cold ethanol fract	Sigma	A4503-50G
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL	LIFE Technologies	11039021
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190169
Epredia Cryostar NX70 Cryostat	Thermo Scientific
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides	Fisher scientific	J1800AMNZ	Adhesion slides
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL	LIFE Technologies	10500064
Fluoromount-G with DAPI	Life Technologies	00 4959 52	Mounting medium with DAPI
Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length	Fisher Scientific	12381369
Gelatin from porcine skin	Sigma	G2500-100G
GlutaMAX Supplement-100 mL	LIFE Technologies	35050038
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL	LIFE Technologies	14025092
Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2	Ibidi	11922
Ibidi Heating system	Ibidi	10915
Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680–1300 nm	Leica		Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single)
Non Essential Amino Acids	LIFE Technologies	11140035
NuSieve GTG Agarose ,25 g	Biozym /Lonza	859081
OCT Embedding Matrix	Carlroth	6478.1
Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL	VWR International	43368.9M
Pen-Strep	Gibco	15140122
Stiefel Biopsy-Punch 2 mm	Stiefel	270130
Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm	Fisher Scientific	15654444
Thimerosal Bioxtra, 97%–101%	Sigma-Aldrich	T8784-1G
Zeiss Axioimager M2 upright microscope	Zeiss