Visualizando o desenvolvimento da cicatriz usando o ensaio SCAD - Um ensaio de cicatrização de pele ex-situ

Resumo

Este protocolo descreve a geração de uma explanta de fáscia de pele chamada "SCar like tissue in A Dish" ou SCAD. Este modelo permite uma visualização sem precedentes de fibroblastos únicos durante a formação da cicatriz.

Resumo

A resposta global dos mamíferos à vedação de feridas profundas de tecido é através da formação de cicatrizes e contração tecidual, mediada por fibroblastos especializados de fáscia. Apesar da significância clínica da formação da cicatriz e da cicatrização prejudicada da ferida, nossa compreensão da dinâmica do fibroblasto de fáscia na cicatrização das feridas é superficial devido à falta de ensaios relevantes que possibilitem a visualização direta da coreografia e dinâmica do fibroblasto em ambientes complexos, como nas feridas da pele. Este artigo apresenta um protocolo para gerar cicatrizes de pele ex-situ usando SCAD ou "Tecido semelhante a SCar em Um Prato" que emulam o ambiente complexo de feridas cutâneas. Neste ensaio, a pele de 2 mm de espessura total é extirpada e cultivada de cabeça para baixo na mídia por 5 dias, durante os quais cicatrizes e contraturas de pele se desenvolvem uniformemente. Essa metodologia, aliada aos modelos específicos de camundongos transgênicos da linhagem do fibroblasto, permite a visualização de linhagens individuais de fibroblasto em todo o processo de reparação da ferida. No geral, esse protocolo auxilia os pesquisadores na compreensão de processos fundamentais e mecanismos de reparação de feridas, explorando diretamente os efeitos dos moduladores nos desfechos de cicatrização de feridas.

Introdução

A cicatrização de feridas é um processo de restauração de feridas violadas. Lesões teciduais em invertebrados resultam em regeneração parcial ou completa. Em contraste, os mamíferos respondem a ferimentos profundos por cicatrizes, um processo adaptado para selar rapidamente feridas com densas fibras matriciais que minimizam a área rompida e, ao mesmo tempo, deformam permanentemente o local^{ferido 1,2,3}. Queimaduras de pele grandes ou feridas profundas abertas em mamíferos resultam em fenótipos patológicos, como cicatrizes hipertróficas ou queloides ^4,5. Essas cicatrizes exuberantes causam um enorme fardo nos sistemas de saúde clínicos e globais. Só nos EUA, a gestão de cicatrizes custa cerca de US$ 10 bilhões por ano ^6,7. Portanto, o desenvolvimento de metodologias relevantes é necessário para entender melhor os processos e mecanismos de fundemental envolvidos na formação de cicatrizes.

Nos últimos anos, uma ampla gama de estudos em camundongos revelou populações fibroblastos heterogêneas com potências funcionais distintas com base em suas origens em certos locais de pele ^8,9,10. Na pele traseira, Rinkevich et al., 2015, identificaram que uma população específica de fibroblasto com uma expressão embrionária precoce de Engrailed-1 (En1), denominada EPF (Engrailed positive fibroblast) contribui para cicatrizes cutâneas ao ferir. Por outro lado, outra linhagem fibroblasto sem histórico de expressão engrida, o fibroblasto negativo Engrailed (ENF), não contribui para a formação da cicatriz⁸. O mapeamento do destino dessas linhagens En1 usando linhas de mouse transgênicas orientadas por Cre cruzadas para linhas de mouse repórter fluorescência, como R26^mTmG (En1Cre x R26^mTmG) permite a visualização de populações de EPF e ENF.

Estudar a migração do fibroblasto in vivo ao longo de vários dias é limitado por restrições éticas e técnicas. Além disso, telas de biblioteca de anticorpos compostos, virais e neutralizantes para modular caminhos envolvidos em cicatrizes é tecnicamente desafiador. Modelos in vitro ou ex vivo anteriormente utilizados não têm a capacidade de visualizar a migração de fibroblastos e a formação de cicatrizes em microambientes genuínos da pele, uniformidade no desenvolvimento de cicatrizes, bem como complexidade tecidual que emula ambientes de pele in vivo ^11,12. Para superar as limitações acima, desenvolvemos um ensaio de cicatrização ex vivo denominado SCAD (tecido semelhante a SCar em Um Prato)^13,14. Este ensaio simples pode ser realizado excisando a pele de 2 mm de espessura total contendo a epiderme, a derme e as regiões de fáscia subcutânea e culturando-as em mídia DMSO suplementada por soro por até 5 dias. Cicatrizes geradas a partir de SCAD replicam de forma confiável marcas transcriômicas e proteômicas de cicatrizes in vivo. Além disso, SCADs gerados a partir de linhas de camundongos transgênicos relevantes (por exemplo, ratos En1) cruzadas com linhas de mouse repórter fluorescente permitem a visualização da dinâmica de migração do fibroblasto e desenvolvimento de cicatrizes em uma resolução sem precedentes. Além disso, este modelo pode ser facilmente adaptado para quaisquer aplicações de alto rendimento (por exemplo, biblioteca composta, biblioteca de anticorpos ou triagem viral)^13,14. Neste artigo, descrevemos um protocolo otimizado para gerar SCADs e subsequentes aplicações de processamento a jusante para estudar a dinâmica celular e matricial no desenvolvimento de cicatrizes.

Protocolo

O modelo apresentado abaixo fornece uma descrição detalhada passo a passo da geração de ensaio SCAD, conforme descrito brevemente em Jiang et al., 2020¹³. Os preparativos da amostra SCAD foram realizados após o sacrifício dos animais, de acordo com as diretrizes internacionais e do Governo da Alta Baviera. Os animais estavam alojados na instalação de animais do Centro Helmholtz de Munique. Os quartos foram mantidos com umidade ideal e temperatura constante com ciclo de luz de 12 horas. Os animais eram abastecidos com comida e água ad libitum.

1. Preparação do tecido SCAD

1. Sacrificar filhotes recém-nascidos no dia 0 ou dia 1 (P0 ou P1).
2. Extite cuidadosamente pelo menos 1,5 cm x 1,5 cm de espessura total dorsal da pele dorsal até a camada muscular esquelética usando um bisturi cirúrgico estéril.
3. Descasque a pele usando fórceps curvados estéreis, garantindo que a fáscia superficial esteja intacta com o músculo carnosus panniculus subjacente.
4. Lave o tecido excisado com 50-100 mL de mídia DMEM/F-12 fria para remover sangue contaminante.
5. Lave uma vez com a Solução de Sal Balanceado (HBSS) da Hanks para manter a viabilidade do tecido e celular.
6. Coloque a pele de cabeça para baixo (fáscia superficial por cima) em uma placa de Petri de 10 cm contendo mídia DMEM/F12.
7. Usando um soco de biópsia descartável de 2 mm, extirpar pedaços redondos de pele de espessura total, garantindo que a fáscia superficial esteja intacta com o músculo carnosus panniculus subjacente até que a epiderme gere tecidos SCAD.
8. Prepare e encha 200 μL de DMEM/F12 (sem vermelho fenol) mídia completa media-DMEM/F12 complementada com 10% de FBS, 1x GlutaMAX, 1x aminoácidos não essenciais mem e 1x Penicillin/estreptomicina em poços individuais de uma placa de 96 poços.
9. Usando fórceps estéreis, transfira cuidadosamente e submerga totalmente o tecido SCAD individual de cabeça para baixo (fáscia voltada para cima) para os poços de uma placa de 96 poços.
10. Transfira a placa para uma incubadora de cultura celular mantida em condições padrão (37 °C, 21%(v/v) oxigênio, 5% (v/v) C0₂ e 95% de umidade).

2. SCAD - Cultura tecidual

1. SCADs de cultura em uma incubadora por até 5 dias.
2. No dia 2 e no 4º dia da cultura, substitua a mídia por 200μl de mídia completa DMEM/F12 pré-aquecida para garantir condições contínuas de viabilidade celular e tecido. Substitua os compostos de tratamento durante cada alteração de mídia.
   NOTA: Certifique-se de deixar 10 μL de mídia no poço para evitar que os tecidos grudem nos poços.
3. Prepare SCADs para os seguintes experimentos: Imagem ao vivo (seção 3) e Colheita de Tecidos e Coloração de imunofluorescência 2D/3D (seção 4).

3. Imagem ao vivo de SCADs

1. Prepare um mínimo de 30 mL de 2%-3% (w/v) solução de agarose de baixo derretimento em PBS em uma garrafa de vidro aquecendo-a em um micro-ondas até ferver.
2. Transfira imediatamente a garrafa e esfrie a solução de agarose líquida em um banho de água de 40 °C.
3. Transfira o tecido SCAD com fáscia/cicatriz voltada para o centro de uma antena de 35 mm.
4. Incorpore o SCAD à temperatura ambiente (RT) transferindo lentamente 40 °C líquido surgido no prato de 35 mm usando uma pipeta Pasteur. Agarose polimeriza dentro de 2 minutos.
5. Adicione 2 mL de mídia completa DMEM/F12 pré-aquecida (sem indicador vermelho fenol).
6. Adquira imagens de lapso de tempo do dia 0 SCADs até 48 h usando um microscópio confocal ou multifotônio equipado com um sistema de incubação adequado definido para 37 °C, 21% (v/v) oxigênio, 5% (v/v) C0₂ e 95% de umidade.

4. Colheita de tecidos e coloração de imunofluorescência 2D/3D

1. Lave os tecidos em pontos de tempo relevantes, substituindo a mídia por PBS estéril.
2. Usando fórceps estéreis, transfira cuidadosamente os SCADs individuais para tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL contendo 500 μL de 2% de paraformaldeído para fixar os tecidos durante a noite a 4 °C.
3. Lave os tecidos três vezes com PBS e prossiga com a coloração de imunofluorescência 2D/3D.
4. Coloração de imunofluorescência 3D
   1. Permeabilize os tecidos incubando em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 500 μL de PBS complementado com 0,2% de gelatina, 0,5% Triton-X100 e 0,01% Thimerosal (PBSGT) na RT por 24 h.
   2. Prepare uma quantidade adequada de anticorpos primários de acordo com as instruções do fabricante e incuba os tecidos SCAD em 150 μL de solução PBSGT para 24 h na RT.
      NOTA: Se a concentração ideal de anticorpos para fluorescência imunológica não for relatada pelo fabricante, a titulação prévia de anticorpos precisa ser realizada em tecidos de controle usando concentrações variadas (por exemplo, 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000).
   3. Lave suavemente os SCADs três vezes com PBS para remover o anticorpo primário não ligado.
   4. Incubar tecido com anticorpos secundários Alexa Fluor relevantes em PBS durante a noite na RT.
   5. Lave suavemente o tecido por 30 minutos em PBS três vezes para remover o excesso de anticorpos secundários não ligados.
   6. Transfira o tecido para um prato de fundo de vidro de 35 mm para imagens confocal ou multifoton.
      NOTA: Ao usar os objetivos de imersão em água, incorpore os SCADs em 2 % ponto de fusão baixo para imobilizar o tecido para evitar a deriva durante a aquisição de imagem
5. Coloração de imunofluorescência 2D
   1. Transfira o tecido para um crio-mofo e preencha suavemente com o composto de temperatura de corte ideal (OCT) para imergir completamente o tecido.
   2. Ajuste suavemente a orientação do tecido, garantindo a ausência de bolhas de ar para obter uma seção transversal ou uma seção vertical.
   3. Coloque o molde em gelo seco por 20-30 min e incubar o bloco a -80 °C durante a noite.
   4. Coloque a temperatura da lâmina em -25 °C e bloqueie a temperatura do bloco de -17 °C. Prepare a crio-seção de 6 μm usando um criostat, transfira as seções para um slide de adesão e armazene os slides no congelador de -20 °C.
   5. Enxágüe os slides três vezes em PBS e incuba os slides em 5% De Colmina de Soro Bovino (BSA) c/v em PBST (PBS complementado com 0,05% Tween) por 1 h.
   6. Adicione uma quantidade apropriada de anticorpo primário a 150μl PGST e incubar durante a noite a 4 °C
      NOTA: Se a concentração ideal de anticorpos para fluorescência imunológica não for relatada pelo fabricante, a titulação prévia de anticorpos precisa ser realizada em seções de controle usando concentrações variadas (por exemplo, 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000).
   7. Lave suavemente as seções três vezes com PBS para remover o anticorpo primário não ligado.
   8. Incubar tecido com 1:1000 anticorpos secundários Alexa Fluor relevantes na PBS durante a noite na RT por 2h.
   9. Lave suavemente o tecido por 5 minutos em PBS três vezes para remover o excesso de anticorpos secundários não ligados.
   10. Monte os slides com um meio de montagem contendo DAPI e seque as lâminas no escuro em RT.
   11. Imagem as seções usando um microscópio de fluorescência.

Resultados

A geração de SCADs pode ser separada em três etapas essenciais: a colheita da pele de volta de camundongos P0-P1, gerando socos de biópsia de espessura total, e cultura subsequente de scads individuais até 5 dias em placas de 96 poços. Como leitura, este ensaio pode ser aplicado ainda para analisar os aspectos espaciais e temporais das cicatrizes. A análise espacial utiliza rotulagem imune 2D e 3D de tecidos para estudar a localização espacial de componentes celulares e maticiais dentro do tecido cicatricial em ...

Discussão

Vários modelos já foram desenvolvidos para entender a formação da cicatriz após lesão. Embora muitos avanços tenham sido apresentados a este respeito, mas, os mecanismos reais ainda não estão claros. Em contraste com a técnica anterior, o modelo SCAD incorpora todos os tipos de células e camadas cutâneas, mantendo assim a complexidade da pele nativa ^18,19. Essa metodologia é capaz de gerar conjuntos de dados fundamentais que são importantes na compr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Tween 20, Nonionic Detergent	Biorad Laboratories	1610781
Bovine serum albumin, Cold ethanol fract	Sigma	A4503-50G
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL	LIFE Technologies	11039021
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190169
Epredia Cryostar NX70 Cryostat	Thermo Scientific
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides	Fisher scientific	J1800AMNZ	Adhesion slides
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL	LIFE Technologies	10500064
Fluoromount-G with DAPI	Life Technologies	00 4959 52	Mounting medium with DAPI
Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length	Fisher Scientific	12381369
Gelatin from porcine skin	Sigma	G2500-100G
GlutaMAX Supplement-100 mL	LIFE Technologies	35050038
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL	LIFE Technologies	14025092
Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2	Ibidi	11922
Ibidi Heating system	Ibidi	10915
Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680–1300 nm	Leica		Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single)
Non Essential Amino Acids	LIFE Technologies	11140035
NuSieve GTG Agarose ,25 g	Biozym /Lonza	859081
OCT Embedding Matrix	Carlroth	6478.1
Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL	VWR International	43368.9M
Pen-Strep	Gibco	15140122
Stiefel Biopsy-Punch 2 mm	Stiefel	270130
Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm	Fisher Scientific	15654444
Thimerosal Bioxtra, 97%–101%	Sigma-Aldrich	T8784-1G
Zeiss Axioimager M2 upright microscope	Zeiss