Visualización del desarrollo de cicatrices mediante el ensayo SCAD: un ensayo de cicatrización cutánea ex situ

Resumen

Este protocolo describe la generación de un explante de piel-fascia denominado "tejido similar a SCar en un plato" o SCAD. Este modelo permite una visualización sin precedentes de fibroblastos individuales durante la formación de cicatrices.

Resumen

La respuesta global de los mamíferos al sellado de heridas de tejido profundo es a través de la formación de cicatrices y la contracción del tejido, mediada por fibroblastos especializados en la fascia. A pesar de la importancia clínica de la formación de cicatrices y la cicatrización deficiente de heridas, nuestra comprensión de la dinámica de los fibroblastos de la fascia en la cicatrización de heridas es superficial debido a la falta de ensayos relevantes que permitan la visualización directa de la coreografía y la dinámica de los fibroblastos en entornos complejos, como en heridas cutáneas. Este artículo presenta un protocolo para generar cicatrices cutáneas ex situ utilizando SCAD o "tejido similar a SCar en un plato" que emulan el complejo entorno de las heridas cutáneas. En este ensayo, la piel de 2 mm de espesor completo se extirpa y se cultiva boca abajo en medios durante 5 días, durante los cuales las cicatrices y las contracturas de la piel se desarrollan de manera uniforme. Esta metodología, junto con modelos de ratón transgénico específicos del linaje de fibroblastos, permite la visualización de linajes de fibroblastos individuales en todo el proceso de reparación de heridas. En general, este protocolo ayuda a los investigadores a comprender los procesos y mecanismos fundamentales de reparación de heridas, explorando directamente los efectos de los moduladores en los resultados de curación de heridas.

Introducción

La cicatrización de heridas es un proceso de restauración de heridas rotas. Las lesiones tisulares en invertebrados resultan en una regeneración parcial o completa. Por el contrario, los mamíferos responden a las lesiones profundas mediante cicatrices, un proceso diseñado para sellar rápidamente las heridas con densos tapones de fibras de matriz que minimizan el área quebrantada y al mismo tiempo deforman permanentemente el sitio lesionado ^1,2,3. Las grandes quemaduras en la piel o las heridas abiertas profundas en los mamíferos dan lugar a fenotipos patológicos como cicatrices hipertróficas o queloides ^4,5. Estas cicatrices exuberantes causan una tremenda carga en los sistemas de salud clínicos y globales. Solo en los Estados Unidos, el manejo de cicatrices cuesta alrededor de $ 10 mil millones anuales ^6,7. Por lo tanto, se requiere el desarrollo de metodologías relevantes para comprender mejor los procesos y mecanismos fundementales involucrados en la formación de cicatrices.

En los últimos años, una amplia gama de estudios en ratones ha revelado poblaciones heterogéneas de fibroblastos con distintas potencias funcionales basadas en sus orígenes en ciertas ubicaciones de la piel ^8,9,10. En la piel posterior, Rinkevich et al., 2015, identificaron que una población específica de fibroblastos con una expresión embrionaria temprana de Engrailed-1 (En1), denominada EPF (Fibroblasto Positivo Engrailed) contribuye a la cicatrización cutánea al enrollarse. Por el contrario, otro linaje de fibroblastos sin antecedentes de expresión engrailed, el fibroblasto negativo engrailed (ENF), no contribuye a la formación de cicatrices⁸. El mapeo del destino de estos linajes En1 utilizando líneas de ratones transgénicos impulsadas por Cre cruzadas a líneas de ratón reporteros de fluorescencia como R26^mTmG (En1Cre x R26^mTmG) permite la visualización de poblaciones de EPF y ENF.

El estudio de la migración de fibroblastos in vivo durante varios días está limitado por restricciones éticas y técnicas. Además, las pantallas de biblioteca de anticuerpos compuestos, virales y neutralizantes para modular las vías involucradas en la cicatrización son técnicamente desafiantes. Los modelos in vitro o ex vivo utilizados anteriormente carecen de la capacidad de visualizar la migración de fibroblastos y la formación de cicatrices en microambientes cutáneos genuinos, uniformidad en el desarrollo de cicatrices, así como complejidad tisular que emula entornos cutáneos in vivo ^11,12. Para superar las limitaciones anteriores, desarrollamos un ensayo de cicatrización ex vivo denominado SCAD (SCar-like tissue in A Dish)^13,14. Este ensayo simple se puede realizar extirpando la piel de 2 mm de espesor completo que contiene la epidermis, la dermis y las regiones de la fascia subcutánea y cultivándolas en medios DMSO suplementados con suero durante un máximo de 5 días. Las cicatrices generadas a partir de SCAD replican de manera confiable las características transcriptómicas y proteómicas de las cicatrices in vivo. Además, los SCAM generados a partir de líneas de ratones transgénicos relevantes (por ejemplo, ratones En1) cruzados con líneas de ratones reporteros fluorescentes permiten la visualización de la dinámica de migración de fibroblastos y el desarrollo de cicatrices a una resolución sin precedentes. Además, este modelo se puede adaptar fácilmente para cualquier aplicación de alto rendimiento (por ejemplo, biblioteca de compuestos, biblioteca de anticuerpos o cribado viral)^13,14. En este artículo, describimos un protocolo optimizado para generar SCADs y posteriores aplicaciones de procesamiento aguas abajo para estudiar la dinámica celular y matricial en el desarrollo de cicatrices.

Protocolo

El modelo que se presenta a continuación proporciona una descripción detallada paso a paso de la generación del ensayo SCAD como se describe brevemente en Jiang et al., 2020¹³. Las preparaciones de muestras de SCAD se realizaron después de sacrificar a los animales según las directrices internacionales y del Gobierno de Alta Baviera. Los animales fueron alojados en las instalaciones para animales del Centro Helmholtz de Múnich. Las habitaciones se mantuvieron con una humedad óptima y una temperatura constante con un ciclo de luz de 12 h. A los animales se les suministró comida y agua ad libitum.

1. Preparación del tejido SCAD

1. Sacrifica cachorros recién nacidos el día postnatal 0 o el día 1 (P0 o P1).
2. Extirpa cuidadosamente al menos 1,5 cm x 1,5 cm de la piel dorsal de espesor completo hasta la capa muscular esquelética con un bisturí quirúrgico estéril.
3. Pelar la piel con pinzas curvas estériles, asegurando que la fascia superficial esté intacta con el músculo panículo carnoso subyacente.
4. Lave el tejido extirpado con 50-100 ml de medios fríos DMEM/F-12 para eliminar la sangre contaminante.
5. Lave una vez con la Solución de Sal Equilibrada (HBSS) de Hanks para mantener la viabilidad de los tejidos y las células.
6. Coloque la piel boca abajo (fascia superficial en la parte superior) en una placa de Petri de 10 cm que contenga medios DMEM/F12.
7. Usando una punción de biopsia desechable de 2 mm, extirpe las piezas de piel redondas de espesor completo, asegurando que la fascia superficial esté intacta con el músculo panículo carnoso subyacente hasta la epidermis para generar tejidos SCAD.
8. Prepare y llene 200 μL de DMEM / F12 (sin rojo fenol) medios completos-DMEM / F12 suplementados con 10% FBS, 1x GlutaMAX, 1x aminoácidos no esenciales MEM y 1x Penicilina / estreptomicina en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos.
9. Usando fórceps estériles, transfiera cuidadosamente y sumerja completamente el tejido SCAD individual boca abajo (fascia hacia arriba) a los pocillos de una placa de 96 pocillos.
10. Transfiera la placa a una incubadora de cultivo celular mantenida en condiciones estándar (37 °C, 21% (v/v) de oxígeno, 5% (v/v) de C0₂ y 95% de humedad).

2. SCAD - Cultivo de tejidos

1. Cultive SCADs en una incubadora durante un máximo de 5 días.
2. En el día 2 y el día 4 de cultivo, reemplace el medio con 200 μl de medios completos DMEM / F12 frescos precalentados para garantizar condiciones de viabilidad celular y tisular continuas. Reemplace los compuestos de tratamiento durante cada cambio de medio.
   NOTA: Asegúrese de dejar 10 μL de medios en el pozo para evitar que los tejidos se peguen a los pozos.
3. Preparar los SCADs para los siguientes experimentos: Imágenes en vivo (sección 3) y Recolección de tejidos y tinción por inmunofluorescencia 2D/3D (sección 4).

3. Imágenes en vivo de SCADs

1. Prepare un mínimo de 30 ml de solución de agarosa de baja fusión al 2% -3% (p/v) en PBS en una botella de vidrio calentándola en un microondas hasta que hierva.
2. Transfiera inmediatamente la botella y enfríe la solución de agarosa líquida en un baño de agua a 40 °C.
3. Transfiera el tejido SCAD con fascia/cicatriz hacia arriba en el centro de un plato de 35 mm.
4. Incruste el SCAD a temperatura ambiente (RT) transfiriendo lentamente agarosa líquida a 40 °C en el plato de 35 mm con una pipeta Pasteur. La agarosa polimeriza en 2 min.
5. Añadir 2 ml de medios completos DMEM/F12 precalentados (sin indicador rojo fenol).
6. Adquiera imágenes de lapso de tiempo de SCADs del día 0 hasta 48 h utilizando un microscopio confocal o multifotón equipado con un sistema de incubación adecuado ajustado a 37 ° C, 21% (v / v) de oxígeno, 5% (v / v) C0₂ y 95% de humedad.

4. Recolección de tejidos y tinción de inmunofluorescencia 2D/3D

1. Lave los tejidos en los puntos de tiempo relevantes reemplazando el medio con PBS estéril.
2. Usando fórceps estériles, transfiera cuidadosamente los CAB individuales a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml que contengan 500 μL de paraformaldehído al 2% para fijar los tejidos durante la noche a 4 °C.
3. Lave los tejidos tres veces con PBS y proceda con la tinción de inmunofluorescencia 2D / 3D.
4. Tinción por inmunofluorescencia 3D
   1. Permeabilizar los tejidos incubando en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene 500 μL de PBS suplementado con gelatina al 0,2%, Tritón-X100 al 0,5% y timerosal al 0,01% (PBSGT) en RT durante 24 h.
   2. Prepare una cantidad adecuada de anticuerpos primarios según las instrucciones del fabricante e incube los tejidos SCAD en 150 μL de solución de PBSGT durante 24 h a RT.
      NOTA: Si el fabricante no informa la concentración óptima de anticuerpos para la fluorescencia inmune, la titulación previa de anticuerpos debe realizarse en los tejidos de control utilizando concentraciones variables (por ejemplo, 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000).
   3. Lave suavemente los SCAP tres veces con PBS para eliminar el anticuerpo primario no unido.
   4. Incubar tejido con 1:1000 anticuerpos secundarios relevantes de Alexa Fluor en PBS durante la noche en RT.
   5. Lave suavemente el tejido durante 30 minutos en PBS tres veces para eliminar el exceso de anticuerpos secundarios no unidos.
   6. Transfiera el tejido a un plato con fondo de vidrio de 35 mm para obtener imágenes confocales o multifotónicas.
      NOTA: Cuando utilice objetivos de inmersión en agua, incruste los SCAP en agarosa de bajo punto de fusión al 2 % para inmovilizar el tejido y evitar la deriva durante la adquisición de imágenes.
5. Tinción por inmunofluorescencia 2D
   1. Transfiera el tejido a un criomolde y llénelo suavemente con un compuesto de temperatura de corte óptima (OCT) para sumergir completamente el tejido.
   2. Ajuste suavemente la orientación del tejido, asegurando la ausencia de burbujas de aire para obtener una sección transversal o una sección vertical.
   3. Coloque el molde sobre hielo seco durante 20-30 minutos e incube el bloque a -80 °C durante la noche.
   4. Ajuste la temperatura de la cuchilla a -25 °C y la temperatura del bloque de muestras a -17 °C. Prepare la criosección de 6 μm con un criostato, transfiera las secciones a un portaobjetos de adhesión y guarde las diapositivas en un congelador de -20 °C.
   5. Enjuague las diapositivas tres veces en PBS e incube las diapositivas en albúmina sérica bovina (BSA) al 5% p/v en PBST (PBS suplementada con Tween al 0,05%) durante 1 h.
   6. Añadir una cantidad adecuada de anticuerpo primario a 150μl PGST, e incubar durante la noche a 4 °C
      NOTA: Si el fabricante no informa la concentración óptima de anticuerpos para la fluorescencia inmune, la titulación previa de anticuerpos debe realizarse en las secciones de control utilizando concentraciones variables (por ejemplo, 1:50, 1:200, 1:500, 1:1000).
   7. Lave suavemente las secciones tres veces con PBS para eliminar el anticuerpo primario no unido.
   8. Incubar tejido con 1:1000 anticuerpos secundarios relevantes de Alexa Fluor en PBS durante la noche en RT durante 2 h.
   9. Lave suavemente el tejido durante 5 minutos en PBS tres veces para eliminar el exceso de anticuerpos secundarios no unidos.
   10. Monte las diapositivas con un medio de montaje que contenga DAPI y seque las diapositivas en la oscuridad en RT.
   11. Tome imágenes de las secciones con un microscopio de fluorescencia.

Resultados

La generación de SCADs se puede separar en tres pasos esenciales: Recolección de piel de ratones P0-P1, generación de punzones de biopsia de espesor completo y posterior cultivo de scads individuales hasta 5 días en placas de 96 pocillos. Como lectura, este ensayo se puede aplicar para analizar los aspectos espaciales y temporales de la cicatrización. El análisis espacial utiliza el marcado inmune 2D y 3D de los tejidos para estudiar la localización espacial de los componentes celulares y matriciales dentro del te...

Discusión

Ya se han desarrollado varios modelos para comprender la formación de cicatrices después de una lesión. Si bien se han logrado muchos avances en este sentido, los mecanismos reales aún no están claros. A diferencia de la técnica anterior, el modelo SCAD incorpora todos los tipos celulares y capas cutáneas, manteniendo así la complejidad de la piel nativa^18,19. Esta metodología es capaz de generar conjuntos de datos fundamentales que son importantes para ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Tween 20, Nonionic Detergent	Biorad Laboratories	1610781
Bovine serum albumin, Cold ethanol fract	Sigma	A4503-50G
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red-500 mL	LIFE Technologies	11039021
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190169
Epredia Cryostar NX70 Cryostat	Thermo Scientific
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides	Fisher scientific	J1800AMNZ	Adhesion slides
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin-500 mL	LIFE Technologies	10500064
Fluoromount-G with DAPI	Life Technologies	00 4959 52	Mounting medium with DAPI
Forceps curved with fine points with guidepinstainless steel(tweezers)125 mm length	Fisher Scientific	12381369
Gelatin from porcine skin	Sigma	G2500-100G
GlutaMAX Supplement-100 mL	LIFE Technologies	35050038
HBSS, calcium, magnesium, no phenol red-500 mL	LIFE Technologies	14025092
Ibidi Gas incubation system for CO2 and O2	Ibidi	11922
Ibidi Heating system	Ibidi	10915
Leica SP8 upright microscope - Multiphoton excitation 680–1300 nm	Leica		Equipped with a 25x water-dipping objective (HC IRAPO L 25x/1.00 W) in combination with a tunable laser (Spectra-Physics, InSight DS + Single)
Non Essential Amino Acids	LIFE Technologies	11140035
NuSieve GTG Agarose ,25 g	Biozym /Lonza	859081
OCT Embedding Matrix	Carlroth	6478.1
Paraformaldehyde, 16% W/V AQ. 10 x10 mL	VWR International	43368.9M
Pen-Strep	Gibco	15140122
Stiefel Biopsy-Punch 2 mm	Stiefel	270130
Straight Sharp/Sharp Dissecting Scissors 11.4 cm	Fisher Scientific	15654444
Thimerosal Bioxtra, 97%–101%	Sigma-Aldrich	T8784-1G
Zeiss Axioimager M2 upright microscope	Zeiss