تقنيات التشريح وأخذ العينات النسيجية للقلب في النماذج الحيوانية الكبيرة لأمراض القلب والأوعية الدموية

Summary

نظرا للتشريح المعقد ، يمكن أن يكون من الصعب تنفيذ بروتوكول تشريح وحصاد قابل للتكرار باستمرار لعينات القلب. تعرض هذه المخطوطة العناصر الرئيسية لبعض بروتوكولات تشريح القلب القياسية، مع تسليط الضوء على كل من نهج الفحص الإجمالي ومواقع أخذ العينات المستخدمة عادة للفحص النسيجي المرضي.

Abstract

يعد الفحص الإجمالي القياسي وأخذ العينات عنصرين رئيسيين في إمكانية تكرار ونجاح الدراسات التجريبية لأمراض القلب والأوعية الدموية التي أجريت على الحيوانات الكبيرة. بالنظر إلى التشريح المعقد للقلب ، والاختلافات بين الأنواع ، وأنواع التفاعلات التعويضية والمرضية ، فإن البروتوكولات المتسقة يصعب تنفيذها. عادة ما يتم تكييف استخدام بروتوكولات التشريح المتعددة لتناسب تجربة القطاع الأولي ، ولا يزال التفضيل الشخصي مصدرا للتباين التجريبي وبين المراقبين. هنا ، الهدف هو تقديم السمات والمعالم التشريحية الرئيسية ، وبروتوكولات التشريح ، ومعايير أخذ العينات النسيجية للقلب في بعض الأنواع شائعة الاستخدام (بما في ذلك الكلاب والخنازير والمجترات والقطط) كنماذج لأمراض القلب والأوعية الدموية.

يتم عرض بروتوكولين قياسيين للفحص الإجمالي هنا. أولا ، طريقة التدفق الداخلي والخارجي ، والتي تتبع اتجاه تدفق الدم الفسيولوجي عبر القلب والأوعية الكبيرة (تستخدم بشكل متكرر في الكلاب والمجترات والخنازير) ، وثانيا ، تقنية التشريح المكونة من أربع غرف (تتمثل في القطط). يمكن تكييف كلتا التقنيتين مع أي نوع في ظروف تجريبية معينة. تشمل بروتوكولات أخذ العينات جميع مجالات الاهتمام (العقدة الجيبية الأذينية ، البطينين ، الحاجز بين البطينين ، الأذينين ، الصمامات ، والشريان الأورطي) ، وإذا تم تنفيذها بشكل صحيح ، فقم بتحسين كل من قابلية التكرار والموثوقية للدراسات التجريبية.

Introduction

نظرا للتشريح المعقد والصرامة المبكرة ، والتي يمكن أن تتداخل مع تقييم سمك جدار القلب ، فإن الفحص الإجمالي للقلب يمثل تحديا وعرضة للعديد من الأخطاء المتعلقة بالتقنية أو التفسير. يتم تضخيم ذلك من خلال الاختلافات المورفولوجية بين الأنواع وحقيقة أن العديد من أمراض القلب السريرية الرئيسية (بما في ذلك الحالات المبكرة من أمراض القلب التاجية والتليف والتهاب الشرايين والداء النشواني) لا ترتبط بأي تغييرات جسيمة ، كونها ، في جوهرها ، أمراض نسيجية. يمكن لبروتوكول التشريح الموحد وحصاد العينات النسيجية أن يحقق الاتساق بين المراقبين ، وفي الوقت نفسه ، قابلية المقارنة والتكرار للدراسات التجريبية لأمراض القلب والأوعية الدموية.

تم جمع العينات من كلبين (Canis lupus familiaris) (فرنسي يبلغ من العمر 3 سنوات ، ذكر البلدغ ، و 8 سنوات ، أنثى مختلطة السلالة) ، قطة (Felis catus) (ذكر قصير الشعر الأوروبي يبلغ من العمر 6 سنوات) ، خنزير محلي (Sus scrofa domesticus) (ذكر يبلغ من العمر 1 سنة ، ذكر أبيض كبير) ، وبقرة (Bos Taurus) (أنثى هولشتاين تبلغ من العمر 2 شهر). كل نوع من الأنواع المختارة له استخدام خاص كنموذج للقلب والأوعية الدموية لمرض مختلف. على سبيل المثال ، الكلاب هي نموذج مفضل لنمذجة عدم انتظام ضربات القلب. تفضل القطط لاعتلال عضلة القلب الضخامي (HCM) ، لأنها الأنواع ذات الانتشار الأعلى ل HCM ؛ تستخدم الخنازير كنموذج لاحتشاء عضلة القلب الحاد. وتستخدم المجترات كنموذج للتسمم بسبب تعرضها للسموم التي يمكن العثور عليها بسهولة في المروج¹¹.

في هذه المخطوطة ، يتم تقديم بروتوكول واحد للنخر وبروتوكولين تشريح القلب ، مصممين لتحسين الفحص الإجمالي والنسيجي للقلب في أمراض القلب والأوعية الدموية التجريبية. تم تطوير البروتوكولات الموصوفة بناء على معلومات من الكتب المدرسية البيطرية¹،²،⁴،⁵،⁶،⁷،⁸،⁹،10،11،12، وأدبيات المجلات³،^13،14، والوثائق الرسمية 15^، والندوات عبر الإنترنت ^{16 ، 17}. تم حصاد العينات المستخدمة في هذه الدراسة من الجثث المقدمة إلى قسم علم الأمراض في USAMV Cluj-Napoca لتشخيص تشريح الجثة الروتيني.

Protocol

حصل البروتوكول التجريبي على اتفاقية أخلاقيات بيولوجية (رقم 311 من عام 2022) وتمت الموافقة عليه من قبل لجنة أخلاقيات البيولوجيا بجامعة العلوم الزراعية والطب البيطري كلوج نابوكا ، وفقا لكل من التشريعات الوطنية (القانون رقم 43 لعام 2014) والأوروبية (توجيه الاتحاد الأوروبي رقم 63 من عام 2010). انظر جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع المواد والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. بروتوكول Necropsy

ملاحظة: يوصى باستخدام نفس بروتوكول النخر لجميع الأنواع المعروضة بسبب سهولة الوصول إليه عند تنفيذه ^2,12. تمثل الخطوات التالية النخر الذي يتم إجراؤه في متوسط الحجم. قم بتكييف الخطوات عند إجراء عمليات النخر على مواضيع مختلفة.

1. قم بوزن الموضوع ووضعه على طاولة الميتة على جانبه الأيسر (الشكل 1A). انتقل إلى الفحص الخارجي للموضوع (عن طريق فحص وملامسة القص والغشاء المخاطي ، مع ملاحظة جميع التغييرات في اللون والاتساق والحجم).
2. استخدم سكينا (أو مشرطا) وقم بعمل شق طوله 7 سم في الإبطين الأيمن (الشكل 1A).
3. حدد موقع التقاطع الكوكسوفالوري (الشكل 1A,B). افتح الكبسولة بسكين. قطع رباط رأس عظم الفخذ (الشكل 1B).
4. استخدم السكين لتمديد شق الجلد في الجمجمة الإبطية إلى التماثل الفك السفلي وإلى العجان (الشكل 1B).
5. إزالة الجلد باستخدام المشرط وتعريض جدار الصدر والبطن من خط الوسط البطني إلى مستوى العمليات العرضية الفقرية (الشكل 1B).
6. باستخدام المشرط والملقط ، قم بإنشاء رفرف من خلال جدار البطن ، البطني إلى القوس الساحلي الأيمن. افتح تجويف البطن بالمقص - اتبع الجانب الذيلي من المراقي الأيمن (الشكل 1B).
7. قم بتمديد الشق بشكل سببي على طول منطقة البارالومبار اليمنى حتى القمة الحرقفية الخارجية. بعد ذلك ، قم بتمديد الشق حتى إدخال العانة من linea alba.
8. باختصار ، افحص أعضاء البطن في الموقع (من خلال ملاحظة أي تغييرات في اللون والاتساق والحجم وموضع الأعضاء).
9. باستخدام المشرط والملقط ، قم بثقب الحجاب الحاجز عند أعلى نقطة (الشكل 1B).
10. أدخل التجويف الصدري عن طريق إزالة القفص الصدري الأيمن بقسمين طوليين باستخدام ملقط قطع العظام. قسم الجزء الغضروفي شبه القصي من الأضلاع. بعد ذلك ، قسم الجزء الظهري من الأضلاع ، بالقرب من المفاصل costovertebral (الشكل 1C).
11. فحص القلب في الموقع (الشكل 1C). لاحظ الحجم والموضع واللون والروابط مع الأنسجة المجاورة ، وعن طريق الجس ، أي تغييرات في الاتساق⁹.
    ملاحظة: في حالة وجود تخثر أو مرض خلقي في القلب ، يجب تشريح القلب في الموقع (يسمح هذا النهج بالفحص الكامل للأوعية الكبيرة).
12. استخدم المقص لفحص وفتح تجويف التامور بمقطع طولي من القاعدة إلى قمة القلب. افحص تجويف التامور و epicardium (مع ملاحظة أي تغييرات في اللون والاتساق والحجم)¹².
13. حرر القلب بمقص ، مما يؤدي إلى أقسام عرضية من الشريان الأورطي ، والجذع الرئوي ، وكل من الوريد الأجوف. قسم الوريد الأجوف العلوي على الأقل 1 سم فوق مدخل الأذين الأيمن للحفاظ على محطة كريستا هو^11,13.
14. فحص المحيط الخارجي للعضو ، وظهور epicardium ، وظهور عضلة القلب من خلال شفافية epicardium ، والمظهر الخارجي للأوعية الكبيرة (الشكل 2A).
    ملاحظة: بشكل عام ، يمثل فتح وفحص التامور بعض الاختلافات بين الأنواع. يبدأ فحص تجويف التامور بفحص وتقييم خارجي من خلال شفافية التامور للمحتوى الكلي للتامور ^1,2. في القط أو الكلب ، يحتوي التامور عادة على حوالي 0.25 مل / كجم من السائل الرقيق والشفاف والشفاف إلى الأصفر الفاتح⁹. إذا كان هناك أي انصباب مرضي ، فيجب جمعها باستخدام حقنة معقمة أو أنبوب فراغ.

2. بروتوكول التشريح

ملاحظة: يتم استخدام العديد من تقنيات النخر للقلب ، ولكل منها العديد من المزايا. بالنسبة لهذا البروتوكول ، تم اختيار اثنين من أكثر التقنيات استخداما: 1) "طريقة التدفق الداخلي والخارج" ، والتي تسمح بفحص أفضل للصمامات والشغاف وهي بروتوكول يستخدم لمعظم الأنواع 2،¹¹،^12،16 ، و 2) تقنية "تشريح الغرف الأربع" / "مستوى تخطيط صدى القلب" ، والتي تستخدم عادة للقطط أو الكلاب الصغيرة الحجم ^{1 ، 17}.

1. "طريقة التدفق الداخل-الخارج" لتشريح القلب²،^11،12،16
   1. ضع القلب مع الوجه الأذيني لأعلى (الشكل 2A).
   2. استخدم المقص والملقط عديم الأسنان للقطع على نطاق واسع من الوريد الأجوف الذيلي إلى الأذين الأيمن (الشكل 2B). استمر في القطع إلى الزائدة الأذنية اليمنى لفضح العقدة الطرفية / الجيبية الأذينية (SA node). افحص الصمام ثلاثي الشرف من المنظر الظهري.
   3. قطع مقطع من الأذين الأيمن إلى التقاطع بين البطين الأيمن والحاجز بين البطينين (الشكل 2C). عرض الصمام الأذيني البطيني الأيمن.
   4. قسم الجدار الخالي من البطين الأيمن على طول الحاجز بين البطينين. استمر في القسم حتى أصل الجذع الرئوي (الشكل 2C ، D).
   5. افحص بدقة الصمامات الأذينية البطينية اليمنى ، بما في ذلك tendineae الحبلي ، والعضلات الحليمية (الشكل 2D). قطع tendineae الحبل.
   6. ضع الملقط من خلال الجذع الرئوي واقطع الجذع طوليا (الشكل 2E). افحص مجرى التدفق الرئوي وأصل الجذع الرئوي والصمامات شبه القمرية.
   7. قطع الأذين الأيسر من الأوردة الرئوية إلى طرف الأذن اليسرى (الشكل 2F). افحص الصمام ثنائي الشرف (التاجي) من المنظر الظهري.
   8. ضع القلب مع توجيه الحاجز بين البطينين لأسفل (الشكل 2F). قم بعمل شق كبير في الجدار الحر البطيني من قاعدة البطين إلى قمة القلب. عرض الصمام الأذيني البطيني الأيسر بالكامل.
   9. قطع tendineae الحبلية من عتبة الصمام الأذيني البطيني الأيسر.
   10. ضع الملقط عبر مجرى تدفق البطين الأيسر واستخدمه كدليل لفتح الشريان الأورطي (الشكل 2G).
   11. استخدم محلول ملحي لإزالة جميع جلطات الدم. بمجرد إزالة جميع الجلطات الدموية ، قم بتقييم ومقارنة وزن القلب بكتلة الجسم أو جداول وزن القلب القياسية (الجدول 1) ^11،13.
   12. وزن القلب.
   13. إذا كانت عقدة SA فقط هي نقطة الاهتمام ، بعد فحص البطين الأيسر ، ضع القلب بالكامل في الفورمالين المحايد بنسبة 10٪ (NBF) لمدة 24 ساعة ، وقم بتقليم الأذين الأيمن لأخذ عينة من كريستا الطرفية.
       ملاحظة: من خلال هذه التقنية ، يمكن تقدير البطينين الأيسر والأيمن بسهولة. النسبة بين سمك جدار البطين الأيسر والأيمن هي 3: 1 ، مع اختلافات صغيرة حسب الأنواع والسلالة. بالنسبة لقلب الجنين الحيواني ، فإن النسبة هي 1: 1¹².

3. بروتوكول أخذ العينات لعلم الأنسجة¹⁶

1. باستخدام مشرط، قم بإجراء قطعتين طوليتين متوازيتين (على بعد 5 مم تقريبا) تشمل الأذين الأيمن، والصمام ثلاثي الشرف، والجدار الحر البطيني الأيمن (الشكل 2I)
2. قم بإجراء قطعتين طوليتين متوازيتين (يفصل بينهما حوالي 5 مم) يشملان الأذين الأيسر والصمام التاجي والعضلة الحليمية الظهرية والبطين الأيسر (الشكل 2H).
3. داخل الثلث العلوي الظهري من القلب، قم بتقسيم قاعدة القلب بشكل عرضي باتباع خط، بما في ذلك الحاجز بين البطينين، والأذين الأيمن، والشريان الأبهري، والصمام الأبهري، والصمام ثلاثي الشرف (الشكل 2J).
4. قم بإجراء قطعتين متوازيتين طوليتين تتعلقان بقاعدة الشريان الأورطي والحاجز بين البطينين (الشكل 2J).
5. قم بتقليم الأذين الأيمن حول محطة كريستا الطرفية ، ووفر عدة أقسام متوازية موجهة بشكل عرضي على المحور الطولي للكريستا (على بعد حوالي 3-4 مم) للحصول على ست قطع من عقدة SA (الشكل 3 ، الشكل 4I ، والشكل 5H).
6. تقليم الأنسجة التي تم الحصول عليها في أشرطة الكاسيت النسيجية.
   ملاحظة: بروتوكول الحظر الموصى به: الخطوة 3.1.-الكتلة النسيجية 1 (الشكل 6 يوضح الشريحة الناتجة من هذه الكتلة)، الخطوة 3.2.-الكتلة النسيجية 2 (الشكل 7 يوضح الشريحة الناتجة من هذه الكتلة)، الخطوة 3.4.-الكتلة النسيجية 3 (الشكل 8 يوضح الشريحة الناتجة من هذه الكتلة)، الخطوة 3.5.-الكتلة النسيجية 4 (يوضح الشكل 9 الشريحة الناتجة من هذه الكتلة).
7. اغمر الأنسجة في 10٪ NBF لمدة 48 ساعة على الأقل.

4. أخذ عينات من الشرايين التاجية³،^10،14

1. استخدم ملقط ومشرطا لتشريح الشرايين التاجية من الأخدود القلوي القلبي (الشكل 4K). إصلاح الشريان التاجي بين عشية وضحاها في 10٪ NBF.
2. إذا لزم الأمر ، قم بإزالة الكلس بشكل كاف في خليط 1: 1 من حمض الفورميك بنسبة 8٪ وحمض الهيدروكلوريك.
3. قم بإجراء تخفيضات عرضية متعددة على فترات 3 مم. ضع الأقسام في كاسيت ثم ضع الكاسيت في 10٪ NBF حتى يتم تضمينها.
   ملاحظة: يمكن استخدام الخنازير كنموذج قلبي للبشر ، خاصة عندما يتعلق الأمر بأمراض القلب التاجية. وبالتالي ، يوصى بالعينات التكميلية والأقسام النسيجية للشرايين التاجية³،^10،14.

5. تقنية تشريح "الغرف الأربع" / "مستوى تخطيط صدى القلب" للقلب ^1,17

ملاحظة: تتكون تقنية التشريح المكونة من أربع غرف من قطع من القاعدة إلى قمة القلب للحصول على العرض القياسي¹. من الأفضل تطبيق تقنية "أربع غرف" على الأنسجة الثابتة.

1. ضع القلب كله في 10٪ NBF لمدة 48 ساعة على الأقل.
2. بعد تثبيت القلب في 10٪ NBF لمدة 48 ساعة على الأقل (الشكل 10A) ، ضع ملقطين مستقيمين بدون أسنان ، أحدهما من خلال الأفياء القحفي - الأذين الأيمن - الصمام ثلاثي الشرف - البطين الأيمن ، والثاني من خلال الوريد الرئوي - الأذين الأيسر - الصمام التاجي - البطين الأيسر (الشكل 10B).
3. استخدم المسافة بين أذرع الملقط كتوجيه لشفرة القطع من القاعدة إلى قمة القلب (الشكل 10C). توفير مقطع طولي إضافي يبعد حوالي 5 مم عن القسم الموضح في الخطوة 5.2. على الجزء القلبي ، والذي يشمل الشريان الأورطي.
4. مع شق عرضي ، افصل تماما قاعدة القلب عن القمة. ضع كل جزء من الأنسجة في كاسيت نسيجي.
   ملاحظة: بروتوكول الحجب الموصى به: الكتلة النسيجية للقمة القلبية 5 (يوضح الشكل 11A الشريحة الناتجة من هذه الكتلة) ، الكتلة النسيجية الأساسية القلبية 6 (يوضح الشكل 11B الشريحة الناتجة من هذه الكتلة).
5. ضع الكاسيت في 10٪ من NBF حتى يتم تضمينها. إصلاح جميع عينات القلب في 10٪ NBF (أكثر من 10 أضعاف حجم الأنسجة) ، ومعالجتها بشكل روتيني في شمع البارافين ، قسم بسماكة 4 ميكرومتر ، وصمة عار مع الهيماتوكسيلين وبقعة الإيوسين (H & E وصمة عار) بعد بروتوكول¹⁰ الموصوف سابقا.
   ملاحظة: في حالة الاشتباه في التهاب عضلة القلب، "يجب الاحتفاظ بقطعة من أنسجة القلب الطازجة في ظروف معقمة مع مادة جراحية معقمة وحاوية عينات معقمة للدراسات الميكروبيولوجية والفيروسية"¹³.

6. التوثيق الفوتوغرافي

ملاحظة: يعد التوثيق الفوتوغرافي خطوة اختيارية في فحص الموت. ومع ذلك، فإن التصوير الفوتوغرافي وتسجيلات الفيديو ضرورية للحصول على "توثيق دقيق للتشريح الطبيعي وغير الطبيعي"³.

1. للحصول على وثائق فوتوغرافية مناسبة، التقط صورا رقمية أثناء إجراء "تشريح تدريجي لأنسجة القلب"¹³. الرجوع إلى المبادئ التوجيهية للتوثيق الفوتوغرافي والصورة¹⁵ للمنظر العام الأمامي والخلفي؛ شريحة من القلب. وأي آفات مشتبه بها.

النتائج

تم استخدام هذا البروتوكول لتصور السمات التشريحية وجمع عينات للفحص النسيجي للقلب في أربعة أنواع مختلفة (الكلب والقط والخنزير والبقرة). تم تكرار بروتوكول النخر في كل نوع من الأنواع المذكورة أعلاه ولكن تم توضيحه فقط في الكلاب. يبدأ بروتوكول النخر بفحص خارجي شامل للجسم (الشكل 1A

Discussion

عند تنفيذ البروتوكول الحالي ، يجب النظر بعناية في العديد من الخطوات الحاسمة لتحقيق نتائج متسقة. في الحيوانات الصغيرة ، تختلف قياسات القلب عن تلك الموجودة لدى البالغين (بما في ذلك سمك جدار البطين) ، وبشكل عام ، يمثل القلب نسبة أكبر من وزن الجسم^11,12. يمكن قياس د?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline solution	B. BRAUN MELSUNGEN AG	W04479004	For washing all the blood, and blood clots from the heart.
10% neutral buffered formalin (NBF)	Q Path	11699404	Materials for collecting histopathology samples.
Bone cutting forceps	HELEN SRL	LS109HV	Sturdy instrument for cutting bone.
Cutting board	Ambition	86304	For an easier manipulation, and cutting the organs.
Decalcifying solution	Thermo Scientific TBD-2	6764004	1:1 mixture of 8% formic acid and hydrochloric acid.
Digital camera	Canon Inc.	PowerShot SX540 HS	For photographic, and videographic documentation.
Forceps	MKD-Medicale	15-430	Dissection instruments.
Histological cassettes	Q Path	720-2215	Materials for collecting histopathology samples. Dimensions: 3 × 2.5 × 0.4 cm
Knife	TEHNO FOOD COM SERV SRL	D2006/15	Sharp blade for cutting soft tissue.
Latex gloves	MKD-Medicale	SANTEX-S	Protection equipment.
Mask	MKD-Medicale	21221	Protection equipment.
Petri dishes	MKD-Medicale	0598-1V	Materials for collecting ancillary testing samples.
Plastic recipients	Corning Gosselin	TP200-02	Materials for collecting histopathology samples.
Scale	ESPERANZA	MEEKS008	For weighing the organs.
Scale	White Deals	72	For weighing the subjects.
Scalpel	MKD-Medicale	10322E	Sharp blade for cutting soft tissue.
Scissors	MKD-Medicale	13-260	Dissection instruments.
Scrub	MKD-Medicale	410100-52	Protection equipment.
Syringes	MKD-Medicale	10573EU	Materials for collecting ancillary testing samples.