Методы рассечения и гистологический отбор проб сердца на крупных животных моделях сердечно-сосудистых заболеваний

Резюме

Из-за сложной анатомии последовательно воспроизводимый протокол вскрытия и сбора для сердечных образцов может быть сложным для реализации. В этой рукописи представлены ключевые элементы некоторых стандартных протоколов рассечения сердца, подчеркивая как подходы к грубому исследованию, так и участки отбора проб, обычно используемые для гистопатологического исследования.

Аннотация

Стандартное грубое обследование и отбор проб являются ключевыми элементами воспроизводимости и успешности экспериментальных исследований сердечно-сосудистых заболеваний, проводимых на крупных животных. Учитывая сложную анатомию сердца, межвидовые различия, типы компенсаторных и патологических реакций, последовательные протоколы сложно реализовать. Использование нескольких протоколов вскрытия обычно адаптируется к опыту прозектора, и личные предпочтения продолжают оставаться источником экспериментальной и межнаблюдательной изменчивости. Здесь цель состоит в том, чтобы представить основные анатомические особенности и ориентиры, протоколы вскрытия и гистологические стандарты отбора проб сердца у некоторых часто используемых видов (включая собак, свиней, жвачных животных и кошек) в качестве моделей сердечно-сосудистых заболеваний.

Здесь представлены два стандартных протокола грубой экспертизы. Во-первых, метод притока-оттока, который следует физиологическому направлению кровотока через сердце и крупные сосуды (часто используется у собак, жвачных животных и свиней), и, во-вторых, метод четырехкамерного рассечения (на примере кошек). Оба метода могут быть адаптированы к любому виду в определенных экспериментальных обстоятельствах. Протоколы отбора проб включают все области, представляющие интерес (синоатриальный узел, желудочки, межжелудочковая перегородка, предсердия, клапаны и аорта), и при правильном проведении улучшают как воспроизводимость, так и надежность экспериментальных исследований.

Введение

Из-за сложной анатомии и ранней строгости, которые могут мешать оценке толщины сердечной стенки, грубое обследование сердца является сложным и подвержено нескольким ошибкам, связанным с техникой или интерпретацией. Это усиливается межвидовыми морфологическими вариациями и тем, что многие клинические, основные сердечные патологии (включая ранние случаи ишемической болезни сердца, фиброза, артериита и амилоидоза) не связаны с какими-либо грубыми изменениями, являясь, по сути, гистологическими патологиями. Стандартизированный протокол вскрытия и гистологического отбора проб может обеспечить согласованность между наблюдателями и, в то же время, сопоставимость и воспроизводимость экспериментальных исследований сердечно-сосудистых заболеваний.

Образцы были взяты у двух собак (Canis lupus familiaris) (3-летний, самец французского бульдога и 8-летняя самка смешанной породы), кошка (Felis catus) (6-летний, самец европейского короткошерстного), домашняя свинья (Sus scrofa domesticus) (1-летний, самец Большой Белый) и корова (Bos taurus) (2-месячная самка Гольштейна). Каждый из выбранных видов имеет особое применение в качестве сердечно-сосудистой модели для различных заболеваний; например, собаки являются предпочтительной моделью для моделирования аритмии; кошки предпочтительны при гипертрофической кардиомиопатии (ГКМП), так как это вид с наибольшей распространенностью ГКМП; свиньи используются в качестве модели при остром инфаркте миокарда; и жвачные животные используются в качестве модели для интоксикации из-за их воздействия токсинов, которые можно легко найти на лугах¹¹.

В этой рукописи представлены один протокол некропсии и два протокола вскрытия сердца, призванные улучшить грубое и гистологическое исследование сердца при экспериментальных сердечно-сосудистых заболеваниях. Описанные протоколы разработаны на основе информации из ветеринарных учебников 1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12, журнальной литературы ^3,13,14, официальных документов¹⁵ и вебинаров^{16 ,17}. Образцы, использованные в этом исследовании, были собраны из трупов, представленных в отделение патологии USAMV Cluj-Napoca для рутинной диагностики вскрытия.

протокол

Экспериментальный протокол получил биоэтическое соглашение (No 311 от 2022 года) и был одобрен Комитетом по биоэтике Университета сельскохозяйственных наук и ветеринарной медицины Клуж-Напока, в соответствии как с национальным (Закон No 43 от 2014 года), так и с европейским (Директива ЕС No 63 от 2010 года) законодательством. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах и инструментах, используемых в этом протоколе.

1. Протокол некропсии

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать один и тот же протокол некропсии для всех представленных видов из-за более легкого доступа, когда выполняется ^2,12. Следующие шаги представляют собой некропсию, выполненную у собаки среднего размера. Адаптируйте шаги при выполнении некропсий на разных предметах.

1. Взвесьте предмет и положите его на стол для некропсии с левой стороны (рисунок 1А). Приступают к внешнему осмотру предмета (путем осмотра и пальпации кутиса и слизистых оболочек, отмечая все изменения цвета, консистенции и объема).
2. Используйте нож (или скальпель) и сделайте разрез 7 см в правой подмышечной впадине (рисунок 1А).
3. Определите местонахождение коксофеморального соединения (рисунок 1A,B). Откройте капсулу ножом. Перережьте связку головки бедренной кости (рисунок 1В).
4. Используйте нож для расширения разреза кожи в подмышечной впадине черепа до нижнечелюстного симфиза и каудально до промежности (рисунок 1B).
5. Снимите кожу скальпелем и обнажите грудную и брюшную стенки от вентральной средней линии до уровня поперечных отростков позвонков (рисунок 1В).
6. С помощью скальпеля и щипцов создайте лоскут через брюшную стенку, вентрокудал к правой реберной дуге. Открыть брюшную полость ножницами – следить за каудальным аспектом правого подреберья (рисунок 1В).
7. Вытяните разрез каудально вдоль правой паралюмбальной области до наружного подвздошного гребня. После этого вытяните разрез до лобкового введения linea alba.
8. Вкратце, осмотрите органы брюшной полости in situ (отмечая любые изменения в цвете, консистенции, объеме и положении органов).
9. Скальпелем и щипцами проколоть диафрагму в самой высокой точке (рисунок 1В).
10. Введите в грудную полость, удалив правую грудную клетку с двумя продольными участками с помощью режущих кости щипцов. Срез парастернального хрящевого сегмента ребер. Далее разрезаем спинной сегмент ребер, проксимальный к костовертебральным суставам (рисунок 1С).
11. Осмотрите сердце in situ (рисунок 1С). Обратите внимание на размер, положение, цвет, связи с соседними тканями и при пальпации любые изменения консистенции⁹.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если присутствует тромбоз или врожденный порок сердца, сердце должно быть рассечено in situ (такой подход позволяет полностью обследовать крупные сосуды).
12. Используйте ножницы для осмотра и вскрытия полости перикарда с продольным сечением от основания до вершины сердца. Осмотрите полость перикарда и эпикард (отмечая любые изменения цвета, консистенции и объема)¹².
13. Отпустите сердце ножницами, получив поперечные участки аорты, легочного ствола и обеих вен. Сечение верхней полой вены не менее чем на 1 см выше входа в правое предсердие для сохранения crista terminalis^11,13.
14. Исследуйте внешний контур органа, внешний вид эпикарда, внешний вид миокарда по прозрачности эпикарда и внешний вид крупных сосудов (рисунок 2А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, открытие и исследование перикарда представляют некоторые различия между видами. Обследование полости перикарда начинается с внешнего осмотра и оценки через прозрачность перикарда общего содержания перикарда ^1,2. У кошки или собаки перикард обычно содержит около 0,25 мл/кг тонкой, прозрачной, полупрозрачной до светло-желтой жидкости⁹. При наличии каких-либо патологических выпотов их следует собирать стерильным шприцем или трубкой вакутейнера.

2. Протокол рассечения

ПРИМЕЧАНИЕ: Для сердца используется несколько техник некропсии, каждая из которых имеет несколько преимуществ. Для этого протокола были выбраны два наиболее часто используемых метода: 1) «метод притока-оттока», который позволяет лучше исследовать клапаны и эндокард и является протоколом, используемым для большинства видов 2,11,12,16, и 2) метод «четырехкамерного рассечения»/«эхокардиографической плоскости», обычно используемый для кошек или собак небольшого размера ^{1, 17}.

1. «Метод притока-оттока» для рассечения сердца 2,11,12,16
   1. Поместите сердце лицевой стороной предсердия вверх (рисунок 2А).
   2. Используйте ножницы и беззубые щипцы, чтобы широко разрезать каудальную полую вену вдоль правого предсердия (рисунок 2B). Продолжайте разрез к правому ушному придатку, чтобы обнажить crista terminalis/синоатриальный узел (узел SA). Осмотрите трехстворчатый клапан с дорсального вида.
   3. Отрежьте участок от правого предсердия до соединения между правым желудочком и межжелудочковой перегородкой (рисунок 2С). Отображение правого атриовентрикулярного клапана.
   4. Срез правого желудочка свободной стенки вдоль межжелудочковой перегородки. Продолжайте сечение до начала легочного ствола (рисунок 2C,D).
   5. Тщательно осмотрите правые атриовентрикулярные клапаны, в том числе хорды tendineae, и сосочковые мышцы (рисунок 2D). Вырежьте хорды tendineae.
   6. Поместите щипцы через легочный ствол и разрежьте ствол продольно (рисунок 2Е). Исследуют легочный тракт оттока, легочное стволовое происхождение и полулунные клапаны.
   7. Отрежьте левое предсердие от легочных вен до кончика левой ушной раковины (рисунок 2F). Осмотрите двустворчатый (митральный) клапан с дорсального вида.
   8. Поместите сердце межжелудочковой перегородкой лицом вниз (рисунок 2F). Сделайте большой разрез в свободной стенке желудочка от основания желудочка до сердечной вершины. Отобразите левый атриовентрикулярный клапан полностью.
   9. Вырежьте хорды сухожилий куспида левого атриовентрикулярного клапана.
   10. Поместите щипцы через отток левого желудочка и используйте его в качестве ориентира для открытия аорты (рисунок 2G).
   11. Используйте солевой раствор для удаления всех тромбов. После удаления всех сгустков крови оцените и сравните сердечную массу с массой тела или стандартными таблицами сердечного веса (таблица 1)^11,13.
   12. Взвесьте сердце.
   13. Если только узел SA является точкой интереса, после обследования левого желудочка поместите все сердце полностью в 10% нейтрально-буферный формалин (NBF) в течение 24 часов и обрежьте правое предсердие для отбора проб crista terminalis.
       ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью этой техники можно легко оценить левый и правый желудочки. Соотношение между толщиной стенки левого и правого желудочков составляет 3:1, с небольшими различиями по видам и породам; для сердца плода животного соотношение составляет 1:1¹².

3. Протокол выборки для гистологии¹⁶

1. С помощью скальпеля сделайте два продольных параллельных разреза (приблизительно на расстоянии 5 мм друг от друга) с участием правого предсердия, трикуспидального клапана и правой стенки желудочка (рисунок 2I)
2. Сделайте два продольных параллельных разреза (примерно на расстоянии 5 мм друг от друга) с участием левого предсердия, митрального клапана, дорсальной сосочковой мышцы и левого желудочка (рисунок 2H).
3. В дорсальной верхней трети сердца поперечное сечение основания сердца следует линии, включая межжелудочковую перегородку, правое предсердие, аорту, аортальный клапан и трехстворчатый клапан (рисунок 2J).
4. Сделайте два продольных параллельных разреза с участием основания аорты и межжелудочковой перегородки (рисунок 2J).
5. Обрежьте правое предсердие вокруг crista terminalis и предоставьте несколько параллельных секций, ориентированных поперечно на продольной оси crista (приблизительно 3-4 мм друг от друга), чтобы получить шесть частей узла SA (рисунок 3, рисунок 4I и рисунок 5H).
6. Обрезать полученные ткани в гистологических кассетах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемый протокол блокировки: шаг 3.1.-гистологический блок 1 (на рисунке 6 показан результирующий слайд из этого блока.), шаг 3.2.-гистологический блок 2 (на рисунке 7 показан результирующий слайд из этого блока), шаг 3.4.-гистологический блок 3 (на рисунке 8 показан результирующий слайд из этого блока), шаг 3.5.-гистологический блок 4 (на рисунке 9 показан полученный слайд из этого блока).
7. Погружайте ткани в 10% NBF в течение не менее 48 ч.

4. Забор коронарных артерий ^3,10,14

1. Используйте щипцы и скальпель для рассечения коронарных артерий от паракональной бороздки сердца (рисунок 4K). Фиксируют коронарную артерию на ночь в 10% NBF.
2. При необходимости достаточно декальцинируйте в смеси 1:1 8% муравьиной кислоты и соляной кислоты.
3. Делайте несколько поперечных разрезов с интервалом 3 мм. Поместите секции в кассету, а затем поместите кассету в 10% NBF до встраивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Свиньи могут быть использованы в качестве сердечной модели для людей, особенно когда речь идет об ишемической болезни сердца. Следовательно, дополнительные пробы и гистологические срезы коронарных артерий рекомендуются ^3,10,14.

5. Техника рассечения сердца «четыре камеры»/«эхокардиографическая плоскость» ^1,17

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод четырехкамерного рассечения состоит из разреза от основания до вершины сердца для получения стандартного вида¹. «Четырехкамерная» методика лучше всего применяется к фиксированным тканям.

1. Поместите все сердце в 10% NBF в течение не менее 48 ч.
2. После того, как сердце фиксируется в 10% NBF в течение не менее 48 ч (рисунок 10A), поместите два беззубых прямых рассеченных щипца, один через черепную полую часть предсердия-трикуспидальный клапан-правый желудочек, а второй через легочную вену-левое предсердие-митральный клапан-левый желудочек (Рисунок 10B).
3. Используйте пространство между щипцами в качестве ориентира для режущего лезвия от основания до вершины сердца (рисунок 10C). Предусмотреть дополнительное продольное сечение приблизительно на расстоянии 5 мм от сечения, описанного на этапе 5.2. на сердечном сегменте, который включает в себя аорту.
4. С помощью поперечного разреза полностью отделить сердечное основание от вершины. Поместите каждый сегмент ткани в гистологическую кассету.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемый протокол блокировки: сердечный верхний гистологический блок 5 (на рисунке 11А показан результирующий слайд из этого блока), сердечный базовый гистологический блок 6 (на фиг.11В показан полученный слайд из этого блока).
5. Поместите кассеты в 10% NBF до встраивания. Зафиксируйте все сердечные образцы в 10% NBF (более чем в 10 раз больше объема ткани), регулярно обрабатывайте их в парафиновом воске, сечении толщиной 4 мкм и окрашивании пятном гематоксилина и эозина (окрашивание H & E) в соответствии с ранее описанным протоколом¹⁰.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При подозрении на миокардит «кусочек свежей сердечной ткани должен быть сохранен в стерильных условиях со стерильным хирургическим материалом и стерильным контейнером для образцов для микробиологических и вирусных исследований»¹³.

6. Фотоматериальная документация

ПРИМЕЧАНИЕ: Фотодокументация является необязательным этапом в экспертизе некропсии. Тем не менее, фотографии и видеозаписи необходимы для того, чтобы иметь «точную документацию нормальной и аномальной анатомии»³.

1. Для надлежащей фотодокументации делайте цифровые снимки при выполнении «прогрессирующей рассечения сердечных тканей»¹³. Обратитесь к руководству по фотографической документации и фотографии¹⁵ общего вида - передний и задний; кусочек сердца; и любые предполагаемые повреждения.

Результаты

Этот протокол использовался для визуализации анатомических особенностей и сбора образцов для гистологического исследования сердца у четырех различных видов (собака, кошка, свинья и корова). Протокол некропсии повторялся у каждого из вышеупомянутых видов, но проиллюстрирован только у...

Обсуждение

При выполнении текущего протокола следует тщательно рассмотреть несколько критических шагов для получения последовательных результатов. У молодых животных сердечные измерения отличаются от измерений у взрослых (включая толщину стенки желудочков), и, как правило, сердце представляет...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline solution	B. BRAUN MELSUNGEN AG	W04479004	For washing all the blood, and blood clots from the heart.
10% neutral buffered formalin (NBF)	Q Path	11699404	Materials for collecting histopathology samples.
Bone cutting forceps	HELEN SRL	LS109HV	Sturdy instrument for cutting bone.
Cutting board	Ambition	86304	For an easier manipulation, and cutting the organs.
Decalcifying solution	Thermo Scientific TBD-2	6764004	1:1 mixture of 8% formic acid and hydrochloric acid.
Digital camera	Canon Inc.	PowerShot SX540 HS	For photographic, and videographic documentation.
Forceps	MKD-Medicale	15-430	Dissection instruments.
Histological cassettes	Q Path	720-2215	Materials for collecting histopathology samples. Dimensions: 3 × 2.5 × 0.4 cm
Knife	TEHNO FOOD COM SERV SRL	D2006/15	Sharp blade for cutting soft tissue.
Latex gloves	MKD-Medicale	SANTEX-S	Protection equipment.
Mask	MKD-Medicale	21221	Protection equipment.
Petri dishes	MKD-Medicale	0598-1V	Materials for collecting ancillary testing samples.
Plastic recipients	Corning Gosselin	TP200-02	Materials for collecting histopathology samples.
Scale	ESPERANZA	MEEKS008	For weighing the organs.
Scale	White Deals	72	For weighing the subjects.
Scalpel	MKD-Medicale	10322E	Sharp blade for cutting soft tissue.
Scissors	MKD-Medicale	13-260	Dissection instruments.
Scrub	MKD-Medicale	410100-52	Protection equipment.
Syringes	MKD-Medicale	10573EU	Materials for collecting ancillary testing samples.