Diseksiyon Teknikleri ve Kardiyovasküler Hastalıklar için Büyük Hayvan Modellerinde Kalbin Histolojik Örneklemesi

Özet

Karmaşık anatomi nedeniyle, kardiyak örnekler için sürekli tekrarlanabilir bir diseksiyon ve hasat protokolünün uygulanması zor olabilir. Bu yazıda bazı standart kardiyak diseksiyon protokollerinin temel unsurları sunulmakta ve hem brüt inceleme yaklaşımları hem de histopatolojik inceleme için yaygın olarak kullanılan örnekleme alanları vurgulanmaktadır.

Özet

Standart brüt muayene ve örnekleme, büyük hayvanlarda yürütülen kardiyovasküler hastalıkların deneysel çalışmalarının tekrarlanabilirliği ve başarısında kilit unsurlardır. Kalbin karmaşık anatomisi, türler arası farklılıklar ve telafi edici ve patolojik reaksiyon türleri göz önüne alındığında, tutarlı protokollerin uygulanması zordur. Çoklu diseksiyon protokollerinin kullanımı genellikle sektörün deneyimine uyacak şekilde uyarlanır ve kişisel tercihler deneysel ve gözlemciler arası değişkenlik kaynağı olmaya devam eder. Burada amaç, kardiyovasküler hastalıkların modelleri olarak yaygın olarak kullanılan bazı türlerde (köpekler, domuzlar, ruminantlar ve kediler dahil) kalbin ana anatomik özelliklerini ve yer işaretlerini, diseksiyon protokollerini ve histolojik örnekleme standartlarını sunmaktır.

Burada iki standart brüt muayene protokolü sunulmaktadır. Birincisi, kalpten ve büyük damarlardan (köpeklerde, ruminantlarda ve domuzlarda sıklıkla kullanılan) fizyolojik kan akış yönünü takip eden giriş-çıkış yöntemi ve ikincisi, dört odacıklı diseksiyon tekniği (kedilerde örneklenmiştir). Her iki teknik de belirli deneysel koşullarda herhangi bir türe uyarlanabilir. Örnekleme protokolleri tüm ilgi alanlarını (sinoatriyal düğüm, ventriküller, interventriküler septum, atriyum, kapakçıklar ve aort) içerir ve uygun şekilde gerçekleştirilirse, deneysel çalışmaların hem tekrarlanabilirliğini hem de güvenilirliğini arttırır.

Giriş

Kardiyak duvar kalınlığının değerlendirilmesine müdahale edebilen karmaşık anatomi ve erken titizlik nedeniyle, kalbin brüt muayenesi zordur ve teknikle ilgili çeşitli veya yorumlama hatalarına eğilimlidir. Bu, interspesifik morfolojik varyasyonlar ve birçok klinik, majör kardiyak patolojinin (erken koroner kalp hastalıkları, fibroz, arterit ve amiloidoz vakaları dahil) özünde histolojik patolojiler olan herhangi bir büyük değişiklikle ilişkili olmadığı gerçeğiyle güçlendirilmiştir. Standartlaştırılmış bir diseksiyon ve histolojik numune toplama protokolü, gözlemciler arasında tutarlılık ve aynı zamanda kardiyovasküler hastalıkların deneysel çalışmalarının karşılaştırılabilirliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlayabilir.

Örnekler iki köpekten (Canis lupus familiaris) (3 yaşında, erkek bir Fransız Bulldog ve 8 yaşında, dişi karışık cins), bir kediden (Felis catus) (6 yaşında, erkek bir Avrupa stenografisi), bir evcil domuzdan (Sus scrofa domesticus) (1 yaşında, erkek Büyük Beyaz) ve bir (Bos taurus) (2 aylık, dişi Holstein) toplandı. Seçilen türlerin her biri, farklı bir hastalık için kardiyovasküler bir model olarak özel bir kullanıma sahiptir; örneğin, köpekler aritmi modellemesi için tercih edilen bir modeldir; HCM prevalansının en yüksek olduğu türler olduğu için hipertrofik kardiyomiyopati (HCM) için kediler tercih edilir; domuzlar akut miyokard enfarktüsü için bir model olarak kullanılır; ruminantlar, çayırlarda kolayca bulunabilen toksinlere maruz kalmaları nedeniyle zehirlenme için bir model olarak kullanılır¹¹.

Bu yazıda, deneysel kardiyovasküler hastalıklarda kalbin brüt ve histolojik incelemesini iyileştirmek için tasarlanmış bir nekropsi protokolü ve kalbin iki diseksiyon protokolü sunulmuştur. Açıklanan protokoller, veterinerlik ders kitapları 1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12, dergi literatürü ^3,13,14, resmi belgeler 15 ve web seminerlerinden alınan bilgilere dayanarak geliştirilmiştir ^{16 ,17}. Bu çalışmada kullanılan örnekler, rutin otopsi teşhisi için USAMV Cluj-Napoca Patoloji Bölümü'ne sunulan kadavralardan toplanmıştır.

Protokol

Deneysel protokol biyoetik anlaşma (2022'den itibaren No. 311) aldı ve hem ulusal (2014 tarihli 43 sayılı Kanun) hem de Avrupa (2010'dan itibaren 63 sayılı AB Direktifi) mevzuatına uygun olarak Tarım Bilimleri ve Veterinerlik Üniversitesi Cluj-Napoca Biyoetik Kurulu tarafından onaylandı. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler ve araçlar hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız.

1. Nekropsi protokolü

NOT: Sunulan tüm türler için aynı nekropsi protokolünün kullanılması tavsiye edilir, çünkü daha kolay erişim ^2,12. Aşağıdaki adımlar, orta büyüklükte bir köpekte gerçekleştirilen nekropsi'yi temsil eder. Farklı konularda nekropsiler yaparken adımları uyarlayın.

1. Konuyu tartın ve sol tarafındaki nekropsi tablasının üzerine yerleştirin (Şekil 1A). Konunun dış incelemesine devam edin (cutis ve mukozaların incelenmesi ve palpasyonuyla, renk, tutarlılık ve hacimdeki tüm değişiklikleri not ederek).
2. Bir bıçak (veya neşter) kullanın ve sağ aksillada 7 cm'lik bir kesi yapın (Şekil 1A).
3. Koxofemoral kavşağı bulun (Şekil 1A,B). Kapsülü bir bıçakla açın. Femur başının bağını kesin (Şekil 1B).
4. Aksilla kraniyalindeki deri insizyonunu mandibuler simfize ve kaudal olarak perineye uzatmak için bıçağı kullanın (Şekil 1B).
5. Cildi neşterle çıkarın ve torasik ve abdominal duvarı ventral orta hattan vertebral enine süreçlerin seviyesine kadar maruz bırakın (Şekil 1B).
6. Neşter ve forseps ile, karın duvarından bir flep oluşturun, ventrocaudal sağ kostal kemere. Karın boşluğunu makasla açın - sağ hipokondriyumun kaudal yönünü takip edin (Şekil 1B).
7. Kesiyonu sağ paralomber bölge boyunca kaudal olarak eksternal iliak tepeye kadar uzatın. Daha sonra, insizyonu linea alba'nın kasık yerleştirilmesine kadar uzatın.
8. Kısaca, karın organlarını in situ olarak inceleyin (organların renk, kıvam, hacim ve pozisyonundaki değişiklikleri not ederek).
9. Neşter ve forseps ile diyaframı en yüksek noktada delin (Şekil 1B).
10. Kemik kesici forseps kullanarak sağ göğüs kafesini iki uzunlamasına kesitle çıkararak göğüs boşluğuna girin. Kaburgaların parasternal kıkırdaklı segmentini kesitleyin. Daha sonra, kaburgaların dorsal segmentini, kostovertebral eklemlere proksimal olarak kesitleyin (Şekil 1C).
11. Kalbi yerinde inceleyin (Şekil 1C). Boyuta, konuma, renge, bitişik dokularla bağlantılara ve palpasyonla, tutarlılıktaki herhangi bir değişikliğe dikkat edin⁹.
    NOT: Bir tromboz veya konjenital kalp hastalığı varsa, kalp in situ olarak diseke edilmelidir (bu yaklaşım büyük damarların tam olarak incelenmesine izin verir).
12. Perikardiyal boşluğu, tabandan kalbin tepesine kadar uzunlamasına bir kesitle incelemek ve açmak için makas kullanın. Perikard boşluğunu ve epikardı inceleyin (renk, tutarlılık ve hacimdeki değişiklikleri fark ederek)¹².
13. Kalbi makasla serbest bırakın, aort, pulmoner gövde ve her iki vena kavanın enine bölümlerini verin. Sağ atriyuma girişten en az 1 cm yukarıda superior vena kava kesitini korumak için crista terminalis^11,13'tür.
14. Organın dış konturunu, epikardın görünümünü, epikardın şeffaflığı ile miyokardın görünümünü ve büyük damarların dış görünümünü inceleyin (Şekil 2A).
    NOT: Genel olarak, perikardın açılması ve incelenmesi, türler arasında bazı farklılıklar göstermektedir. Perikard boşluğunun incelenmesi, genel perikardiyal içeriğin perikardının şeffaflığı yoluyla harici bir muayene ve değerlendirme ile başlar ^1,2. Bir kedi veya köpekte, perikard tipik olarak yaklaşık 0.25 mL / kg ince, berrak, yarı saydam ila açık sarı sıvı^{içerir 9}. Herhangi bir patolojik efüzyon varsa, steril bir şırınga veya vakumlayıcı tüp ile toplanmalıdır.

2. Diseksiyon protokolü

NOT: Kalp için her biri çeşitli avantajlara sahip çeşitli nekropsi teknikleri kullanılır. Bu protokol için en çok kullanılan tekniklerden ikisi seçildi: 1) valflerin ve endokardın daha iyi incelenmesini sağlayan ve^türlerin çoğu için kullanılan bir protokol olan "giriş-çıkış yöntemi" 2,11,12,16 ve 2) tipik olarak kediler veya küçük boyutlu köpekler için kullanılan "dört odacıklı diseksiyon" / "ekokardiyografik düzlem" tekniği^{1, 17}.

1. Kardiyak diseksiyon için "giriş-çıkış yöntemi" 2,11,12,16
   1. Kalbi atriyal yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin (Şekil 2A).
   2. Kaudal vena kavadan sağ atriyuma doğru geniş bir şekilde kesmek için makas ve dişsiz forseps kullanın (Şekil 2B). Crista terminals/sinoatriyal düğümü (SA nodu) ortaya çıkarmak için sağ auriküler uzantıya doğru kesime devam edin. Triküspid kapağı dorsal görünümden kontrol edin.
   3. Sağ atriyumdan sağ ventrikül ve interventriküler septum arasındaki kavşağa kadar bir kesit kesin (Şekil 2C). Sağ atriyoventriküler kapağı görüntüleyin.
   4. İnterventriküler septum boyunca sağ ventrikülsüz duvarı kesitleyin. Pulmoner gövdenin orijinine kadar bölüme devam edin (Şekil 2C,D).
   5. Kordae tendineae ve papiller kaslar dahil olmak üzere sağ atriyoventriküler kapakları iyice inceleyin (Şekil 2D). chordae tendineae kesin.
   6. Forsepsleri pulmoner gövdeden geçirin ve gövdeyi uzunlamasına kesin (Şekil 2E). Pulmoner çıkış yolunu, pulmoner gövde orijinini ve semilunar kapakları inceleyin.
   7. Sol atriyumu pulmoner damarlardan sol kulak kepçesinin ucuna kadar kesin (Şekil 2F). Biküspid (mitral) kapağı dorsal görünümden kontrol edin.
   8. Kalbi interventriküler septum aşağı bakacak şekilde yerleştirin (Şekil 2F). Ventrikül serbest duvarında ventrikül tabanından kardiyak tepeye kadar büyük bir kesi yapın. Sol atriyoventriküler kapağı tamamen görüntüleyin.
   9. Sol atriyoventriküler kapağın tepesinin kordae tendineasını kesin.
   10. Forsepsleri sol ventrikül çıkış yolundan geçirin ve aortu açmak için kılavuz olarak kullanın (Şekil 2G).
   11. Tüm kan pıhtılarını çıkarmak için tuzlu su çözeltisi kullanın. Tüm kan pıhtıları çıkarıldıktan sonra, kalp ağırlığını vücut kütlesi veya standart kalp ağırlığı tabloları ile değerlendirin ve karşılaştırın (Tablo 1)^11,13.
   12. Kalbi tartın.
   13. Sadece SA düğümü ilgi çekici ise, sol ventrikül muayenesinden sonra, tüm kalbi 24 saat boyunca% 10 nötr tamponlu formalin (NBF) içine yerleştirin ve crista terminallerini örneklemek için sağ atriyumu kesin.
       NOT: Bu teknikle, sol ve sağ ventriküller kolayca takdir edilebilir. Sol ve sağ ventrikül duvar kalınlığı arasındaki oran, türlere ve cinslere göre küçük farklılıklarla 3: 1'dir; hayvan fetüs kalbi için oran 1: 1^12'dir.

3. Histoloji için örnekleme protokolü¹⁶

1. Bir neşterle, sağ atriyumu, triküspid kapağı ve sağ ventrikül serbest duvarını içeren iki uzunlamasına paralel kesim (yaklaşık 5 mm arayla) yapın (Şekil 2I)
2. Sol atriyum, mitral kapak, dorsal papiller kas ve sol ventrikülü içeren iki uzunlamasına paralel kesim (yaklaşık 5 mm arayla) yapın (Şekil 2H).
3. Kalbin dorsal üst-üçte birinde, interventriküler septum, sağ atriyum, aort, aort kapağı ve triküspid kapak dahil olmak üzere bir çizgiyi takip ederek kalbin tabanını enine kesitleyin (Şekil 2J).
4. Aort tabanını ve interventriküler septumu içeren iki uzunlamasına paralel kesi yapın (Şekil 2J).
5. Crista terminallerinin etrafındaki sağ atriyumu kesin ve SA düğümünün altı parçasını elde etmek için kristanın uzunlamasına ekseni üzerinde (yaklaşık 3-4 mm aralıklı) enine yönlendirilmiş birkaç paralel kesit sağlayın (Şekil 3, Şekil 4I ve Şekil 5H).
6. Elde edilen dokuları histolojik kasetlerde kesin.
   NOT: Önerilen engelleme protokolü: adım 3.1.-histolojik blok 1 (Şekil 6 bu bloktan elde edilen slaytı gösterir.), adım 3.2.-histolojik blok 2 (Şekil 7 bu bloktan elde edilen slaytı gösterir), adım 3.4.-histolojik blok 3 (Şekil 8 bu bloktan elde edilen slaytı gösterir), adım 3.5.-histolojik blok 4 (Şekil 9 bu bloktan elde edilen slaytı gösterir).
7. Dokuları en az 48 saat boyunca% 10 NBF'ye batırın.

4. Koroner arterlerin örneklenmesi ^3,10,14

1. Koroner arterleri kardiyak parakonal oluktan diseke etmek için forseps ve neşter kullanın (Şekil 4K). Koroner arteri gece boyunca% 10 NBF'de sabitleyin.
2. Gerekirse,% 8 formik asit ve hidroklorik asidin 1: 1'lik bir karışımında yeterince kireçlenin.
3. 3 mm aralıklarla birden fazla enine kesim yapın. Bölümleri bir kasete yerleştirin ve ardından kaseti gömene kadar% 10 NBF'ye yerleştirin.
   NOT: Domuzlar, özellikle koroner kalp hastalığı söz konusu olduğunda, insanlar için kardiyak bir model olarak kullanılabilir. Bu nedenle koroner arterlerin ek örnekleri ve histolojik kesitleri önerilmektedir 3,10,14.

5. Kalbin "dört odacıklı"/"ekokardiyografik düzlem" diseksiyon tekniği ^1,17

NOT: Dört odacıklı diseksiyon tekniği, standart görünüm^1'i elde etmek için tabandan kalbin tepesine kadar bir kesimden oluşur. "Dört odacıklı" teknik en iyi sabit dokulara uygulanır.

1. Tüm kalbi en az 48 saat boyunca% 10 NBF'ye yerleştirin.
2. Kalp en az 48 saat boyunca %10 NBF'de sabitlendikten sonra (Şekil 10A), biri kraniyal kava-sağ atriyum-triküspid kapak-sağ ventrikülden, ikincisi pulmoner ven-sol atriyum-mitral kapak-sol ventrikülden olmak üzere iki dişsiz düz diseksiyon forsepsi yerleştirin (Şekil 10B).
3. Forseps kolları arasındaki boşluğu, tabandan kalbin tepesine kadar kesme bıçağı için kılavuz olarak kullanın (Şekil 10C). Adım 5.2'de açıklanan bölümden yaklaşık 5 mm ayrı olarak ilave bir uzunlamasına kesit sağlayın. aortu içeren kardiyak segmentte.
4. Transversal bir insizyon ile, kalp tabanını tepeden tamamen ayırın. Her doku segmentini histolojik bir kasete yerleştirin.
   NOT: Önerilen blokaj protokolü: kardiyak apeks-histolojik blok 5 (Şekil 11A bu bloktan elde edilen slaytı gösterir), kardiyak baz-histolojik blok 6 (Şekil 11B bu bloktan elde edilen slaytı gösterir).
5. Kasetleri gömene kadar %10 NBF içine yerleştirin. Tüm kardiyak örnekleri% 10 NBF'de (doku hacminin 10 katından fazla) sabitleyin, rutin olarak parafin balmumu, 4 μm kalınlığında kesit ve daha önce tarif edilen bir protokol^10'u izleyerek hematoksilin ve eozin boyası (H & E boyası) ile boyanın.
   NOT: Miyokarditten şüpheleniliyorsa, "mikrobiyolojik ve viral çalışmalar için steril cerrahi malzeme ve steril numune kabı ile steril koşullar altında bir parça taze kalp dokusu tutulmalıdır"¹³.

6. Fotoğraflı belgeler

NOT: Fotografik dokümantasyon, nekropsi incelemesinde isteğe bağlı bir adımdır. Bununla birlikte, fotoğraf ve video kayıtlarının "normal ve anormal anatominin doğru bir şekilde belgelendirilmesi"³ için gereklidir.

1. Doğru fotoğrafik dokümantasyon için, "kalp dokularının ilerleyici diseksiyonu"¹³ yaparken dijital görüntüler alın. Fotoğrafik dokümantasyon ve fotoğraf¹⁵ genel görünüm-ön ve arka kılavuzlarına bakınız; kalbin bir dilimi; ve şüpheli lezyonlar.

Sonuçlar

Bu protokol, anatomik özellikleri görselleştirmek ve dört farklı türde (köpek, kedi, domuz ve) kalbin histolojik incelemesi için örnekler toplamak için kullanıldı. Nekropsi protokolü, yukarıda belirtilen türlerin her birinde tekrarlandı, ancak sadece köpeklerde gösterildi. Nekropsi protokolü, vücudun (Şekil 1A) (deri, keşfedilebilir lenf düğümleri ve dış mukoza dahil) kapsamlı bir dış muayenesiyle, toplam ağırlığın ölçülmesiyle ve hayvanın genel durumun...

Tartışmalar

Mevcut protokolü gerçekleştirirken, tutarlı sonuçlar için birkaç kritik adım dikkatlice düşünülmelidir. Genç hayvanlarda, kardiyak ölçümler yetişkinlerdekilerden farklıdır (ventriküler duvar kalınlığı dahil) ve genellikle kalp, vücut ağırlığının daha büyük bir bölümünü temsil eder^11,12. Ventriküler hipertrofinin derecesi, genel bir ağırlık formülü uygulanarak, sol ventrikül ile septum arasındaki oran, normal koşullar ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline solution	B. BRAUN MELSUNGEN AG	W04479004	For washing all the blood, and blood clots from the heart.
10% neutral buffered formalin (NBF)	Q Path	11699404	Materials for collecting histopathology samples.
Bone cutting forceps	HELEN SRL	LS109HV	Sturdy instrument for cutting bone.
Cutting board	Ambition	86304	For an easier manipulation, and cutting the organs.
Decalcifying solution	Thermo Scientific TBD-2	6764004	1:1 mixture of 8% formic acid and hydrochloric acid.
Digital camera	Canon Inc.	PowerShot SX540 HS	For photographic, and videographic documentation.
Forceps	MKD-Medicale	15-430	Dissection instruments.
Histological cassettes	Q Path	720-2215	Materials for collecting histopathology samples. Dimensions: 3 × 2.5 × 0.4 cm
Knife	TEHNO FOOD COM SERV SRL	D2006/15	Sharp blade for cutting soft tissue.
Latex gloves	MKD-Medicale	SANTEX-S	Protection equipment.
Mask	MKD-Medicale	21221	Protection equipment.
Petri dishes	MKD-Medicale	0598-1V	Materials for collecting ancillary testing samples.
Plastic recipients	Corning Gosselin	TP200-02	Materials for collecting histopathology samples.
Scale	ESPERANZA	MEEKS008	For weighing the organs.
Scale	White Deals	72	For weighing the subjects.
Scalpel	MKD-Medicale	10322E	Sharp blade for cutting soft tissue.
Scissors	MKD-Medicale	13-260	Dissection instruments.
Scrub	MKD-Medicale	410100-52	Protection equipment.
Syringes	MKD-Medicale	10573EU	Materials for collecting ancillary testing samples.