Techniques de dissection et échantillonnage histologique du cœur dans des modèles de grands animaux pour les maladies cardiovasculaires

Résumé

En raison de l’anatomie complexe, un protocole de dissection et de prélèvement reproductible de manière cohérente pour les échantillons cardiaques peut être difficile à mettre en œuvre. Ce manuscrit présente les éléments clés de certains protocoles standard de dissection cardiaque, en soulignant à la fois les approches d’examen global et les sites d’échantillonnage couramment utilisés pour l’examen histopathologique.

Résumé

L’examen et l’échantillonnage standard bruts sont des éléments clés de la reproductibilité et du succès des études expérimentales sur les maladies cardiovasculaires réalisées chez les grands animaux. Compte tenu de l’anatomie complexe du cœur, des différences inter-espèces et des types de réactions compensatoires et pathologiques, des protocoles cohérents sont difficiles à mettre en œuvre. L’utilisation de protocoles de dissection multiples est généralement adaptée à l’expérience du prosecteur, et les préférences personnelles continuent d’être une source de variabilité expérimentale et inter-observateurs. Ici, l’objectif est de présenter les principales caractéristiques anatomiques et les points de repère, les protocoles de dissection et les normes d’échantillonnage histologique du cœur chez certaines espèces couramment utilisées (y compris les chiens, les porcs, les ruminants et les chats) en tant que modèles de maladies cardiovasculaires.

Deux protocoles standard d’examen brut sont présentés ici. Premièrement, la méthode d’entrée-sortie, qui suit la direction physiologique du flux sanguin à travers le cœur et les gros vaisseaux (fréquemment utilisée chez les chiens, les ruminants et les porcs), et deuxièmement, la technique de dissection à quatre chambres (illustrée chez les chats). Les deux techniques peuvent être adaptées à n’importe quelle espèce dans certaines circonstances expérimentales. Les protocoles d’échantillonnage comprennent tous les domaines d’intérêt (ganglion sino-auriculaire, ventricules, septum interventriculaire, oreillettes, valves et aorte) et, s’ils sont correctement réalisés, améliorent à la fois la reproductibilité et la fiabilité des études expérimentales.

Introduction

En raison de l’anatomie complexe et de la rigueur précoce, qui peuvent interférer avec l’évaluation de l’épaisseur de la paroi cardiaque, l’examen grossier du cœur est difficile et sujet à plusieurs erreurs liées à la technique ou à l’interprétation. Ceci est amplifié par les variations morphologiques interspécifiques et par le fait que de nombreuses pathologies cardiaques cliniques majeures (y compris les cas précoces de maladies coronariennes, de fibrose, d’artérite et d’amylose) ne sont associées à aucun changement grossier, étant, par essence, des pathologies histologiques. Un protocole normalisé de dissection et de prélèvement d’échantillons histologiques peut assurer la cohérence entre les observateurs et, en même temps, la comparabilité et la reproductibilité des études expérimentales sur les maladies cardiovasculaires.

Les échantillons ont été prélevés sur deux chiens (Canis lupus familiaris) (un bouledogue mâle Français de 3 ans et une femelle mixte de 8 ans), un chat (Felis catus) (un mâle européen à poil court mâle de 6 ans), un porc domestique (Sus scrofa domesticus) (un mâle de 1 an, Grand Blanc) et une vache (Bos taurus) (une Holstein femelle de 2 mois). Chacune des espèces choisies a une utilisation particulière comme modèle cardiovasculaire pour une maladie différente; Par exemple, les chiens sont un modèle privilégié pour la modélisation de l’arythmie; les chats sont préférés pour la cardiomyopathie hypertrophique (CMH), car c’est l’espèce avec la prévalence la plus élevée de CMH; les porcs sont utilisés comme modèle pour l’infarctus aigu du myocarde; et les ruminants sont utilisés comme modèle d’intoxication en raison de leur exposition à des toxines que l’on peut facilement trouver dans les prairies¹¹.

Dans ce manuscrit, un protocole de nécropsie et deux protocoles de dissection du cœur sont présentés, conçus pour améliorer l’examen macroscopique et histologique du cœur dans les maladies cardiovasculaires expérimentales. Les protocoles décrits ont été élaborés à partir de l’information tirée des manuels vétérinaires 1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12, de la littérature des revues 3,13,14^, des documents officiels 15 et des webinaires ^{16 ,17}. Les échantillons utilisés dans cette étude ont été prélevés sur des cadavres soumis au département de pathologie de l’USAMV Cluj-Napoca pour le diagnostic autopsie de routine.

Protocole

Le protocole expérimental a reçu un accord de bioéthique (n ° 311 à partir de 2022) et a été approuvé par le Comité de bioéthique de l’Université des sciences agricoles et de médecine vétérinaire de Cluj-Napoca, conformément à la législation nationale (loi n ° 43 de 2014) et européenne (directive européenne n ° 63 de 2010). Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux et instruments utilisés dans ce protocole.

1. Protocole de nécropsie

NOTE : Il est recommandé d’utiliser le même protocole de nécropsie pour toutes les espèces présentées en raison de la facilité d’accès lorsqu’elle est effectuée ^2,12. Les étapes suivantes représentent la nécropsie effectuée chez un chien de taille moyenne. Adaptez les étapes lors de la réalisation de nécropsies sur différents sujets.

1. Pesez le sujet et placez-le sur la table de nécropsie à sa gauche (figure 1A). Procéder à l’examen externe du sujet (en inspectant et en palpant la cutis et les muqueuses, en notant tous les changements de couleur, de consistance et de volume).
2. Utilisez un couteau (ou un scalpel) et faites une incision de 7 cm à l’aisselle droite (Figure 1A).
3. Repérez la jonction coxofémorale (Figure 1A,B). Ouvrez la capsule avec un couteau. Couper le ligament de la tête du fémur (Figure 1B).
4. Utilisez le couteau pour étendre l’incision cutanée à l’aisselle crânienne jusqu’à la symphyse mandibulaire et caudale au périnée (Figure 1B).
5. Retirez la peau avec le scalpel et exposez la paroi thoracique et abdominale de la ligne médiane ventrale au niveau des processus transversaux vertébraux (Figure 1B).
6. Avec le scalpel et la pince, créez un lambeau à travers la paroi abdominale, ventrocaudal à l’arc costal droit. Ouvrez la cavité abdominale avec des ciseaux - suivez la face caudale de l’hypochondre droit (Figure 1B).
7. Étendre l’incision caudale le long de la zone paralombaire droite jusqu’à la crête iliaque externe. Ensuite, étendez l’incision jusqu’à l’insertion pubienne de la linea alba.
8. Brièvement, examinez les organes abdominaux in situ (en notant tout changement de couleur, de consistance, de volume et de position des organes).
9. Avec le scalpel et la pince, percer le diaphragme au point le plus élevé (Figure 1B).
10. Entrez dans la cavité thoracique en retirant la cage thoracique droite avec deux sections longitudinales à l’aide d’une pince à couper les os. Section du segment cartilagineux parasternal des côtes. Ensuite, sectionner le segment dorsal des côtes, proximal aux articulations costo-vertébrales (Figure 1C).
11. Examiner le cœur in situ (Figure 1C). Remarquez la taille, la position, la couleur, les connexions avec les tissus adjacents et, par palpation, tout changement dans la consistance⁹.
    NOTE : Si une thrombose ou une cardiopathie congénitale est présente, le cœur doit être disséqué in situ (cette approche permet un examen complet des gros vaisseaux).
12. Utilisez des ciseaux pour examiner et ouvrir la cavité péricardique avec une coupe longitudinale de la base à l’apex du cœur. Examiner la cavité péricardique et l’épicarde (en notant tout changement de couleur, de consistance et de volume)¹².
13. Relâchez le cœur avec des ciseaux, donnant des sections transversales de l’aorte, du tronc pulmonaire et des deux veines caves. Section de la veine cave supérieure à au moins 1 cm au-dessus de l’entrée dans l’atrium droit pour préserver la crista terminalis^11,13.
14. Examiner le contour externe de l’organe, l’aspect de l’épicarde, l’aspect du myocarde par la transparence de l’épicarde et l’aspect extérieur des gros vaisseaux (Figure 2A).
    NOTE: En général, l’ouverture et l’examen du péricarde présentent certaines différences entre les espèces. L’examen de la cavité péricardique commence par une inspection externe et une évaluation par la transparence du péricarde du contenu péricardique global ^1,2. Chez un chat ou un chien, le péricarde contient généralement environ 0,25 mL/kg de liquide mince, clair, translucide à jaune clair⁹. S’il y a des épanchements pathologiques, ils doivent être collectés avec une seringue stérile ou un tube vacutainer.

2. Protocole de dissection

NOTE: Plusieurs techniques de nécropsie sont utilisées pour le cœur, chacune avec plusieurs avantages. Pour ce protocole, deux des techniques les plus utilisées ont été choisies : 1) la « méthode entrée-sortie », qui permet un meilleur examen des valves et de l’endocarde et est un protocole utilisé pour la plupart des espèces 2,11,12,16, et²) la technique de « dissection à quatre chambres »/« plan échocardiographique », typiquement utilisée pour les chats ou les chiens de petite taille ^{1, 17}.

1. La « méthode entrée-sortie » pour le curage cardiaque 2,11,12,16
   1. Placez le cœur avec le visage auriculaire vers le haut (Figure 2A).
   2. Utilisez des ciseaux et des pinces édentées pour couper largement de la veine cave caudale jusqu’à l’oreillette droite (figure 2B). Continuez la coupe vers l’appendice auriculaire droit pour exposer le ganglion crista terminalis/sino-auriculaire (nœud SA). Inspectez la valve tricuspide de la vue dorsale.
   3. Couper une section de l’oreillette droite jusqu’à la jonction entre le ventricule droit et le septum interventriculaire (figure 2C). Affichez la valve auriculo-ventriculaire droite.
   4. Section de la paroi libre du ventricule droit le long du septum interventriculaire. Poursuivre la section jusqu’à l’origine du tronc pulmonaire (figure 2C,D).
   5. Examinez attentivement les valves auriculo-ventriculaires droites, y compris les tendineuses chormiques, et les muscles papillaires (Figure 2D). Couper les cordes tendineuses.
   6. Placez une pince dans le tronc pulmonaire et coupez le tronc longitudinalement (figure 2E). Examinez la voie d’écoulement pulmonaire, l’origine du tronc pulmonaire et les valves semi-lunaires.
   7. Coupez l’oreillette gauche des veines pulmonaires jusqu’à l’extrémité de l’oreillette gauche (figure 2F). Inspectez la valve bicuspide (mitrale) de la vue dorsale.
   8. Placez le cœur avec le septum interventriculaire tourné vers le bas (Figure 2F). Faites une grande incision dans la paroi libre ventriculaire de la base du ventricule à l’apex cardiaque. Affichez complètement la valve auriculo-ventriculaire gauche.
   9. Couper les cordes tendineuses de la cuspide de la valve auriculo-ventriculaire gauche.
   10. Placez une pince dans le tractus de sortie ventriculaire gauche et utilisez-la comme guide pour ouvrir l’aorte (Figure 2G).
   11. Utilisez une solution saline pour éliminer tous les caillots sanguins. Une fois que tous les caillots sanguins sont retirés, évaluer et comparer le poids cardiaque à la masse corporelle ou aux tableaux de poids cardiaque standard (tableau 1)^11,13.
   12. Pesez le cœur.
   13. Si seul le nœud SA est le point d’intérêt, après l’examen du ventricule gauche, placez le cœur entier entièrement dans du formol tamponné neutre à 10% (FBN) pendant 24 h et coupez l’oreillette droite pour échantillonner la crista terminalis.
       NOTE: Par cette technique, les ventricules gauche et droit peuvent être facilement appréciés. Le rapport entre l’épaisseur de la paroi ventriculaire gauche et droite est de 3:1, avec de petites différences selon l’espèce et la race; Pour le cœur de fœtus animal, le rapport est de 1: 1¹².

3. Protocole d’échantillonnage pour l’histologie¹⁶

1. À l’aide d’un scalpel, effectuer deux coupes longitudinales parallèles (distantes d’environ 5 mm) impliquant l’oreillette droite, la valve tricuspide et la paroi libre ventriculaire droite (figure 2I).
2. Faites deux coupes longitudinales parallèles (distantes d’environ 5 mm) impliquant l’oreillette gauche, la valve mitrale, le muscle papillaire dorsal et le ventricule gauche (figure 2H).
3. Dans le tiers supérieur dorsal du cœur, couper transversalement la base du cœur en suivant une ligne, y compris la cloison interventriculaire, l’oreillette droite, l’aorte, la valve aortique et la valve tricuspide (figure 2J).
4. Effectuer deux coupes longitudinales parallèles impliquant la base de l’aorte et le septum interventriculaire (figure 2J).
5. Couper l’oreillette droite autour de la crista terminalis et prévoir plusieurs sections parallèles orientées transversalement sur l’axe longitudinal de la crista (distantes d’environ 3-4 mm) pour obtenir six parties du nœud SA (Figure 3, Figure 4I et Figure 5H).
6. Couper les tissus obtenus dans des cassettes histologiques.
   REMARQUE : Protocole de blocage recommandé : étape 3.1.-bloc histologique 1 (la figure 6 montre la diapositive résultante de ce bloc.), étape 3.2.-bloc histologique 2 (la figure 7 montre la diapositive résultante de ce bloc), étape 3.4.-bloc histologique 3 (la figure 8 montre la diapositive résultante de ce bloc), étape 3.5.-bloc histologique 4 (figure 9 montre la diapositive résultante de ce bloc).
7. Immerger les tissus dans 10% NBF pendant au moins 48 h.

4. Échantillonnage des artères coronaires 3,10,14

1. Utilisez une pince et un scalpel pour disséquer les artères coronaires du sillon paraconal cardiaque (figure 4K). Fixez l’artère coronaire pendant la nuit dans 10% NBF.
2. Si nécessaire, décalcifier adéquatement dans un mélange 1:1 d’acide formique à 8% et d’acide chlorhydrique.
3. Faites plusieurs coupes transversales à des intervalles de 3 mm. Placez les sections dans une cassette, puis mettez la cassette dans 10% NBF jusqu’à l’incorporation.
   REMARQUE: Les porcs peuvent être utilisés comme modèle cardiaque pour les humains, en particulier lorsqu’il s’agit de maladies coronariennes. Par conséquent, des échantillons supplémentaires et des coupes histologiques d’artères coronaires sont recommandés 3,10,14.

5. La technique de dissection « à quatre chambres »/« plan échocardiographique » du cœur ^1,17

NOTE: La technique de dissection à quatre chambres consiste en une coupe de la base à l’apex du cœur pour obtenir la vue standard¹. La technique « à quatre chambres » est mieux appliquée aux tissus fixes.

1. Placez le cœur entier dans 10% NBF pendant au moins 48 h.
2. Une fois que le cœur est fixé dans 10 % de FBN pendant au moins 48 h (figure 10A), placez deux pinces à dissection droites édentées, l’une dans le ventricule droit de la valve cava-oreillette tricuspide droite et l’autre dans la veine pulmonaire-valve mitrium-mitrine gauche-ventricule gauche (figure 10B).
3. Utilisez l’espace entre les bras de la pince comme guide pour la lame de coupe de la base à l’apex du cœur (figure 10C). Fournir une section longitudinale supplémentaire distante d’environ 5 mm de la section décrite à l’étape 5.2. sur le segment cardiaque, qui comprend l’aorte.
4. Avec une incision transversale, séparez complètement la base cardiaque de l’apex. Placez chaque segment de tissu dans une cassette histologique.
   REMARQUE : Protocole de blocage recommandé : le bloc apex-histologique cardiaque 5 (la figure 11A montre la lame résultante de ce bloc), le bloc histologique 6 de base cardiaque (la figure 11B montre la lame résultante de ce bloc).
5. Placer les cassettes dans 10% NBF jusqu’à l’encastrement. Fixer tous les échantillons cardiaques dans 10% NBF (plus de 10 fois le volume de tissu), les traiter systématiquement dans de la cire de paraffine, section à 4 μm d’épaisseur, et colorer avec de l’hématoxyline et de l’éosine (coloration H & E) en suivant un protocole précédemment décrit¹⁰.
   REMARQUE : En cas de suspicion de myocardite, « un morceau de tissu cardiaque frais doit être conservé dans des conditions stériles avec du matériel chirurgical stérile et un récipient d’échantillon stérile pour les études microbiologiques et virales »¹³.

6. Documentation photographique

REMARQUE : La documentation photographique est une étape facultative de l’examen de nécropsie. Cependant, la photographie et les enregistrements vidéo sont essentiels pour avoir une « documentation précise de l’anatomie normale et anormale »³.

1. Pour une documentation photographique appropriée, prenez des images numériques tout en effectuant une « dissection progressive des tissus cardiaques »¹³. Se référer aux lignes directrices pour la documentation photographique et photographier¹⁵ la vue générale antérieure et postérieure; une tranche de cœur; et toute lésion suspectée.

Résultats

Ce protocole a été utilisé pour visualiser les caractéristiques anatomiques et recueillir des échantillons pour l’examen histologique du cœur chez quatre espèces différentes (chien, chat, porc et vache). Le protocole de nécropsie a été répété chez chacune des espèces susmentionnées, mais illustré uniquement chez les chiens. Le protocole de nécropsie commence par un examen externe approfondi du corps (figure 1A) (y compris la peau, les ganglions lymphatiques explorables et...

Discussion

Lors de l’exécution du protocole actuel, plusieurs étapes critiques doivent être soigneusement prises en compte pour obtenir des résultats cohérents. Chez les jeunes animaux, les mesures cardiaques sont différentes de celles des adultes (y compris l’épaisseur de la paroi ventriculaire) et, en général, le cœur représente une plus grande proportion du poids corporel^11,12. Le degré d’hypertrophie ventriculaire peut être quantifié en appliquant un...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline solution	B. BRAUN MELSUNGEN AG	W04479004	For washing all the blood, and blood clots from the heart.
10% neutral buffered formalin (NBF)	Q Path	11699404	Materials for collecting histopathology samples.
Bone cutting forceps	HELEN SRL	LS109HV	Sturdy instrument for cutting bone.
Cutting board	Ambition	86304	For an easier manipulation, and cutting the organs.
Decalcifying solution	Thermo Scientific TBD-2	6764004	1:1 mixture of 8% formic acid and hydrochloric acid.
Digital camera	Canon Inc.	PowerShot SX540 HS	For photographic, and videographic documentation.
Forceps	MKD-Medicale	15-430	Dissection instruments.
Histological cassettes	Q Path	720-2215	Materials for collecting histopathology samples. Dimensions: 3 × 2.5 × 0.4 cm
Knife	TEHNO FOOD COM SERV SRL	D2006/15	Sharp blade for cutting soft tissue.
Latex gloves	MKD-Medicale	SANTEX-S	Protection equipment.
Mask	MKD-Medicale	21221	Protection equipment.
Petri dishes	MKD-Medicale	0598-1V	Materials for collecting ancillary testing samples.
Plastic recipients	Corning Gosselin	TP200-02	Materials for collecting histopathology samples.
Scale	ESPERANZA	MEEKS008	For weighing the organs.
Scale	White Deals	72	For weighing the subjects.
Scalpel	MKD-Medicale	10322E	Sharp blade for cutting soft tissue.
Scissors	MKD-Medicale	13-260	Dissection instruments.
Scrub	MKD-Medicale	410100-52	Protection equipment.
Syringes	MKD-Medicale	10573EU	Materials for collecting ancillary testing samples.