Dissektionstechniken und histologische Probenahme des Herzens in Großtiermodellen für Herz-Kreislauf-Erkrankungen

Zusammenfassung

Aufgrund der komplexen Anatomie kann ein konsistent reproduzierbares Dissektions- und Entnahmeprotokoll für Herzproben schwierig umzusetzen sein. Dieses Manuskript präsentiert die Schlüsselelemente einiger Standardprotokolle zur kardialen Dissektion und hebt sowohl die groben Untersuchungsansätze als auch die üblicherweise für histopathologische Untersuchungen verwendeten Probenahmestellen hervor.

Zusammenfassung

Die Standard-Bruttountersuchung und Probenahme sind Schlüsselelemente für die Reproduzierbarkeit und den Erfolg experimenteller Studien zu Herz-Kreislauf-Erkrankungen an Großtieren. In Anbetracht der komplexen Anatomie des Herzens, der Unterschiede zwischen den Arten und der Arten von kompensatorischen und pathologischen Reaktionen sind konsistente Protokolle schwierig zu implementieren. Die Verwendung mehrerer Dissektionsprotokolle wird in der Regel an die Erfahrung des Prosektors angepasst, und persönliche Präferenzen sind weiterhin eine Quelle experimenteller und interobserver-Variabilität. Ziel ist es, die wichtigsten anatomischen Merkmale und Orientierungspunkte, Sezierprotokolle und histologischen Probenahmestandards des Herzens bei einigen häufig verwendeten Arten (einschließlich Hunden, Schweinen, Wiederkäuern und Katzen) als Modelle für Herz-Kreislauf-Erkrankungen darzustellen.

Zwei Standard-Bruttoprüfungsprotokolle werden hier vorgestellt. Erstens die Zufluss-Abfluss-Methode, die der physiologischen Blutflussrichtung durch das Herz und große Gefäße folgt (häufig bei Hunden, Wiederkäuern und Schweinen verwendet), und zweitens die Vierkammer-Dissektionstechnik (am Beispiel bei Katzen). Beide Techniken können unter bestimmten experimentellen Bedingungen an jede Art angepasst werden. Die Probenahmeprotokolle umfassen alle relevanten Bereiche (Sinusknoten, Ventrikel, interventrikuläres Septum, Vorhöfe, Klappen und Aorta) und verbessern bei ordnungsgemäßer Durchführung sowohl die Reproduzierbarkeit als auch die Zuverlässigkeit experimenteller Studien.

Einleitung

Aufgrund der komplexen Anatomie und frühen Strenge, die die Beurteilung der Herzwanddicke beeinträchtigen können, ist die grobe Untersuchung des Herzens anspruchsvoll und anfällig für mehrere Technik- oder Interpretationsfehler. Dies wird durch die interspezifischen morphologischen Variationen und durch die Tatsache verstärkt, dass viele klinische, schwere Herzpathologien (einschließlich früher Fälle von koronaren Herzkrankheiten, Fibrose, Arteriitis und Amyloidose) nicht mit groben Veränderungen verbunden sind, sondern im Wesentlichen histologische Pathologien sind. Ein standardisiertes Dissektions- und histologisches Probenentnahmeprotokoll kann Konsistenz zwischen den Beobachtern und gleichzeitig Vergleichbarkeit und Reproduzierbarkeit experimenteller Studien zu Herz-Kreislauf-Erkrankungen herstellen.

Die Proben wurden von zwei Hunden (Canis lupus familiaris) (einer 3-jährigen, männlichen französischen Bulldogge und einem 8-jährigen, weiblichen Mischling), einer Katze (Felis catus) (einem 6-jährigen, männlichen Kurzhaar), einem Hausschwein (Sus scrofa domesticus) (einem 1-jährigen, männlichen Large White) und einer Kuh (Bos taurus) (einem 2 Monate alten, weiblichen Holstein) entnommen. Jede der ausgewählten Arten hat eine besondere Verwendung als kardiovaskuläres Modell für eine andere Krankheit; Zum Beispiel sind Hunde ein bevorzugtes Modell für die Arrhythmie-Modellierung; Katzen werden für hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) bevorzugt, da es sich um die Spezies mit der höchsten Prävalenz von HCM handelt; Schweine werden als Modell für akuten Myokardinfarkt verwendet; und Wiederkäuer werden als Modell für Intoxikationen verwendet, da sie Toxinen ausgesetzt sind, die auf Wiesen leicht zu finden sind¹¹.

In diesem Manuskript werden ein Nekropsieprotokoll und zwei Dissektionsprotokolle des Herzens vorgestellt, die die grobe und histologische Untersuchung des Herzens bei experimentellen Herz-Kreislauf-Erkrankungen verbessern sollen. Die beschriebenen Protokolle wurden auf der Grundlage von Informationen aus den veterinärmedizinischen Lehrbüchern 1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12, Zeitschriftenliteratur 3,13,14^, offiziellen Dokumenten ¹⁵ und Webinaren¹⁶ entwickelt. ^,17. Die in dieser Studie verwendeten Proben wurden von Kadavern entnommen, die der Pathologieabteilung der USAMV Cluj-Napoca zur routinemäßigen Autopsiediagnose vorgelegt wurden.

Protokoll

Das Versuchsprotokoll erhielt eine bioethische Vereinbarung (Nr. 311 von 2022) und wurde von der Bioethikkommission der Universität für Agrarwissenschaften und Veterinärmedizin Cluj-Napoca in Übereinstimmung mit den nationalen (Gesetz Nr. 43 von 2014) und europäischen (EU-Richtlinie Nr. 63 von 2010) Gesetzgebung genehmigt. Einzelheiten zu allen in diesem Protokoll verwendeten Materialien und Instrumenten finden Sie in der Materialtabelle .

1. Nekropsie-Protokoll

HINWEIS: Es wird empfohlen, für alle vorgestellten Arten dasselbe Nekropsieprotokoll zu verwenden, da der Zugang erleichtert ist als bei ^2,12. Die folgenden Schritte stellen die Nekropsie dar, die bei einem mittelgroßen Hund durchgeführt wird. Passen Sie die Schritte an, wenn Sie Nekropsien zu verschiedenen Themen durchführen.

1. Wiegen Sie das Subjekt und legen Sie es auf den Nekropsietisch auf der linken Seite (Abbildung 1A). Fahren Sie mit der äußeren Untersuchung des Subjekts fort (durch Inspektion und Palpation der Cutis und Schleimhäute, wobei alle Veränderungen in Farbe, Konsistenz und Volumen notiert werden).
2. Verwenden Sie ein Messer (oder ein Skalpell) und machen Sie einen Schnitt von 7 cm in der rechten Achselhöhle (Abbildung 1A).
3. Suchen Sie die coxofemorale Verbindung (Abbildung 1A,B). Öffnen Sie die Kapsel mit einem Messer. Schneiden Sie das Band des Oberschenkelknochens ab (Abbildung 1B).
4. Verwenden Sie das Messer, um den Hautschnitt in der Achselhöhle kranial zur Unterkiefersymphyse und kaudal zum Perineum zu verlängern (Abbildung 1B).
5. Entfernen Sie die Haut mit dem Skalpell und legen Sie die Brust- und Bauchdecke von der ventralen Mittellinie bis zur Höhe der Wirbelfortsätze frei (Abbildung 1B).
6. Erstellen Sie mit dem Skalpell und der Pinzette eine Klappe durch die Bauchdecke, ventrocaudal zum rechten Rippenbogen. Öffnen Sie die Bauchhöhle mit einer Schere-folgen Sie dem kaudalen Aspekt des rechten Hypochondriums (Abbildung 1B).
7. Verlängern Sie den Schnitt kaudal entlang des rechten paralumbalen Bereichs bis zum äußeren Beckenkamm. Danach verlängern Sie den Schnitt bis zum Schambein der Linea alba.
8. Untersuchen Sie kurz die Bauchorgane in situ (indem Sie Änderungen in Farbe, Konsistenz, Volumen und Position der Organe feststellen).
9. Durchstechen Sie mit dem Skalpell und der Pinzette das Zwerchfell am höchsten Punkt (Abbildung 1B).
10. Treten Sie in die Brusthöhle ein, indem Sie den rechten Brustkorb mit zwei Längsabschnitten mit Knochenschneidzange entfernen. Schneiden Sie das parasternale knorpelige Segment der Rippen. Als nächstes schneiden Sie das dorsale Segment der Rippen, proximal zu den costovertebralen Gelenken (Abbildung 1C).
11. Untersuchen Sie das Herz in situ (Abbildung 1C). Beachten Sie die Größe, Position, Farbe, Verbindungen mit den angrenzenden Geweben und durch Palpation Änderungen in der Konsistenz⁹.
    HINWEIS: Wenn eine Thrombose oder angeborene Herzkrankheit vorliegt, muss das Herz in situ seziert werden (dieser Ansatz ermöglicht eine vollständige Untersuchung der großen Gefäße).
12. Verwenden Sie eine Schere, um die Perikardhöhle mit einem Längsschnitt von der Basis bis zur Herzspitze zu untersuchen und zu öffnen. Untersuchen Sie die Perikardhöhle und das Epikard (beachten Sie alle Veränderungen in Farbe, Konsistenz und Volumen)¹².
13. Lassen Sie das Herz mit einer Schere los, wodurch Querschnitte der Aorta, des Lungenstamms und der beiden Hohlvenen entstehen. Schneiden Sie die obere Hohlvene mindestens 1 cm über dem Eingang in das rechte Vorhof, um die Crista terminalis^11,13 zu erhalten.
14. Untersuchen Sie die äußere Kontur des Organs, das Aussehen des Epikards, das Aussehen des Myokards durch die Transparenz des Epikards und das äußere Erscheinungsbild der großen Gefäße (Abbildung 2A).
    HINWEIS: Im Allgemeinen weisen die Öffnung und Untersuchung des Perikards einige Unterschiede zwischen den Arten auf. Die Untersuchung der Perikardhöhle beginnt mit einer externen Inspektion und Beurteilung durch die Transparenz des Perikards des gesamten Perikardinhalts ^1,2. Bei einer Katze oder einem Hund enthält das Perikard typischerweise etwa 0,25 ml/kg dünne, klare, durchscheinende bis hellgelbe Flüssigkeit⁹. Wenn pathologische Ergüsse auftreten, sollten diese mit einer sterilen Spritze oder einem Vakuumröhrchen gesammelt werden.

2. Sezierprotokoll

HINWEIS: Mehrere Nekropsietechniken werden für das Herz verwendet, jede mit mehreren Vorteilen. Für dieses Protokoll wurden zwei der am häufigsten verwendeten Techniken gewählt: 1) die "Zufluss-Ausfluss-Methode", die eine bessere Untersuchung der Klappen und des Endokards ermöglicht und ein Protokoll ist, das für die meisten der Spezies 2,11,12,16 verwendet wird, und²) die "Vier-Kammer-Dissektion"/"echokardiographische Ebene" -Technik, die typischerweise für Katzen oder kleine Hunde verwendet wird ^{1, 17}.

1. Die "Zufluss-Abfluss-Methode" bei Herzdissektion 2,11,12,16
   1. Legen Sie das Herz mit dem Vorhofgesicht nach oben (Abbildung 2A).
   2. Schneiden Sie mit einer Schere und einer zahnlosen Pinzette breit von der kaudalen Hohlvene in den rechten Vorhof (Abbildung 2B). Setzen Sie den Schnitt zum rechten Ohranhang fort, um den Crista terminalis/sinoatrialen Knoten (SA-Knoten) freizulegen. Untersuchen Sie die Trikuspidalklappe aus der dorsalen Ansicht.
   3. Schneiden Sie einen Abschnitt vom rechten Vorhof bis zur Verbindung zwischen dem rechten Ventrikel und dem interventrikulären Septum ab (Abbildung 2C). Zeigen Sie die rechte atrioventrikuläre Klappe an.
   4. Schneiden Sie die rechte ventrikelfreie Wand entlang des interventrikulären Septums. Fahren Sie mit dem Abschnitt bis zum Ursprung des Lungenstamms fort (Abbildung 2C,D).
   5. Untersuchen Sie gründlich die rechten atrioventrikulären Klappen, einschließlich der Chordae tendineae, und die Papillarmuskeln (Abbildung 2D). Schneiden Sie die Chordae tendineae.
   6. Legen Sie eine Pinzette durch den Lungenstamm und schneiden Sie den Rumpf längs (Abbildung 2E). Untersuchen Sie den Lungenausflusstrakt, den Ursprung des Lungenstamms und die halbmondförmigen Klappen.
   7. Schneiden Sie den linken Vorhof von den Lungenvenen bis zur Spitze der linken Ohrmuschel ab (Abbildung 2F). Untersuchen Sie die Bikuspidalklappe (Mitralklappe) aus der dorsalen Ansicht.
   8. Legen Sie das Herz mit dem interventrikulären Septum nach unten (Abbildung 2F). Machen Sie einen großen Schnitt in der ventrikulären freien Wand von der Basis des Ventrikels bis zur Herzspitze. Zeigen Sie die linke atrioventrikuläre Klappe vollständig an.
   9. Schneiden Sie die Chordae tendineae von der Spitze der linken atrioventrikulären Klappe ab.
   10. Legen Sie eine Pinzette durch den linksventrikulären Ausflusstrakt und verwenden Sie sie als Führung, um die Aorta zu öffnen (Abbildung 2G).
   11. Verwenden Sie Kochsalzlösung, um alle Blutgerinnsel zu entfernen. Sobald alle Blutgerinnsel entfernt sind, beurteilen und vergleichen Sie das Herzgewicht mit der Körpermasse oder den Standard-Herzgewichtstabellen (Tabelle 1) ^11,13.
   12. Wiegen Sie das Herz.
   13. Wenn nur der SA-Knoten der Punkt von Interesse ist, legen Sie nach der Untersuchung des linken Ventrikels das gesamte Herz für 24 Stunden vollständig in 10% neutral-gepuffertes Formalin (NBF) und trimmen Sie den rechten Vorhof, um die Crista terminalis zu entnehmen.
       HINWEIS: Durch diese Technik können die linken und rechten Ventrikel leicht geschätzt werden. Das Verhältnis zwischen der linken und rechten Ventrikelwandstärke beträgt 3:1, mit kleinen Unterschieden je nach Art und Rasse; Für das Herz des tierischen Fötus beträgt das Verhältnis 1: 1¹².

3. Probenahmeprotokoll für die Histologie¹⁶

1. Führen Sie mit einem Skalpell zwei parallele Längsschnitte (im Abstand von ca. 5 mm) durch, die den rechten Vorhof, die Trikuspidalklappe und die rechte ventrikuläre freie Wand betreffen (Abbildung 2I).
2. Führen Sie zwei parallele Längsschnitte (im Abstand von ca. 5 mm) durch, die den linken Vorhof, die Mitralklappe, den dorsalen Papillenmuskel und den linken Ventrikel betreffen (Abbildung 2H).
3. Innerhalb des dorsalen oberen Drittels des Herzens transversal die Basis des Herzens einer Linie folgend, einschließlich des interventrikulären Septums, des rechten Vorhofs, der Aorta, der Aortenklappe und der Trikuspidalklappe (Abbildung 2J).
4. Führen Sie zwei längs parallele Schnitte durch, die die Basis der Aorta und das interventrikuläre Septum betreffen (Abbildung 2J).
5. Trimmen Sie das rechte Atrium um die Crista-Terminalis und sorgen Sie für mehrere parallele Abschnitte, die quer auf der Längsachse der Crista (etwa 3-4 mm voneinander entfernt) ausgerichtet sind, um sechs Teile des SA-Knotens zu erhalten (Abbildung 3, Abbildung 4I und Abbildung 5H).
6. Schneiden Sie die erhaltenen Gewebe in histologischen Kassetten.
   HINWEIS: Empfohlenes Blockierungsprotokoll: Schritt 3.1.-histologischer Block 1 (Abbildung 6 zeigt die resultierende Folie aus diesem Block.), Schritt 3.2.-histologischer Block 2 (Abbildung 7 zeigt die resultierende Folie aus diesem Block), Schritt 3.4.-histologischer Block 3 (Abbildung 8 zeigt die resultierende Folie aus diesem Block), Schritt 3.5.-histologischer Block 4 (Abbildung 9 zeigt die resultierende Folie aus diesem Block).
7. Tauchen Sie das Gewebe für mindestens 48 h in 10% NBF.

4. Probenahme der Koronararterien 3,10,14

1. Verwenden Sie eine Pinzette und ein Skalpell, um die Koronararterien von der kardialen parakonalen Rille zu trennen (Abbildung 4K). Fixieren Sie die Koronararterie über Nacht in 10% NBF.
2. Bei Bedarf in einer 1:1-Mischung aus 8% Ameisensäure und Salzsäure ausreichend entkalken.
3. Führen Sie mehrere Querschnitte im Abstand von 3 mm durch. Legen Sie die Abschnitte in eine Kassette und legen Sie die Kassette dann bis zum Einbetten in 10% NBF.
   HINWEIS: Schweine können als Herzmodell für Menschen verwendet werden, insbesondere wenn es um koronare Herzkrankheit geht. Daher werden zusätzliche Proben und histologische Abschnitte der Koronararterien empfohlen 3,10,14.

5. Die Dissektionstechnik "vier Kammern"/"echokardiographische Ebene" des Herzens ^1,17

HINWEIS: Die Vierkammer-Dissektionstechnik besteht aus einem Schnitt von der Basis bis zur Spitze des Herzens, um die Standardansicht¹ zu erhalten. Die "Vierkammer" -Technik wird am besten auf fixiertes Gewebe angewendet.

1. Legen Sie das ganze Herz für mindestens 48 h in 10% NBF.
2. Nachdem das Herz mindestens 48 h lang in 10% NBF fixiert wurde (Abbildung 10A), platzieren Sie zwei zahnlose gerade Dissektionszangen, eine durch die Schädelhöhle-rechte Vorhof-Trikuspidalklappe-rechte Herzkammer und die zweite durch die Lungenvene-linke Atrium-Mitralklappe-linke Herzkammer (Abbildung 10B).
3. Verwenden Sie den Abstand zwischen den Pinzettenarmen als Führung für die Schneidklinge von der Basis bis zur Spitze des Herzens (Abbildung 10C). Ist ein zusätzlicher Längsschnitt vorgesehen, der etwa 5 mm von dem in Schritt 5.2 beschriebenen Abschnitt abweicht. auf dem Herzsegment, das die Aorta umfasst.
4. Trennen Sie mit einem transversalen Schnitt die Herzbasis vollständig von der Spitze. Legen Sie jedes Gewebesegment in eine histologische Kassette.
   HINWEIS: Empfohlenes Blockierungsprotokoll: der kardiale Apex-histologische Block 5 (Abbildung 11A zeigt den resultierenden Objektträger aus diesem Block), der kardiale Basishistologische Block 6 (Abbildung 11B zeigt den resultierenden Objektträger aus diesem Block).
5. Legen Sie die Kassetten bis zum Einbetten in 10% NBF. Fixieren Sie alle Herzproben in 10% NBF (mehr als das 10-fache des Gewebevolumens), verarbeiten Sie sie routinemäßig in Paraffinwachs, Schnitt bei 4 μm Dicke, und färben Sie sie mit Hämatoxylin und Eosin-Färbung (H & E-Färbung) nach einem zuvor beschriebenen Protokoll¹⁰.
   HINWEIS: Bei Verdacht auf Myokarditis "sollte ein Stück frisches Herzgewebe unter sterilen Bedingungen mit sterilem chirurgischem Material und sterilem Probenbehälter für mikrobiologische und virale Studien aufbewahrt werden"¹³.

6. Fotografische Dokumentation

HINWEIS: Die fotografische Dokumentation ist ein optionaler Schritt in der Nekropsieuntersuchung. Foto- und Videoaufnahmen sind jedoch unerlässlich, um eine "genaue Dokumentation der normalen und abnormalen Anatomie^{" zu} haben3.

1. Für eine ordnungsgemäße fotografische Dokumentation nehmen Sie digitale Bilder auf, während Sie eine "progressive Dissektion des Herzgewebes" ^{durchführen13}. Siehe die Richtlinien für die fotografische Dokumentation und Fotografie¹⁵ die allgemeine Ansicht - vordere und hintere; eine Scheibe des Herzens; und alle vermuteten Läsionen.

Ergebnisse

Dieses Protokoll wurde verwendet, um anatomische Merkmale zu visualisieren und Proben für die histologische Untersuchung des Herzens in vier verschiedenen Arten (Hund, Katze, Schwein und Kuh) zu sammeln. Das Nekropsieprotokoll wurde bei jeder der oben genannten Arten wiederholt, aber nur bei Hunden veranschaulicht. Das Nekropsieprotokoll beginnt mit einer umfassenden externen Untersuchung des Körpers (Abbildung 1A) (einschließlich der Haut, der erforschbaren Lymphknoten und der äußeren ...

Diskussion

Bei der Durchführung des aktuellen Protokolls sollten mehrere kritische Schritte sorgfältig berücksichtigt werden, um konsistente Ergebnisse zu erzielen. Bei jungen Tieren unterscheiden sich die Herzmessungen von denen bei Erwachsenen (einschließlich der ventrikulären Wanddicke), und im Allgemeinen macht das Herz einen größeren Anteil des Körpergewichts aus^11,12. Der Grad der ventrikulären Hypertrophie kann durch Anwendung einer allgemeinen Gewichtsforme...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline solution	B. BRAUN MELSUNGEN AG	W04479004	For washing all the blood, and blood clots from the heart.
10% neutral buffered formalin (NBF)	Q Path	11699404	Materials for collecting histopathology samples.
Bone cutting forceps	HELEN SRL	LS109HV	Sturdy instrument for cutting bone.
Cutting board	Ambition	86304	For an easier manipulation, and cutting the organs.
Decalcifying solution	Thermo Scientific TBD-2	6764004	1:1 mixture of 8% formic acid and hydrochloric acid.
Digital camera	Canon Inc.	PowerShot SX540 HS	For photographic, and videographic documentation.
Forceps	MKD-Medicale	15-430	Dissection instruments.
Histological cassettes	Q Path	720-2215	Materials for collecting histopathology samples. Dimensions: 3 × 2.5 × 0.4 cm
Knife	TEHNO FOOD COM SERV SRL	D2006/15	Sharp blade for cutting soft tissue.
Latex gloves	MKD-Medicale	SANTEX-S	Protection equipment.
Mask	MKD-Medicale	21221	Protection equipment.
Petri dishes	MKD-Medicale	0598-1V	Materials for collecting ancillary testing samples.
Plastic recipients	Corning Gosselin	TP200-02	Materials for collecting histopathology samples.
Scale	ESPERANZA	MEEKS008	For weighing the organs.
Scale	White Deals	72	For weighing the subjects.
Scalpel	MKD-Medicale	10322E	Sharp blade for cutting soft tissue.
Scissors	MKD-Medicale	13-260	Dissection instruments.
Scrub	MKD-Medicale	410100-52	Protection equipment.
Syringes	MKD-Medicale	10573EU	Materials for collecting ancillary testing samples.