Tecniche di dissezione e campionamento istologico del cuore in modelli animali di grandi dimensioni per malattie cardiovascolari

Riepilogo

A causa della complessa anatomia, un protocollo di dissezione e raccolta costantemente riproducibile per campioni cardiaci può essere difficile da implementare. Questo manoscritto presenta gli elementi chiave di alcuni protocolli standard di dissezione cardiaca, evidenziando sia gli approcci di esame grossolano che i siti di campionamento comunemente utilizzati per l'esame istopatologico.

Abstract

L'esame e il campionamento standard sono elementi chiave per la riproducibilità e il successo degli studi sperimentali sulle malattie cardiovascolari condotti su animali di grossa taglia. Considerando la complessa anatomia del cuore, le differenze interspecie e i tipi di reazioni compensative e patologiche, i protocolli coerenti sono difficili da implementare. L'utilizzo di protocolli di dissezione multipli è solitamente adattato per adattarsi all'esperienza del prosettore e le preferenze personali continuano ad essere una fonte di variabilità sperimentale e interosservatore. Qui, l'obiettivo è quello di presentare le principali caratteristiche anatomiche e punti di riferimento, i protocolli di dissezione e gli standard di campionamento istologico del cuore in alcune specie comunemente usate (tra cui cani, maiali, ruminanti e gatti) come modelli di malattie cardiovascolari.

Qui vengono presentati due protocolli standard di esame lordo. In primo luogo, il metodo di afflusso-deflusso, che segue la direzione fisiologica del flusso sanguigno attraverso il cuore e i grandi vasi (frequentemente usato in cani, ruminanti e maiali), e in secondo luogo, la tecnica di dissezione a quattro camere (esemplificata nei gatti). Entrambe le tecniche possono essere adattate a qualsiasi specie in determinate circostanze sperimentali. I protocolli di campionamento comprendono tutte le aree di interesse (nodo senoatriale, ventricoli, setto interventricolare, atri, valvole e aorta) e, se correttamente eseguiti, migliorano sia la riproducibilità che l'affidabilità degli studi sperimentali.

Introduzione

A causa della complessa anatomia e del rigore precoce, che possono interferire con la valutazione dello spessore della parete cardiaca, l'esame grossolano del cuore è impegnativo e soggetto a diversi errori tecnici o di interpretazione. Ciò è amplificato dalle variazioni morfologiche interspecifiche e dal fatto che molte patologie cardiache cliniche e importanti (compresi i primi casi di malattie coronariche, fibrosi, arterite e amiloidosi) non sono associate ad alcun cambiamento grossolano, essendo, in sostanza, patologie istologiche. Un protocollo standardizzato di dissezione e prelievo istologico dei campioni può portare coerenza tra gli osservatori e, allo stesso tempo, comparabilità e riproducibilità degli studi sperimentali sulle malattie cardiovascolari.

I campioni sono stati raccolti da due cani (Canis lupus familiaris) (un Bulldog francese maschio di 3 anni e un meticcio femmina di 8 anni), un gatto (Felis catus) (un maschio europeo di 6 anni), un maiale domestico (Sus scrofa domesticus) (un maschio Large White di 1 anno) e una mucca (Bos taurus) (una femmina Holstein di 2 mesi). Ciascuna delle specie scelte ha un uso particolare come modello cardiovascolare per una diversa malattia; Ad esempio, i cani sono un modello preferito per la modellazione dell'aritmia; i gatti sono preferiti per la cardiomiopatia ipertrofica (HCM), in quanto è la specie con la più alta prevalenza di HCM; i maiali sono usati come modello per l'infarto miocardico acuto; E i ruminanti sono usati come modello per l'intossicazione a causa della loro esposizione a tossine che possono essere facilmente trovate sui prati¹¹.

In questo manoscritto vengono presentati un protocollo necroscopico e due protocolli di dissezione del cuore, progettati per migliorare l'esame grossolano e istologico del cuore nelle malattie cardiovascolari sperimentali. I protocolli descritti sono stati sviluppati sulla base di informazioni provenienti da libri di testo veterinari 1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12, letteratura rivista 3,13,14^, documenti ufficiali 15 e webinar ^{16 ,17}. I campioni utilizzati in questo studio sono stati raccolti da cadaveri presentati al Dipartimento di Patologia dell'USAMV Cluj-Napoca per la diagnostica autoptica di routine.

Protocollo

Il protocollo sperimentale ha ricevuto l'accordo bioetico (n. 311 dal 2022) ed è stato approvato dal Comitato di Bioetica dell'Università di Scienze Agrarie e Medicina Veterinaria di Cluj-Napoca, in conformità con la legislazione nazionale (legge n. 43 del 2014) ed europea (direttiva UE n. 63 del 2010). Vedere la tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.

1. Protocollo necroscopico

NOTA: Si raccomanda di utilizzare lo stesso protocollo necroscopico per tutte le specie presentate a causa del più facile accesso quando viene eseguito ^2,12. I seguenti passaggi rappresentano la necroscopia eseguita in un cane di taglia media. Adattare i passaggi quando si eseguono necropsie su soggetti diversi.

1. Pesare il soggetto e posizionarlo sul tavolo necroscopico sul lato sinistro (Figura 1A). Procedere all'esame esterno del soggetto (ispezionando e palpando la cute e le mucose, notando tutti i cambiamenti di colore, consistenza e volume).
2. Utilizzare un coltello (o un bisturi) e praticare un'incisione di 7 cm nell'ascella destra (Figura 1A).
3. Individuare la giunzione coxofemorale (Figura 1A,B). Aprire la capsula con un coltello. Tagliare il legamento della testa del femore (Figura 1B).
4. Utilizzare il coltello per estendere l'incisione cutanea nell'ascella cranica alla sinfisi mandibolare e caudalmente al perineo (Figura 1B).
5. Rimuovere la pelle con il bisturi ed esporre la parete toracica e addominale dalla linea mediana ventrale al livello dei processi trasversali vertebrali (Figura 1B).
6. Con il bisturi e la pinza, creare un lembo attraverso la parete addominale, ventrocaudale all'arco costale destro. Aprire la cavità addominale con le forbici: seguire l'aspetto caudale dell'ipocondrio destro (Figura 1B).
7. Estendere l'incisione caudalmente lungo la zona paralombare destra fino alla cresta iliaca esterna. Successivamente, estendere l'incisione fino all'inserimento pubico della linea alba.
8. In breve, esaminare gli organi addominali in situ (notando eventuali cambiamenti di colore, consistenza, volume e posizione degli organi).
9. Con il bisturi e la pinza, forare il diaframma nel punto più alto (Figura 1B).
10. Entra nella cavità toracica rimuovendo la gabbia toracica destra con due sezioni longitudinali usando una pinza per tagliare l'osso. Sezione il segmento cartilagineo parasternale delle costole. Successivamente, sezione il segmento dorsale delle costole, prossimale alle articolazioni costovertebrali (Figura 1C).
11. Esaminare il cuore in situ (Figura 1C). Notare le dimensioni, la posizione, il colore, le connessioni con i tessuti adiacenti e, tramite palpazione, eventuali cambiamenti nella consistenza⁹.
    NOTA: Se è presente una trombosi o una cardiopatia congenita, il cuore deve essere sezionato in situ (questo approccio consente l'esame completo dei grandi vasi).
12. Usa le forbici per esaminare e aprire la cavità pericardica con una sezione longitudinale dalla base all'apice del cuore. Esaminare la cavità pericardica e l'epicardio (notando eventuali cambiamenti di colore, consistenza e volume)¹².
13. Rilasciare il cuore con le forbici, ottenendo sezioni trasversali dell'aorta, tronco polmonare ed entrambe le vene cavae. Sezione la vena cava superiore almeno 1 cm sopra l'ingresso nell'atrio destro per preservare la crista terminalis^11,13.
14. Esaminare il contorno esterno dell'organo, l'aspetto dell'epicardio, l'aspetto del miocardio dalla trasparenza dell'epicardio e l'aspetto esterno dei grandi vasi (Figura 2A).
    NOTA: In generale, l'apertura e l'esame del pericardio presentano alcune differenze tra le specie. L'esame della cavità pericardica inizia con un'ispezione esterna e una valutazione attraverso la trasparenza del pericardio del contenuto pericardico complessivo ^1,2. In un gatto o in un cane, il pericardio contiene tipicamente circa 0,25 ml / kg di fluido sottile, chiaro, traslucido o giallo chiaro⁹. Se ci sono versamenti patologici, devono essere raccolti con una siringa sterile o un tubo vacutainer.

2. Protocollo di dissezione

NOTA: Diverse tecniche necroscopiche sono utilizzate per il cuore, ognuna con diversi vantaggi. Per questo protocollo sono state scelte due delle tecniche più utilizzate: 1) il "metodo di afflusso-deflusso", che consente un migliore esame delle valvole e dell'endocardio ed è un protocollo utilizzato per la maggior parte delle specie 2,11,12,16, e²) la tecnica "dissezione a quattro camere"/"piano ecocardiografico", tipicamente utilizzata per gatti o cani di piccola taglia ^{1, 17}.

1. Il "metodo di afflusso-deflusso" per la dissezione cardiaca 2,11,12,16
   1. Posizionare il cuore con la faccia atriale verso l'alto (Figura 2A).
   2. Usa le forbici e le pinze senza denti per tagliare ampiamente dalla vena cava caudale lungo l'atrio destro (Figura 2B). Continuare il taglio verso l'appendice auricolare destra per esporre il nodo crista terminalis/senoatriale (nodo SA). Ispezionare la valvola tricuspide dalla vista dorsale.
   3. Tagliare una sezione dall'atrio destro alla giunzione tra il ventricolo destro e il setto interventricolare (Figura 2C). Visualizzare la valvola atrioventricolare destra.
   4. Sezione la parete libera del ventricolo destro lungo il setto interventricolare. Continuare la sezione fino all'origine del tronco polmonare (Figura 2C,D).
   5. Esaminare accuratamente le valvole atrioventricolari giuste, comprese le corde tendinee e i muscoli papillari (Figura 2D). Tagliare le corde tendinee.
   6. Posizionare una pinza attraverso il tronco polmonare e tagliare il tronco longitudinalmente (Figura 2E). Esaminare il tratto di deflusso polmonare, l'origine del tronco polmonare e le valvole semilunari.
   7. Tagliare l'atrio sinistro dalle vene polmonari alla punta del padiglione auricolare sinistro (Figura 2F). Ispezionare la valvola bicuspide (mitrale) dalla vista dorsale.
   8. Posizionare il cuore con il setto interventricolare rivolto verso il basso (Figura 2F). Fare una grande incisione nella parete libera ventricolare dalla base del ventricolo all'apice cardiaco. Visualizzare completamente la valvola atrioventricolare sinistra.
   9. Tagliare le corde tendinee della cuspide della valvola atrioventricolare sinistra.
   10. Posizionare una pinza attraverso il tratto di efflusso ventricolare sinistro e usarla come guida per aprire l'aorta (Figura 2G).
   11. Utilizzare soluzione salina per rimuovere tutti i coaguli di sangue. Una volta rimossi tutti i coaguli di sangue, valutare e confrontare il peso cardiaco con la massa corporea o le tabelle standard del peso cardiaco (Tabella 1)^11,13.
   12. Pesare il cuore.
   13. Se solo il nodo SA è il punto di interesse, dopo l'esame del ventricolo sinistro, posizionare l'intero cuore interamente in formalina tamponata neutra al 10% (NBF) per 24 ore e tagliare l'atrio destro per campionare la crista terminalis.
       NOTA: Con questa tecnica, i ventricoli sinistro e destro possono essere facilmente apprezzati. Il rapporto tra lo spessore della parete ventricolare sinistra e destra è di 3:1, con piccole differenze per specie e razza; Per il cuore del feto animale, il rapporto è 1: 1¹².

3. Protocollo di campionamento per istologia¹⁶

1. Con un bisturi, eseguire due tagli longitudinali paralleli (distanti circa 5 mm) che coinvolgono l'atrio destro, la valvola tricuspide e la parete libera ventricolare destra (Figura 2I)
2. Effettuare due tagli longitudinali paralleli (distanti circa 5 mm) che coinvolgono l'atrio sinistro, la valvola mitrale, il muscolo papillare dorsale e il ventricolo sinistro (Figura 2H).
3. All'interno del terzo superiore dorsale del cuore, sezione trasversalmente la base del cuore seguendo una linea, compreso il setto interventricolare, l'atrio destro, l'aorta, la valvola aortica e la valvola tricuspide (Figura 2J).
4. Effettuare due tagli longitudinali paralleli che coinvolgono la base dell'aorta e il setto interventricolare (Figura 2J).
5. Tagliare l'atrio destro attorno alla crista terminalis e fornire diverse sezioni parallele orientate trasversalmente sull'asse longitudinale della crista (a circa 3-4 mm di distanza) per ottenere sei pezzi del nodo SA (Figura 3, Figura 4I e Figura 5H).
6. Tagliare i tessuti ottenuti in cassette istologiche.
   NOTA: protocollo di blocco consigliato: passaggio 3.1.-blocco istologico 1 (la Figura 6 mostra la diapositiva risultante da questo blocco.), passaggio 3.2.-blocco istologico 2 (la Figura 7 mostra la diapositiva risultante da questo blocco), passaggio 3.4.-blocco istologico 3 (la Figura 8 mostra la diapositiva risultante da questo blocco), passaggio 3.5.-blocco istologico 4 (Figura 9 mostra la diapositiva risultante da questo blocco).
7. Immergere i tessuti in NBF al 10% per almeno 48 ore.

4. Campionamento delle arterie coronarie 3,10,14

1. Utilizzare una pinza e un bisturi per sezionare le arterie coronarie dal solco paraconale cardiaco (Figura 4K). Fissare l'arteria coronaria durante la notte in 10% NBF.
2. Se necessario, decalcificare adeguatamente in una miscela 1:1 di acido formico all'8% e acido cloridrico.
3. Effettuare tagli trasversali multipli a intervalli di 3 mm. Posizionare le sezioni in una cassetta e quindi inserire la cassetta in NBF al 10% fino all'incorporamento.
   NOTA: I maiali possono essere utilizzati come modello cardiaco per gli esseri umani, soprattutto quando si tratta di malattia coronarica. Quindi, si raccomandano campioni supplementari e sezioni istologiche delle arterie coronarie 3,10,14.

5. La tecnica di dissezione "quattro camere"/"piano ecocardiografico" del cuore ^1,17

NOTA: La tecnica di dissezione a quattro camere consiste in un taglio dalla base all'apice del cuore per ottenere la vista standard¹. La tecnica "a quattro camere" si applica meglio ai tessuti fissi.

1. Mettere tutto il cuore in 10% NBF per almeno 48 ore.
2. Dopo che il cuore è stato fissato in NBF al 10% per almeno 48 ore (Figura 10A), posizionare due pinze di dissezione dritte senza denti, una attraverso la cava cranica-atrio destro-valvola tricuspide-ventricolo destro e la seconda attraverso la vena polmonare-atrio sinistro-valvola mitrale-ventricolo sinistro (Figura 10B).
3. Utilizzare lo spazio tra le pinze come guida per la lama tagliente dalla base all'apice del cuore (Figura 10C). Fornire una sezione longitudinale aggiuntiva a circa 5 mm di distanza dalla sezione descritta al punto 5.2. sul segmento cardiaco, che include l'aorta.
4. Con un'incisione trasversale, separare completamente la base cardiaca dall'apice. Posizionare ogni segmento di tessuto in una cassetta istologica.
   NOTA: Protocollo di blocco consigliato: il blocco istologico apicale cardiaco 5 (la Figura 11A mostra il vetrino risultante da questo blocco), il blocco istologico di base cardiaca 6 (Figura 11B mostra il vetrino risultante da questo blocco).
5. Posizionare le cassette in NBF al 10% fino all'incorporamento. Fissare tutti i campioni cardiaci in NBF al 10% (più di 10 volte il volume del tessuto), elaborarli regolarmente in cera di paraffina, sezione a 4 μm di spessore e colorare con ematossilina e colorazione di eosina (colorazione H & E) seguendo un protocollo¹⁰ precedentemente descritto.
   NOTA: Se si sospetta miocardite, "un pezzo di tessuto cardiaco fresco deve essere trattenuto in condizioni sterili con materiale chirurgico sterile e contenitore di campioni sterili per studi microbiologici e virali"¹³.

6. Documentazione fotografica

NOTA: La documentazione fotografica è un passaggio facoltativo nell'esame necroscopico. Tuttavia, le fotografie e le registrazioni video sono essenziali per avere una "documentazione accurata dell'anatomia normale e anormale"³.

1. Per una corretta documentazione fotografica, scattare immagini digitali durante l'esecuzione della "dissezione progressiva dei tessuti cardiaci"¹³. Fare riferimento alle linee guida per la documentazione fotografica e fotografare¹⁵ la vista generale-anteriore e posteriore; una fetta di cuore; ed eventuali lesioni sospette.

Risultati

Questo protocollo è stato utilizzato per visualizzare le caratteristiche anatomiche e raccogliere campioni per l'esame istologico del cuore in quattro diverse specie (cane, gatto, maiale e mucca). Il protocollo necroscopico è stato ripetuto in ciascuna delle specie sopra menzionate, ma illustrato solo nei cani. Il protocollo necroscopico inizia con un ampio esame esterno del corpo (Figura 1A) (compresa la pelle, i linfonodi esplorabili e la mucosa esterna), misurando il peso complessivo e ...

Discussione

Quando si esegue il protocollo corrente, è necessario considerare attentamente diversi passaggi critici per ottenere risultati coerenti. Negli animali giovani, le misurazioni cardiache sono diverse da quelle degli adulti (compreso lo spessore della parete ventricolare) e, in generale, il cuore rappresenta una percentuale maggiore del peso corporeo^11,12. Il grado di ipertrofia ventricolare può essere quantificato applicando una formula di peso generale, il rappo...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline solution	B. BRAUN MELSUNGEN AG	W04479004	For washing all the blood, and blood clots from the heart.
10% neutral buffered formalin (NBF)	Q Path	11699404	Materials for collecting histopathology samples.
Bone cutting forceps	HELEN SRL	LS109HV	Sturdy instrument for cutting bone.
Cutting board	Ambition	86304	For an easier manipulation, and cutting the organs.
Decalcifying solution	Thermo Scientific TBD-2	6764004	1:1 mixture of 8% formic acid and hydrochloric acid.
Digital camera	Canon Inc.	PowerShot SX540 HS	For photographic, and videographic documentation.
Forceps	MKD-Medicale	15-430	Dissection instruments.
Histological cassettes	Q Path	720-2215	Materials for collecting histopathology samples. Dimensions: 3 × 2.5 × 0.4 cm
Knife	TEHNO FOOD COM SERV SRL	D2006/15	Sharp blade for cutting soft tissue.
Latex gloves	MKD-Medicale	SANTEX-S	Protection equipment.
Mask	MKD-Medicale	21221	Protection equipment.
Petri dishes	MKD-Medicale	0598-1V	Materials for collecting ancillary testing samples.
Plastic recipients	Corning Gosselin	TP200-02	Materials for collecting histopathology samples.
Scale	ESPERANZA	MEEKS008	For weighing the organs.
Scale	White Deals	72	For weighing the subjects.
Scalpel	MKD-Medicale	10322E	Sharp blade for cutting soft tissue.
Scissors	MKD-Medicale	13-260	Dissection instruments.
Scrub	MKD-Medicale	410100-52	Protection equipment.
Syringes	MKD-Medicale	10573EU	Materials for collecting ancillary testing samples.