טכניקות דיסקציה ודגימה היסטולוגית של הלב במודלים של בעלי חיים גדולים למחלות לב וכלי דם

Summary

בשל האנטומיה המורכבת, פרוטוקול דיסקציה וקציר הניתן לשחזור עקבי עבור דגימות לב יכול להיות מאתגר ליישום. כתב יד זה מציג את המרכיבים המרכזיים של כמה פרוטוקולים סטנדרטיים של דיסקציה לבבית, המדגישים הן את גישות הבדיקה הגסה והן את אתרי הדגימה המשמשים בדרך כלל לבדיקה היסטופתולוגית.

Abstract

הבדיקה והדגימה ברוטו הסטנדרטיים הם מרכיבים מרכזיים בשכפול ובהצלחה של מחקרים ניסיוניים במחלות לב וכלי דם שבוצעו בבעלי חיים גדולים. בהתחשב באנטומיה המורכבת של הלב, ההבדלים הבין-מיניים וסוגי התגובות המפצות והפתולוגיות, פרוטוקולים עקביים מאתגרים ליישום. השימוש בפרוטוקולי דיסקציה מרובים מותאם בדרך כלל לניסיונו של הפרוסקט, והעדפה אישית ממשיכה להיות מקור לשונות ניסיונית ובין-תחומית. כאן, המטרה היא להציג את המאפיינים האנטומיים העיקריים וציוני דרך, פרוטוקולי דיסקציה ותקני דגימה היסטולוגיים של הלב בכמה מינים נפוצים (כולל כלבים, חזירים, רועים וחתולים) כמודלים של מחלות לב וכלי דם.

שני פרוטוקולי בדיקה ברוטו סטנדרטיים מוצגים כאן. ראשית, שיטת הזרימה-החוצה, העוקבת אחר כיוון זרימת הדם הפיזיולוגי דרך הלב וכלי הדם הגדולים (המשמשת לעתים קרובות בכלבים, רועים וחזירים), ושנית, טכניקת הדיסקציה בת ארבעת התאים (המודגמת בחתולים). שתי הטכניקות יכולות להיות מותאמות לכל מין בנסיבות ניסיוניות מסוימות. פרוטוקולי הדגימה כוללים את כל תחומי העניין (צומת סינואטריאלי, חדרים, מחיצה בין-חדרית, אטריה, שסתומים ואבי העורקים), ואם הם מבוצעים כראוי, משפרים הן את יכולת השכפול והן את האמינות של מחקרים ניסיוניים.

Introduction

בשל האנטומיה המורכבת והקפדנות המוקדמת, שעלולות להפריע להערכת עובי דופן הלב, הבדיקה הגסה של הלב מאתגרת ונוטה למספר טעויות טכניות או פרשנות. זה מוגבר על ידי וריאציות מורפולוגיות interspecific ועל ידי העובדה כי פתולוגיות לב קליניות, גדולות רבות (כולל מקרים מוקדמים של מחלות לב כליליות, פיברוזיס, דלקת עורקים, עמילואידוזיס) אינם קשורים לכל שינוי גס, להיות, למעשה, פתולוגיות היסטולוגיות. דיסקציה מתוקננת ופרוטוקול קצירת דגימות היסטולוגית יכולים להביא עקביות בין משקיפים, ובמקביל, השוואה ושכפול של מחקרים ניסיוניים של מחלות לב וכלי דם.

הדגימות נאספו משני כלבים (Canis lupus familiaris) (בולדוג צרפתי זכר בן 3, ונקבה מעורבת בת 8), חתול (Felis catus) (ילד בן 6, זכר אירופי קצר שיער), חזיר בית (Sus scrofa domesticus) (בן שנה, זכר לבן גדול) ופרה (שור בוס) (בן חודשיים, נקבת הולשטיין). לכל אחד מהמינים הנבחרים יש שימוש מיוחד כמודל קרדיווסקולרי למחלה אחרת; לדוגמה, כלבים הם מודל מועדף למודלים של הפרעות קצב; חתולים מועדפים לקרדיומיופתיה היפרטרופית (HCM), שכן זהו המין עם השכיחות הגבוהה ביותר של HCM; חזירים משמשים מודל לאוטם שריר הלב חריף; ו ruminants משמשים כמודל לשכרות בשל חשיפתם לרעלים שניתן למצוא בקלות על כרי דשא¹¹.

בכתב יד זה מוצגים פרוטוקול נמק אחד ושני פרוטוקולי דיסקציה של הלב, שנועדו לשפר את הבדיקה הגסה וההיסטולוגית של הלב במחלות לב וכלי דם ניסיוניות. הפרוטוקולים המתוארים פותחו על סמך מידע מספרי לימוד וטרינריים 1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12, ספרות כתבי עת 3,13,14^, מסמכים רשמיים 15 וסמינרים מקוונים ^{16 ,17}. הדגימות ששימשו במחקר זה נקטפו מ-cadavers שהוגשו למחלקת הפתולוגיה של USAMV Cluj-Napoca לאבחון שגרתי של נתיחה שלאחר המוות.

Protocol

פרוטוקול הניסוי קיבל הסכמה ביו-אתית (מס '311 משנת 2022) ואושר על ידי ועדת הביואתיקה של האוניברסיטה למדעי החקלאות והרפואה הווטרינרית קלוז'-נאפוקה, בהתאם הן לחקיקה הלאומית (חוק מס '43 משנת 2014) והן האירופית (הנחיית האיחוד האירופי מס' 63 משנת 2010). עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. פרוטוקול נמק

הערה: מומלץ להשתמש באותו פרוטוקול נמק עבור כל המינים המוצגים בשל גישה קלה יותר אליו כאשר הוא מבוצע ^2,12. השלבים הבאים מייצגים את הנמק המבוצע בכלב בגודל בינוני. התאם את השלבים בעת ביצוע נמק בנושאים שונים.

1. שקלו את הנושא והניחו אותו על שולחן הנמק בצדו השמאלי (איור 1A). המשך לבדיקה החיצונית של הנושא (על ידי בדיקה ומישוש של cutis ו רירית, תוך ציון כל השינויים בצבע, עקביות, ונפח).
2. השתמשו בסכין (או באזמל) ובצעו חתך של 7 ס"מ בבית השחי הימני (איור 1A).
3. אתרו את הצומת הקוקסו-פמורלי (איור 1A,B). פתחו את הקפסולה בסכין. חותכים את הרצועה של ראש עצם הירך (איור 1B).
4. השתמשו בסכין כדי להרחיב את חתך העור בבית השחי לסימפיזה המנדיבולרית ובאופן קאודלי לפרינאום (איור 1B).
5. הסר את העור עם האזמל וחשוף את דופן בית החזה והבטן מקו האמצע הגחוני לרמה של תהליכים רוחביים בחוליות (איור 1B).
6. עם האזמל והמלקחיים, ליצור דש דרך דופן הבטן, ventrocaudal לקשת costal ימין. פתחו את חלל הבטן בעזרת מספריים – עקבו אחר ההיבט הקאודאלי של ההיפוכונדריה הימנית (איור 1B).
7. מרחיבים את החתך לאורך אזור הפראלומבר הימני עד לפסגה האיליאק החיצונית. לאחר מכן, להאריך את החתך עד החדרת הערווה של לינאה אלבה.
8. בקצרה, לבחון את איברי הבטן באתרם (על ידי ציון כל השינויים בצבע, עקביות, נפח, ומיקום של האיברים).
9. בעזרת האזמל והמלקחיים, נקבו את הסרעפת בנקודה הגבוהה ביותר (איור 1B).
10. הזן את חלל החזה על ידי הסרת כלוב הצלעות הימני עם שני חלקים אורכיים באמצעות מלקחיים חיתוך עצם. חתך את הקטע הסחוסי parasternal של הצלעות. לאחר מכן, חתכו את המקטע הגבי של הצלעות, פרוקסימלי למפרקים הקוסטוברטליים (איור 1C).
11. בחנו את הלב באתרו (איור 1C). שימו לב לגודל, למיקום, לצבע, לקשרים עם הרקמות הסמוכות, ועל ידי מישוש, כל שינוי בעקביות⁹.
    הערה: אם קיימת פקקת או מחלת לב מולדת, יש לנתח את הלב באתרו (גישה זו מאפשרת בדיקה מלאה של כלי הדם הגדולים).
12. השתמש מספריים כדי לבחון ולפתוח את חלל קרום הלב עם חתך אורך מהבסיס אל קצה הלב. יש לבחון את חלל קרום הלב ואת האפיקרדיום (תוך שימת לב לשינויים בצבע, בעקביות ובנפח)¹².
13. שחררו את הלב עם מספריים, מניבים חלקים רוחביים של אבי העורקים, תא המטען הריאתי, ושני הוורידים. חותכים את הווריד הנבוב העליון לפחות 1 ס"מ מעל הכניסה לאטריום הימני כדי לשמר את crista terminalis^11,13.
14. בחנו את קווי המתאר החיצוניים של האיבר, את הופעת האפיקרדיום, את הופעת שריר הלב על ידי שקיפות האפיקרדיום ואת המראה החיצוני של כלי הדם הגדולים (איור 2A).
    הערה: באופן כללי, הפתיחה והבדיקה של קרום הלב מציגות כמה הבדלים בין המינים. בדיקת חלל קרום הלב מתחילה בבדיקה והערכה חיצונית באמצעות שקיפות קרום הלב של התוכן הכולל של קרום הלב ^1,2. אצל חתול או כלב, קרום הלב מכיל בדרך כלל כ-0.25 מ"ל/ק"ג של נוזל דק, צלול, שקוף עד צהוב בהיר⁹. אם יש כל effusions פתולוגי, הם צריכים להיאסף עם מזרק סטרילי או צינור vacutainer.

2. פרוטוקול דיסקציה

הערה: מספר טכניקות נמק משמשות ללב, שלכל אחת מהן מספר יתרונות. עבור פרוטוקול זה נבחרו שתיים מהטכניקות הנפוצות ביותר: 1) "שיטת הזרימה-החוצה", המאפשרת בדיקה טובה יותר של השסתומים והאנדוקרדיום והיא פרוטוקול המשמש את רוב המינים 2,11,12,16, ^ו-2) טכניקת "דיסקציה של ארבעה תאים"/"מישור אקוקרדיוגרפי", המשמשת בדרך כלל לחתולים או לכלבים קטנים^{1, 17}.

1. "שיטת זרימה יוצאת" לנתיחה לבבית 2,11,12,16
   1. מקמו את הלב עם פני הפרוזדור כלפי מעלה (איור 2A).
   2. השתמשו במספריים ובמלקחיים חסרי שיניים כדי לחתוך באופן נרחב מהווריד הנבוב הקאודאלי אל האטריום הימני (איור 2B). המשך את החתך לתוספת האוריקולרית הימנית כדי לחשוף את צומת crista terminalis/sinoatrial (צומת SA). בדוק את שסתום tricuspid מן הנוף הגבי.
   3. חתכו מקטע מהאטריום הימני עד לצומת שבין החדר הימני למחיצת הבין-חדרית (איור 2C). הצג את השסתום האטריובנטריקולרי הימני.
   4. חתך את הקיר החופשי של החדר הימני לאורך המחיצה הבין-חדרית. המשיכו את המקטע עד למקור הגזע הריאתי (איור 2C,D).
   5. בחנו ביסודיות את השסתומים האטריו-ונטריולריים הימניים, כולל הגידים הכורדיים, ואת השרירים הפפילריים (איור 2D). חותכים את הקורדייה.
   6. הניחו מלקחיים דרך תא המטען הריאתי וחתכו את תא המטען לאורכו (איור 2E). לבחון את דרכי היציאה הריאתיות, את מקור תא המטען הריאתי ואת השסתומים החצי-לונאריים.
   7. חתכו את האטריום השמאלי מהוורידים הריאתיים לקצה האוריקל השמאלי (איור 2F). בדוק את המסתם הביקוספיד (המיטרלי) מהראייה הגבית.
   8. הניחו את הלב כאשר המחיצה הבין-חדרית פונה כלפי מטה (איור 2F). בצע חתך גדול בדופן החופשית של החדר מבסיס החדר ועד לקצה הלב. הצג את השסתום האטריובנטריקולרי השמאלי לחלוטין.
   9. חותכים את גיד המיתרים של סף השסתום האטריובנטריקולרי השמאלי.
   10. הניחו מלקחיים דרך מערכת היציאה של החדר השמאלי והשתמשו בה כהנחיה לפתיחת אבי העורקים (איור 2G).
   11. השתמש בתמיסת מלח כדי להסיר את כל קרישי הדם. לאחר הסרת כל קרישי הדם, הערך והשווה את משקל הלב מול מסת הגוף או טבלאות משקל לב סטנדרטיות (טבלה 1)^11,13.
   12. שוקלים את הלב.
   13. אם רק צומת ה-SA הוא נקודת העניין, לאחר בדיקת החדר השמאלי, מקם את כל הלב כולו ב-10% פורמלין בעל מאגר נייטרלי (NBF) למשך 24 שעות, וחתוך את האטריום הימני כדי לדגום את ה-crista terminalis.
       הערה: בטכניקה זו, ניתן להעריך בקלות את החדרים השמאלי והימני. היחס בין עובי דופן החדר השמאלי והימני הוא 3:1, עם הבדלים קטנים לפי מינים וגזע; עבור לב העובר החייתי, היחס הוא 1:1¹².

3. פרוטוקול דגימה להיסטולוגיה¹⁶

1. בעזרת אזמל, בצעו שני חתכים אורכיים מקבילים (במרחק של כ-5 מ"מ זה מזה) המערבים את האטריום הימני, את המסתם הטריקוספיד ואת הדופן החופשית של החדר הימני (איור 2I)
2. בצעו שני חתכים מקבילים אורכיים (במרחק של כ-5 מ"מ זה מזה) המערבים את האטריום השמאלי, המסתם המיטרלי, השריר הפפילרי הגבי והחדר השמאלי (איור 2H).
3. בתוך השליש העליון הגבי של הלב, חתך רוחבי את בסיס הלב בעקבות קו, כולל המחיצה הבין-חדרית, האטריום הימני, אבי העורקים, המסתם האאורטלי והמסתם הטריקוספידי (איור 2J).
4. צרו שני חתכים מקבילים אורכיים המערבים את בסיס אבי העורקים ואת המחיצה הבין-חדרית (איור 2J).
5. חתכו את האטריום הימני סביב ה-crista terminalis , וספקו מספר מקטעים מקבילים המכוונים באופן רוחבי על ציר האורך של הקריסטה (במרחק של כ-3-4 מ"מ זה מזה) כדי לקבל שש חתיכות של צומת ה-SA (איור 3, איור 4I ואיור 5H).
6. לקצץ את הרקמות המתקבלות בקלטות היסטולוגיות.
   הערה: פרוטוקול חסימה מומלץ: שלב 3.1.-בלוק היסטולוגי 1 (איור 6 מציג את השקופית המתקבלת מבלוק זה.), שלב 3.2.-בלוק היסטולוגי 2 (איור 7 מציג את השקופית המתקבלת מבלוק זה), שלב 3.4.-בלוק היסטולוגי 3 (איור 8 מציג את השקופית המתקבלת מבלוק זה), שלב 3.5.-בלוק היסטולוגי 4 (איור 9 מציג את השקופית המתקבלת מבלוק זה).
7. לטבול את הרקמות ב 10% NBF במשך 48 שעות לפחות.

4. דגימת עורקים כליליים 3,10,14

1. השתמשו במלקחיים ובאזמל כדי לנתח את העורקים הכליליים מהחריץ הפרה-קונלי הלבבי (איור 4K). לתקן את העורק הכלילי לילה ב 10% NBF.
2. במידת הצורך, יש להסיר את החישוב כראוי בתערובת של 1:1 של 8% חומצה פורמית וחומצה הידרוכלורית.
3. בצע חתכים רוחביים מרובים במרווחים של 3 מ"מ. מניחים את החלקים בקלטת ולאחר מכן מכניסים את הקלטת ל-10% NBF עד להטמעה.
   הערה: חזירים יכולים לשמש כמודל לב לבני אדם, במיוחד כשמדובר במחלת לב כלילית. לפיכך, דגימות משלימות ומקטעים היסטולוגיים של עורקים כליליים מומלצים 3,10,14.

5. טכניקת כריתת "ארבעת החדרים"/"מישור אקוקרדיוגרפי" של הלב ^1,17

הערה: טכניקת הדיסקציה בת ארבעת התאים מורכבת מחתך מהבסיס אל קצה הלב כדי לקבל את התצוגה הסטנדרטית¹. טכניקת "ארבעה תאים" מיושמת בצורה הטובה ביותר על רקמות קבועות.

1. הכניסו את כל הלב ל-10% NBF למשך 48 שעות לפחות.
2. לאחר שהלב מקובע ב-10% NBF במשך 48 שעות לפחות (איור 10A), הניחו שני מלקחיים ישרים חסרי שיניים, אחד דרך האטריום-אטריום-טריקוספיד השסתום הימני של הגולגולת, והשני דרך הווריד הריאתי-אטריום-מסתם מיטרלי-מיטרלי-חדר שמאלי (איור 10B).
3. השתמשו ברווח שבין זרועות המלקחיים כהנחיה ללהב החיתוך מהבסיס ועד לקצה הלב (איור 10C). ספק מקטע אורך נוסף במרחק של כ-5 מ"מ מהמקטע המתואר בשלב 5.2. על קטע הלב, הכולל את אבי העורקים.
4. עם חתך רוחבי, להפריד לחלוטין את בסיס הלב מן apex. מניחים כל מקטע רקמה בקלטת היסטולוגית.
   הערה: פרוטוקול חסימה מומלץ: הבלוק ההיסטולוגי הלבבי 5 (איור 11A מראה את השקופית המתקבלת מבלוק זה), הבלוק ההיסטולוגי של בסיס הלב 6 (איור 11B מציג את השקופית המתקבלת מבלוק זה).
5. מניחים את הקסטות ב-10% NBF עד להטמעה. לתקן את כל דגימות הלב ב 10% NBF (יותר מ 10 פעמים נפח של רקמה), לעבד אותם באופן שגרתי בשעוות פרפין, חתך בעובי 4 מיקרומטר, וכתם עם כתם hematoxylin ו eosin (כתם H&E) בעקבות פרוטוקול¹⁰ שתואר קודם לכן.
   הערה: אם יש חשד לדלקת שריר הלב, "יש לשמור על פיסת רקמת לב טרייה בתנאים סטריליים עם חומר כירורגי סטרילי ומיכל דגימה סטרילי למחקרים מיקרוביולוגיים ונגיפיים"¹³.

6. תיעוד מצולם

הערה: תיעוד הצילום הוא שלב אופציונלי בבדיקת נמק. עם זאת, צילום והקלטות וידאו חיוניים כדי שיהיה "תיעוד מדויק של אנטומיה נורמלית ולא תקינה"³.

1. לתיעוד צילומי נכון, צלמו תמונות דיגיטליות תוך ביצוע "דיסקציה מתקדמת של רקמות הלב"¹³. עיין בהנחיות לתיעוד צילומי ותצלום¹⁵ מבט כללי קדמי ואחורי; פרוסת הלב; וכל הנגעים החשודים.

תוצאות

פרוטוקול זה שימש להדמיית תכונות אנטומיות ולאיסוף דגימות לבדיקה היסטולוגית של הלב בארבעה מינים שונים (כלב, חתול, חזיר ופרה). פרוטוקול הנמק חזר על עצמו בכל אחד מהמינים שהוזכרו לעיל, אך הומחש רק בכלבים. פרוטוקול הנמק מתחיל בבדיקה חיצונית מקיפה של הגוף (איור 1A) (כולל העור, בלוטות...

Discussion

בעת ביצוע הפרוטוקול הנוכחי, יש לשקול בזהירות מספר שלבים קריטיים לקבלת תוצאות עקביות. בבעלי חיים צעירים, מדידות הלב שונות מאלו של מבוגרים (כולל עובי דופן החדר), ובאופן כללי, הלב מייצג חלק גדול יותר ממשקל הגוף^11,12. ניתן לכמת את מידת ההיפרטרופיה החדרית על ידי הפע?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline solution	B. BRAUN MELSUNGEN AG	W04479004	For washing all the blood, and blood clots from the heart.
10% neutral buffered formalin (NBF)	Q Path	11699404	Materials for collecting histopathology samples.
Bone cutting forceps	HELEN SRL	LS109HV	Sturdy instrument for cutting bone.
Cutting board	Ambition	86304	For an easier manipulation, and cutting the organs.
Decalcifying solution	Thermo Scientific TBD-2	6764004	1:1 mixture of 8% formic acid and hydrochloric acid.
Digital camera	Canon Inc.	PowerShot SX540 HS	For photographic, and videographic documentation.
Forceps	MKD-Medicale	15-430	Dissection instruments.
Histological cassettes	Q Path	720-2215	Materials for collecting histopathology samples. Dimensions: 3 × 2.5 × 0.4 cm
Knife	TEHNO FOOD COM SERV SRL	D2006/15	Sharp blade for cutting soft tissue.
Latex gloves	MKD-Medicale	SANTEX-S	Protection equipment.
Mask	MKD-Medicale	21221	Protection equipment.
Petri dishes	MKD-Medicale	0598-1V	Materials for collecting ancillary testing samples.
Plastic recipients	Corning Gosselin	TP200-02	Materials for collecting histopathology samples.
Scale	ESPERANZA	MEEKS008	For weighing the organs.
Scale	White Deals	72	For weighing the subjects.
Scalpel	MKD-Medicale	10322E	Sharp blade for cutting soft tissue.
Scissors	MKD-Medicale	13-260	Dissection instruments.
Scrub	MKD-Medicale	410100-52	Protection equipment.
Syringes	MKD-Medicale	10573EU	Materials for collecting ancillary testing samples.