تحليل تشتت الضوء الديناميكي لتحديد حجم الجسيمات لمجمعات الحديد والكربوهيدرات

Summary

برز تشتت الضوء الديناميكي (DLS) كاختبار مناسب لتقييم حجم الجسيمات وتوزيع مجمعات الكربوهيدرات الحديدية التي يتم إعطاؤها عن طريق الوريد. ومع ذلك ، تفتقر البروتوكولات إلى التوحيد وتحتاج إلى تعديل لكل مركب من الحديد والكربوهيدرات يتم تحليله. يصف هذا البروتوكول التطبيق والاعتبارات الخاصة لتحليل سكروز الحديد.

Abstract

تستخدم مجمعات الجسيمات النانوية التي تدار عن طريق الوريد من الحديد والكربوهيدرات على نطاق واسع لعلاج نقص الحديد. تشمل هذه الفئة العديد من معقدات الجسيمات النانوية غير المتجانسة هيكليا ، والتي تظهر حساسية متفاوتة للظروف المطلوبة للمنهجيات المتاحة لتوصيف هذه العوامل فيزيائيا وكيميائيا. حاليا ، لم يتم تحديد سمات الجودة الحرجة لمجمعات الحديد والكربوهيدرات بشكل كامل. برز تشتت الضوء الديناميكي (DLS) كطريقة أساسية لتحديد حجم الجسيمات السليمة وتوزيعها. ومع ذلك ، لا تزال هناك تحديات فيما يتعلق بتوحيد المنهجيات عبر المختبرات ، والتعديلات المحددة المطلوبة لمنتجات الحديد والكربوهيدرات الفردية ، وكيف يمكن وصف توزيع الحجم على أفضل وجه. الأهم من ذلك ، يجب توحيد التخفيفات المخففة والتسلسلية المستخدمة. يحد التباين الواسع في مناهج إعداد العينات والإبلاغ عن البيانات من استخدام DLS لمقارنة عوامل الحديد والكربوهيدرات. هنا ، نقوم بتفصيل بروتوكول قوي وسهل التكرار لقياس حجم وتوزيع حجم مركب الحديد والكربوهيدرات ، سكروز الحديد ، باستخدام مؤشر Z-average و polydispersity.

Introduction

سكروز الحديد (IS) هو محلول غرواني يتكون من جسيمات نانوية تتكون من مركب من نواة الحديد أوكسي هيدروكسيد متعدد النوى والسكروز. يستخدم IS على نطاق واسع لعلاج نقص الحديد بين المرضى الذين يعانون من مجموعة واسعة من حالات المرض الكامنة الذين لا يتحملون مكملات الحديد عن طريق الفم أو الذين لا يكون الحديد الفموي فعالا^{لهم 1}. ينتمي IS إلى فئة الأدوية من الأدوية المعقدة على النحو المحدد من قبل إدارة الغذاء والدواء (FDA) ، وهي فئة من الأدوية ذات الكيمياء المعقدة تتناسب مع البيولوجيا². قد يتطلب التقييم التنظيمي لمنتجات الأدوية المعقدة طرقا فيزيائية كيميائية متعامدة إضافية و / أو دراسات قبل السريرية أو السريرية لمقارنة الأدوية المعقدة اللاحقة بدقة ^3,4. هذا مهم لأن العديد من الدراسات أفادت بأن استخدام IS مقابل منتج IS للمتابعة لا ينتج عنه نفس النتائج السريرية. وهذا يؤكد أهمية استخدام تقنيات التوصيف الجديدة والمتعامدة المناسبة للكشف عن الاختلافات في الخصائص الفيزيائية والكيميائية بين منتجات نظم المعلومات ^5,6.

إن التوضيح الدقيق لحجم وحجم توزيع IS له أهمية سريرية ، حيث أن حجم الجسيمات هو عامل مؤثر رئيسي في معدل ومدى opsonization - الخطوة الحاسمة الأولى في التوزيع الحيوي لهذه الأدوية المعقدة ^7,8. حتى الاختلافات الطفيفة في حجم الجسيمات وتوزيع حجم الجسيمات كانت مرتبطة بالتغيرات في الملف الدوائي لمجمعات جسيمات أكسيد الحديد^{النانوية 9,10}. أظهرت دراسة حديثة أجراها Brandis et al. أن حجم الجسيمات المقاسة بواسطة DLS كان مختلفا بشكل كبير (14.9 نانومتر ± 0.1 نانومتر مقابل 10.1 نانومتر ± 0.1 نانومتر ، p < 0.001) عند مقارنة دواء مرجعي مدرج ومنتج غلوكونات حديدي الصوديوم العام ،^{على التوالي 11}. تعتمد الجودة المتسقة من دفعة إلى أخرى وسلامة وفعالية منتجات كربوهيدرات الحديد كليا على توسيع نطاق عملية التصنيع ، ويجب مراعاة انحراف التصنيع المحتمل بعناية⁹. قد تؤدي عملية التصنيع إلى السكروز المتبقي ، وسيختلف ذلك بناء على الشركة المصنعة¹². يمكن أن تؤدي أي تعديلات في متغيرات عملية التصنيع إلى تغييرات كبيرة في المنتج الدوائي المعقد النهائي فيما يتعلق بالهيكل والاستقرار المعقد والتخلص في الجسم الحي ⁹.

لتقييم اتساق الدواء والتنبؤ بسلوك الدواء في الجسم الحي ، هناك حاجة إلى منهجيات تحليلية متعامدة معاصرة لتحديد الخصائص الفيزيائية والكيميائية للأدوية النانوية المعقدة. ومع ذلك، هناك نقص في توحيد المنهجيات، مما قد يؤدي إلى درجة عالية من التباين بين المختبرات في الإبلاغ عن النتائج¹³. وعلى الرغم من اعتراف السلطات التنظيمية العالمية والمجتمع العلمي بهذه^{التحديات14}، فإن معظم الخصائص الفيزيائية والكيميائية لنظم المعلومات لا تزال غير محددة بشكل جيد، ولم يتم تحديد المجموعة الكاملة من سمات الجودة الحرجة في سياق وثائق التوجيه التنظيمي المتاحة¹⁵. تقترح مسودة وثائق التوجيه الخاصة بالمنتج الصادرة عن إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) لمجمعات الحديد والكربوهيدرات DLS كإجراء لتقييم توزيع حجم وحجم منتجات المتابعة^16,17.

قامت العديد من المنشورات بتفصيل بروتوكولات DLS المعمول بها لتحديد أبعاد الجسيمات النانوية IS^13,18. ومع ذلك ، نظرا لأن إعداد العينة وظروف الإجراء والأجهزة ومعلمات إعداد الأجهزة تختلف بين الطرق المنشورة ، لا يمكن مقارنة نتائج DLS مباشرة في حالة عدم وجود طريقة موحدة لتفسير النتائج^13,18. ويحد التنوع في المنهجيات ونهج الإبلاغ عن البيانات من التقييم المناسب لهذه الخصائص لأغراض المقارنة¹⁹. الأهم من ذلك ، أن العديد من بروتوكولات DLS المنشورة سابقا لتقييم IS لا تأخذ في الاعتبار تأثير انتشار السكروز في التعليق بسبب وجود السكروز الحر ، والذي ثبت أنه يرفع بشكل زائف نصف قطر الهيدروديناميكي المحسوب Z للجسيمات النانوية في المحاليل الغروية^13,18. يهدف هذا البروتوكول إلى توحيد منهجية قياس حجم الجسيمات وتوزيع IS. تم تطوير الطريقة والتحقق من صحتها لهذا الغرض.

Protocol

1. تشغيل الجهاز

1. بدء تشغيل الجهاز والبرامج
   ملاحظة: يوضح الشكل التكميلي S1A-D خطوات بدء تشغيل الجهاز والبرنامج.
   1. قم بتشغيل الجهاز قبل 30 دقيقة على الأقل من بدء القياسات ، ثم ابدأ تشغيل الكمبيوتر.
   2. انقر نقرا مزدوجا فوق رمز برنامج الجهاز لبدء البرنامج.
   3. أدخل اسم المستخدم وكلمة المرور في نافذة تسجيل الدخول. تأكد من أن كل مستخدم لديه حسابه الخاص.
   4. انتظر حتى تضيء الأشرطة السوداء الثلاثة في الزاوية اليمنى السفلية باللون الأخضر ، مما يشير إلى أن الوحدة جاهزة للتشغيل.
   5. في حالة فترات عدم النشاط الطويلة ، عندما يتم تسجيل خروج المستخدم تلقائيا ، ضمن الأمان ، انقر فوق تسجيل الدخول ، وأعد إدخال كلمة المرور.
2. إنشاء ملف قياس
   ملاحظة: يتم إنشاء ملف قياس جديد في بداية كل يوم قياس. يتم سرد جميع القياسات وتخزينها في ملف القياس. للحصول على تفاصيل حول هذا الإجراء ، انظر الشكل التكميلي S2A-B.
   1. قم بإنشاء ملف قياس جديد بالنقر فوق ملف | جديد | ملف القياس. في النافذة المفتوحة ، حدد موقع التخزين ، وقم بتسمية ملف القياس. قم بتأكيد التفاصيل بالنقر فوق حفظ.
   2. لفتح ملف ، انقر فوق ملف | مفتوح | ملف القياس. حدد ملف القياس في النافذة المفتوحة ، وقم بتأكيد التفاصيل بالنقر فوق فتح ، وحدد اسم الملف ، وانقر فوق حفظ.
3. طباعة النتائج
   1. اطبع أو احفظ نتائج اختبار ملاءمة النظام (SST) (انظر الخطوة 1.5) والقيمة المتوسطة لقياس العينة وفقا للشكل التكميلي S3.
   2. حدد القياس (القياسات) في عرض السجلات لملف القياس.
   3. انقر بزر الماوس الأيمن فوق Batch Print ، وانتظر حتى تفتح نافذة صغيرة أخرى.
   4. حدد تقرير كثافة PSD من الاختيارات ، وقم بتأكيده بالنقر فوق موافق.
4. الإجراء العام لبدء القياس
   ملاحظة: يرد وصف الإجراء الخاص ببدء القياس في الشكل التكميلي S4A-D. اتبع المسار الموضح أدناه لملف معلمة الوحدة المطلوب (المشار إليه باسم SOP):
   1. حدد الإجراء التشغيلي الموحد المطلوب من القائمة المنسدلة. وبما أن أحدث الإجراءات التشغيلية الموحدة المستخدمة معروضة في القائمة، إذا كانت هناك حاجة إلى إجراء تشغيلي موحد أقدم، فحدد تصفح بحثا عن الإجراء التشغيلي الموحد، وقم بالتأكيد بالنقر على السهم الأخضر. بمجرد فتح موقع تخزين الإجراءات التشغيلية الموحدة، تابع الخطوة 1-4-2.
      ملاحظة: للحصول على تفاصيل عن معلمات النظام الهامة الخاصة بسكروز الحديد (على سبيل المثال ، وقت التوازن للمخفف) ، انظر الجدول 1.
   2. في النافذة المفتوحة ، قم بإجراء الإدخالات المطلوبة ضمن اسم العينة والملاحظات. قم بالتأكيد بالنقر فوق "موافق" ، وانتظر حتى تفتح نافذة القياس تلقائيا.
   3. ابدأ القياس بالنقر فوق الزر "ابدأ " الأخضر.
   4. بمجرد صدور إشارة صوتية في نهاية القياس ، أغلق نافذة القياس .
5. قياس اختبار ملاءمة النظام (SST)
   ملاحظة: لا تلمس الجزء السفلي من كوفيت (منطقة القياس). في بداية ونهاية التسلسل ، قم بقياس معيار الجسيمات 20 نانومتر.
   1. املأ ~ 1 مل من معيار الجسيمات غير المخفف في كوفيت البوليسترين ، وأغلقه بالغطاء.
      ملاحظة: يمكن استخدام المعيار المخفف المعد في الخطوة 1.5.1 لمدة شهر واحد.
   2. بعد التعبئة ، أغلق الكفيت وتحقق من وجود فقاعات هواء. قم بإزالة فقاعات الهواء عن طريق النقر على الكوفيت برفق.
   3. ضع الكوفيت في حامل الخلية الخاص بالجهاز مع توجيه علامة السهم للأمام ، وأغلق غطاء غرفة القياس.
   4. قم بتحميل معلمة الوحدة SOP ، وأدخل البيانات التالية في نافذة البدء:
      اسم العينة: SST 20 نانومتر معيار الجسيمات
      ثم أضف ملاحظة: رقم المعرف وتاريخ انتهاء صلاحية المعيار
   5. ابدأ القياس.
   6. بعد انتهاء القياس عندما تصدر الإشارة الصوتية صوتا ، أغلق نافذة القياس.
   7. اطبع التقرير (انظر النقطة 1.1.3).
      ملاحظة: يتم تمرير SST إذا كان حجم الجسيمات Z-average يتوافق مع قيمة شهادة التحليل ± 10٪.
6. قياس محلول السكروز الحديدي
   1. ماصة 0.5 مل من محلول IS مع محتوى حديد 2٪ m / V في دورق حجمي 25 مل ، وملء العلامة بماء منخفض الجسيمات (على سبيل المثال ، منزوع الأيونات حديثا ومصفى [حجم المسام 0.2 ميكرومتر]) ؛ يحتوي هذا المحلول على 0.4 ملغ من الحديد / مل.
      ملاحظة: إعداد العينة في الخطوة 1.6.1. مع هذا التخفيف المحدد تم إنشاؤه أثناء تطوير الطريقة ، وتم تحديد ذلك على أنه التخفيف الأمثل لهذا الغرض.
   2. للتنظيف الأولي ، املأ كوفيت البوليسترين بالكامل تقريبا بمحلول القياس المحضر ، وقم بتدويره برفق ، ثم أفرغه تماما قدر الإمكان.
      ملاحظة: لا تلمس الجزء السفلي من كوفيت (منطقة القياس) ، وتجنب فقاعات الهواء عن طريق عدم هز كوفيت.
   3. للقياس ، ماصة 1 مل من محلول القياس في كوفيت ، ووضعها على غطاء.
   4. تحقق من محلول القياس في كوفيت بحثا عن فقاعات الهواء. إذا كانت هناك فقاعات هواء ، فقم بإزالتها عن طريق النقر برفق على الكوفيت.
7. إجراء القياس
   1. ضع الكوفيت البلاستيكي مع محلول القياس في الجهاز مع توجيه علامة السهم للأمام ، وأغلق الغطاء.
   2. حمل الإجراء التشغيلي الموحد للمعلمة (انظر الخطوة 1-4-1)، وأدخل البيانات التالية في نافذة البدء:
      اسم العينة: رقم الدفعة
   3. ابدأ القياس.
   4. بعد نهاية القياس ، عندما تصدر الإشارة الصوتية صوتا ، أغلق نافذة القياس .
   5. احسب القيمة المتوسطة للقياسات الفردية الستة وفقا للشكل التكميلي S5. حدد القياسات الفردية في عرض السجلات لملف القياس ، وانقر بزر الماوس الأيمن فوق إنشاء متوسط النتيجة ، وأضف اسم القيمة المتوسطة ضمن اسم العينة ، وقم بالتأكيد بالنقر فوق موافق.
   6. انتظر حتى يقوم البرنامج بإنشاء سجل جديد في نهاية القائمة ، وابحث عن الاسم الذي تم إدخاله والنتيجة المتوسطة في هذا السجل.
   7. اطبع التقرير (راجع الخطوة 1.1.3).

النتائج

تم التحقق من صحة الطريقة الموصوفة وفقا ل ICH Q2 (R1) ²⁰ ، والتي تضمنت قياس حلول الاختبار في ظل ظروف مختلفة. كانت الدقة 0.5٪ RSD فقط لحجم Z المتوسط ، بينما تم حساب 3.5٪ RSD كحد أقصى ل PDI. اختلف متوسط النتائج من المحللين المختلفين والأيام بنسبة 0.4٪ فقط لحجم Z-average و 1.5٪ ل PDI. تم حساب الإحصاءات من 12 ?...

Discussion

أصبح DLS مقايسة أساسية لتحديد حجم وحجم توزيع الجسيمات النانوية للتطبيقات في تطوير الأدوية والتقييم التنظيمي. على الرغم من التقدم في تقنيات DLS ، لا تزال هناك تحديات منهجية فيما يتعلق باختيار المواد المخففة وإعداد العينات ، والتي تعتبر ذات صلة خاصة بمجمعات الحديد والكربوهيدرات في المحاليل ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Zetasizer Nano ZS	Malvern	NA	equipped with Zetasizer software 7.12, Helium Neon laser (633 nm, max. 4 mW) and 173° backscattering geometry
Materials
Disposable plastic cuvettes
LLG-Disposable plastic cells	LLG labware	LLG-Küvetten, Makro, PS; Order number 9.406011
low-particle water			(The use of freshly deionized and filtered (pore size 0.2 μm) water is recommended).
Microlitre pipette
Venofer 100 mg/5 mL	Vifor Pharma
Volumetric flask 25 mL
Nanosphere	Thermo	3020A	Particle Standard
Software
Origin Pro v.8.5	Origin Lab Corporation