ניתוח פיזור אור דינמי לקביעת גודל החלקיקים של קומפלקסים ברזל-פחמימות

Summary

פיזור אור דינמי (DLS) התגלה כבדיקה מתאימה להערכת גודל החלקיקים והתפלגותם של קומפלקסים של ברזל-פחמימות הניתנות תוך ורידי. עם זאת, הפרוטוקולים חסרים סטנדרטיזציה ויש לשנות אותם עבור כל קומפלקס ברזל-פחמימות שנותחו. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את היישום ואת השיקולים המיוחדים לניתוח סוכרוז ברזל.

Abstract

קומפלקסים של ננו-חלקיקי ברזל-פחמימות הניתנים תוך ורידי נמצאים בשימוש נרחב לטיפול במחסור בברזל. מחלקה זו כוללת מספר קומפלקסים הטרוגניים של ננו-חלקיקים מבחינה מבנית, המציגים רגישות משתנה לתנאים הדרושים למתודולוגיות הזמינות לאפיון פיסיקוכימי של חומרים אלה. נכון לעכשיו, תכונות האיכות הקריטיות של מתחמי ברזל-פחמימות לא הוקמו במלואם. פיזור אור דינמי (DLS) התגלה כשיטה בסיסית לקביעת גודל ופיזור חלקיקים שלמים. עם זאת, עדיין נותרו אתגרים בנוגע לסטנדרטיזציה של מתודולוגיות במעבדות, שינויים ספציפיים הנדרשים עבור מוצרי ברזל-פחמימות בודדים, וכיצד ניתן לתאר בצורה הטובה ביותר את חלוקת הגודל. חשוב לציין, המדללים והדילולים הסדרתיים המשמשים חייבים להיות סטנדרטיים. השונות הרבה בגישות להכנת דגימות ודיווח נתונים מגבילה את השימוש ב-DLS להשוואה בין סוכני ברזל-פחמימות. במאמר זה, אנו מפרטים פרוטוקול חזק וקל לשחזור למדידת התפלגות הגודל והגודל של קומפלקס ברזל-פחמימות, סוכרוז ברזל, באמצעות מדד Z-average ו- polydispersity.

Introduction

סוכרוז ברזל (IS) הוא תמיסה קולואידית המורכבת מננו-חלקיקים המורכבים מקומפלקס של ליבת ברזל-אוקסיהידרוקסיד רב-גרעינית וסוכרוז. IS נמצא בשימוש נרחב לטיפול במחסור בברזל בקרב חולים עם מגוון רחב של מחלות רקע שאינם סובלים תוספי ברזל דרך הפה או שעבורם ברזל פומי אינו יעיל¹. IS שייך לקבוצת התרופות של תרופות מורכבות כפי שהוגדרה על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי (FDA), שהיא קבוצה של תרופות עם כימיה מורכבת התואמת ביולוגים². הערכה רגולטורית של מוצרי תרופות מורכבים עשויה לדרוש שיטות פיסיקוכימיות אורתוגונליות נוספות ו / או מחקרים פרה-קליניים או קליניים כדי להשוות במדויק תרופות מורכבות המשך ^3,4. זה חשוב מכיוון שמספר מחקרים דיווחו כי השימוש ב- IS לעומת מוצר המשך של IS אינו מניב את אותן תוצאות קליניות. זה מדגיש את הקריטיות של השימוש בטכניקות אפיון חדשניות ואורתוגונליות המתאימות לאיתור הבדלים בתכונות הפיזיקוכימיות בין מוצרי IS ^5,6.

להבהרה מדויקת של התפלגות הגודל והגודל של IS יש חשיבות קלינית, שכן גודל החלקיקים הוא גורם משפיע מרכזי על קצב והיקף האופוזוניזציה - הצעד הקריטי הראשון בהפצה הביולוגית של תרופות מורכבות אלה ^7,8. אפילו שינויים קלים בגודל החלקיקים ובהתפלגות גודל החלקיקים היו קשורים לשינויים בפרופיל הפרמקוקינטי של קומפלקסים של ננו-חלקיקים של תחמוצת ברזל ^9,10. מחקר שנערך לאחרונה על ידי Brandis et al. הראה כי גודל החלקיקים שנמדד על ידי DLS היה שונה באופן משמעותי (14.9 ננומטר ± 0.1 ננומטר לעומת 10.1 ננומטר ± 0.1 ננומטר, p < 0.001) כאשר השוו בין תרופה רשומה ייחוס לבין מוצר נתרן ברזל גלוקונאט גנרי, בהתאמה¹¹. האיכות, הבטיחות והיעילות העקביות של מוצרי ברזל-פחמימות מאצווה לאצווה תלויות לחלוטין בהרחבת תהליך הייצור, ויש לשקול בזהירות סחף ייצור פוטנציאלי⁹. תהליך הייצור עשוי לגרום לשאריות סוכרוז, וזה ישתנה בהתאם ליצרן¹². כל שינוי במשתני תהליך הייצור יכול להוביל לשינויים משמעותיים במוצר התרופה המורכב הסופי מבחינת המבנה, יציבות מורכבת ודיספוזיציה in vivo ⁹.

כדי להעריך את עקביות התרופה ולחזות את התנהגות in vivo של התרופה, נדרשות מתודולוגיות אנליטיות אורתוגונליות עכשוויות כדי לקבוע את התכונות הפיזיקוכימיות של ננו-תרופות מורכבות. עם זאת, קיים חוסר סטנדרטיזציה של מתודולוגיות, אשר יכול לגרום לרמה גבוהה של שונות בין-מעבדתית בדיווח התוצאות¹³. למרות ההכרה באתגרים אלה על ידי רשויות רגולטוריות גלובליות והקהילה המדעית¹⁴, רוב המאפיינים הפיזיקוכימיים של IS עדיין מוגדרים בצורה גרועה, וההשלמה המלאה של תכונות איכות קריטיות בהקשר של מסמכי הנחיות רגולטוריות זמינות לא הוגדרה¹⁵. טיוטת מסמכי ההנחיות הספציפיים למוצר שהונפקו על ידי ה- FDA עבור קומפלקסים של ברזל-פחמימות מציעה DLS כהליך להערכת התפלגות הגודל והגודל של מוצרי המשך^16,17.

מספר פרסומים פירטו פרוטוקולי DLS מבוססים לקביעת מידות ננו-חלקיקים^{של IS 13,18}. עם זאת, מכיוון שהפרמטרים של הכנת הדגימה, תנאי הפרוצדורה, המכשור והגדרת המכשור שונים בין השיטות שפורסמו, לא ניתן להשוות ישירות את תוצאות DLS בהיעדר שיטה סטנדרטית לפרש את התוצאות^13,18. הגיוון במתודולוגיות ובגישות לדיווח נתונים מגביל את ההערכה המתאימה של מאפיינים אלה למטרות השוואתיות¹⁹. חשוב לציין, רבים מהפרוטוקולים של DLS שפורסמו בעבר כדי להעריך את IS אינם לוקחים בחשבון את ההשפעה של דיפוזיה של סוכרוז בתרחיף עקב נוכחות של סוכרוז חופשי, אשר הוכח כמעלה באופן מזויף את הרדיוסים ההידרודינמיים המחושבים על ידי ממוצע Z של ננו-חלקיקים בתמיסות קולואידיות^13,18. הפרוטוקול הנוכחי נועד לתקנן את המתודולוגיה למדידת גודל החלקיקים והתפלגותם של IS. השיטה פותחה ואומתה למטרה זו.

Protocol

1. הפעלת המכונה

1. הפעלת המכונה והתוכנה
   הערה: איור משלים S1A-D מתאר את השלבים להפעלת המחשב והתוכנה.
   1. הפעל את המכשיר לפחות 30 דקות לפני תחילת המדידות ולאחר מכן הפעל את המחשב.
   2. לחץ פעמיים על סמל תוכנת המכשיר כדי להפעיל את התוכנית.
   3. הזן את שם המשתמש והסיסמה בחלון ההתחברות. ודא שלכל משתמש יש חשבון משלו.
   4. המתן עד שכל שלושת הפסים השחורים בפינה הימנית התחתונה יאירו בירוק, כדי לציין שהיחידה מוכנה לפעולה.
   5. במקרה של תקופות ארוכות של חוסר פעילות, כאשר המשתמש מתנתק באופן אוטומטי, תחת אבטחה, לחץ על התחברות, והזן מחדש את הסיסמה.
2. יצירת קובץ מדידה
   הערה: קובץ מדידה חדש נוצר בתחילת כל יום מדידה. כל המדידות רשומות ומאוחסנות בקובץ המדידות. לפרטים על הליך זה, ראו איור משלים S2A-B.
   1. צור קובץ מדידה חדש על ידי לחיצה על קובץ | חדש | קובץ מדידה. בחלון הפתוח, בחרו במיקום האחסון ותנו שם לקובץ המדידה. אשר את הפרטים על ידי לחיצה על שמור.
   2. כדי לפתוח קובץ, לחץ על קובץ | פתוח | קובץ מדידה. בחר את קובץ המדידה בחלון הפתוח, אשר את הפרטים על ידי לחיצה על פתח, בחר את שם הקובץ ולחץ על שמור.
3. הדפסת התוצאות
   1. הדפס או שמור את תוצאות בדיקת התאמת המערכת (SST) (ראה שלב 1.5) ואת הערך הממוצע של מדידת הדגימה לפי איור משלים S3.
   2. סמן את המידות בתצוגת הרשומות של קובץ המדידה.
   3. לחץ לחיצה ימנית על הדפסת אצווה והמתן לפתיחת חלון קטן נוסף.
   4. בחרו את דוח עוצמת PSD מבין האפשרויות ואשרו אותו על ידי לחיצה על אישור.
4. הליך כללי להתחלת מדידה
   הערה: ההליך להתחלת מדידה מתואר באיור משלים S4A-D. בצע את הנתיב המתואר להלן עבור קובץ פרמטר היחידה הנדרש (המכונה SOP):
   1. בחר את SOP הנדרש מהרשימה הנפתחת. מכיוון שה-SOPs האחרונים שהיו בשימוש מוצגים ברשימה, אם יש צורך ב-SOP ישן יותר, בחר Browse for SOP, ואשר על-ידי לחיצה על החץ הירוק. לאחר פתיחת מיקום האחסון של ה-SOPs, המשך לשלב 1.4.2.
      הערה: לפרטים על פרמטרי המערכת החשובים הספציפיים לסוכרוז ברזל (למשל, זמן שיווי משקל של מנחת), ראה טבלה 1.
   2. בחלון הפתוח, בצע את הערכים הדרושים תחת שם לדוגמה והערות. אשר על ידי לחיצה על אישור, והמתן עד שחלון המדידה ייפתח אוטומטית.
   3. התחל את המדידה על ידי לחיצה על לחצן התחל הירוק.
   4. ברגע שנשמע אות אקוסטי בסוף המדידה, סגור את חלון המדידה .
5. מדידת בדיקת התאמה למערכת (SST)
   הערה: אין לגעת בחלק התחתון של הקובט (אזור המדידה). בתחילת הרצף ובסופו, מדדו את תקן החלקיקים של 20 ננומטר.
   1. ממלאים ~1 מ"ל של תקן החלקיקים הלא מדוללים בקובט פוליסטירן, וסוגרים עם המכסה.
      הערה: ניתן להשתמש בתקן המדולל שהוכן בשלב 1.5.1 למשך חודש אחד.
   2. לאחר המילוי, לסגור את cuvette, ולבדוק בועות אוויר. הסר בועות אוויר על ידי הקשה קלה על הקובטה.
   3. הניחו את הקובט במחזיק התא של המכשיר כשסימן החץ פונה קדימה, וסגרו את מכסה תא המדידה.
   4. טען את פרמטר היחידה SOP והזן את הנתונים הבאים בחלון ההתחלה:
      שם דוגמה: SST 20 ננומטר תקן חלקיקים
      לאחר מכן, הוסף הערה: מספר מזהה ותאריך תפוגה של התקן
   5. התחל את המדידה.
   6. לאחר סיום המדידה כאשר נשמע האות האקוסטי, סגור את חלון המדידה.
   7. הדפס את הדוח (ראה נקודה 1.1.3).
      הערה: SST מועבר אם גודל החלקיק Z-ממוצע מתאים לערך תעודת הניתוח ± 10%.
6. מדידת תמיסת סוכרוז ברזל
   1. פיפטה 0.5 מ"ל של תמיסת IS עם תכולת ברזל של 2% m/V לתוך בקבוק נפח 25 מ"ל, ולמלא עד הסימן עם מים דלי חלקיקים (למשל deionized טרי מסונן [גודל נקבוביות 0.2 μm]); תמיסה זו מכילה 0.4 מ"ג Fe/mL.
      הערה: הכנת הדגימה בשלב 1.6.1. עם דילול ספציפי זה נקבע במהלך פיתוח השיטה, וזה נקבע כדילול האופטימלי למטרה זו.
   2. לניקוי ראשוני, מלאו את קוביית הפוליסטירן כ-3/4 מלאה בתמיסת המדידה המוכנה, ערבלו בעדינות ולאחר מכן רוקנו לחלוטין ככל האפשר.
      הערה: אין לגעת בחלק התחתון של הקובט (אזור המדידה), ולהימנע מבועות אוויר על ידי לא לנער את הקובט.
   3. לצורך המדידה, פיפטה 1 מ"ל של תמיסת המדידה לתוך הקובט, ולשים על מכסה.
   4. בדוק את פתרון המדידה בקובט עבור בועות אוויר. אם יש בועות אוויר, הסר אותן על ידי הקשה קלה על הקובט.
7. ביצוע המדידה
   1. הניחו את קוביית הפלסטיק עם תמיסת המדידה במכשיר כשסימן החץ פונה קדימה, וסגרו את המכסה.
   2. טען את הפרמטר SOP (ראה שלב 1.4.1) והזן את הנתונים הבאים בחלון התחלה:
      שם מדגם: מספר אצווה
   3. התחל את המדידה.
   4. לאחר סיום המדידה, כאשר נשמע האות האקוסטי, סגור את חלון המדידה .
   5. חשב את הערך הממוצע של שש המדידות הנפרדות לפי איור משלים S5. סמן את המידות הבודדות בתצוגת הרשומות של קובץ המדידה, לחץ לחיצה ימנית על צור תוצאה ממוצעת, הוסף את שם הערך הממוצע תחת שם מדגם, ואשר על ידי לחיצה על אישור.
   6. המתן עד שהתוכנה תיצור רשומה חדשה בסוף הרשימה וחפש את השם שהוזן ואת התוצאה הממוצעת ברשומה זו.
   7. הדפס את הדוח (ראה שלב 1.1.3).

תוצאות

השיטה שתוארה אומתה על פי ICH Q2(R1)²⁰, שכללה מדידה של פתרונות בדיקה בתנאים משתנים. הדיוק היה רק 0.5% RSD עבור גודל ממוצע Z, בעוד מקסימום של 3.5% RSD חושב עבור PDI. התוצאות הממוצעות של אנליסטים שונים וימים שונים היו שונות רק ב-0.4% עבור הגודל הממוצע Z וב-1.5% עבור ה-PDI. הנתונים חושבו מתוך 12 מדידות שבו?...

Discussion

DLS הפך למבחן בסיסי לקביעת התפלגות הגודל והגודל של ננו-חלקיקים עבור יישומים בפיתוח תרופות והערכה רגולטורית. למרות ההתקדמות בטכניקות DLS, עדיין קיימים אתגרים מתודולוגיים בנוגע לבחירת המדללים והכנת הדגימה, הרלוונטיים במיוחד עבור קומפלקסים של ברזל-פחמימות בתמיסות קולואידיות. חשוב לציין, שיטו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Zetasizer Nano ZS	Malvern	NA	equipped with Zetasizer software 7.12, Helium Neon laser (633 nm, max. 4 mW) and 173° backscattering geometry
Materials
Disposable plastic cuvettes
LLG-Disposable plastic cells	LLG labware	LLG-Küvetten, Makro, PS; Order number 9.406011
low-particle water			(The use of freshly deionized and filtered (pore size 0.2 μm) water is recommended).
Microlitre pipette
Venofer 100 mg/5 mL	Vifor Pharma
Volumetric flask 25 mL
Nanosphere	Thermo	3020A	Particle Standard
Software
Origin Pro v.8.5	Origin Lab Corporation