动态光散射分析用于测定铁-碳水化合物复合物的粒径

摘要

动态光散射（DLS）已成为评估静脉内施用的铁碳水化合物复合物的粒径和分布的合适测定方法。然而，这些协议缺乏标准化，需要针对分析的每个铁 - 碳水化合物复合物进行修改。本协议描述了蔗糖铁分析的应用和特殊注意事项。

摘要

静脉注射的铁-碳水化合物纳米颗粒复合物广泛用于治疗缺铁。该类包括几种结构异质的纳米颗粒复合物，它们对可用于物理化学表征这些试剂的方法所需的条件表现出不同的敏感性。目前，铁-碳水化合物复合物的关键质量属性尚未完全确定。动态光散射（DLS）已成为确定完整粒径和分布的基本方法。然而，在实验室方法的标准化、单个铁碳水化合物产品所需的特定修改以及如何最好地描述尺寸分布方面仍然存在挑战。重要的是，使用的稀释剂和系列稀释液必须标准化。样品制备和数据报告方法的巨大差异限制了DLS用于铁碳水化合物制剂比较的使用。在本文中，我们详细介绍了一种稳健且易于重现的方案，以使用Z平均值和多分散指数测量铁 - 碳水化合物复合物蔗糖铁的大小和尺寸分布。

引言

蔗糖铁（IS）是一种胶体溶液，由多核氢氧化铁-氧氧核和蔗糖的复合物组成的纳米颗粒组成。IS被广泛用于治疗患有多种基础疾病状态的患者的缺铁，这些患者不能耐受口服补铁或口服铁剂无效^1。IS属于美国食品和药物管理局（FDA）定义的复杂药物类别，是一类具有与生物制剂²相称的复杂化学的药物。复杂药物产品的监管评估可能需要额外的正交理化方法和/或临床前或临床研究，以准确比较后续复杂药物^3,4。这很重要，因为一些研究报告说，使用IS与后续IS产品不会产生相同的临床结果。这强调了使用适用于^检测IS产品之间物理化学性质差异的新型正交表征技术的重要性^5,6。

准确阐明IS的大小和尺寸分布具有临床意义，因为粒径是调理率和程度的主要影响因素 - 这些复杂药物生物分布的第一个关键步骤^7,8。即使粒径和粒径分布的微小变化也与氧化铁纳米颗粒复合物^9,10的药代动力学特征的变化有关。Brandis 等人最近的一项研究表明，当比较参考列出的药物和通用葡萄糖酸铁钠产品时，通过 DLS 测量的粒径（14.9 nm ± 0.1 nm 与 10.1 nm ± 0.1 nm，p < 0.001）显着不同¹¹。铁碳水化合物产品的批次间质量、安全性和有效性的一致性完全取决于制造工艺的放大，必须仔细考虑潜在的制造漂移⁹.制造过程可能导致残留蔗糖，这将因制造商^{而异 12}.制造工艺变量的任何修改都可能导致最终复杂药物产品在结构、复合物稳定性和体内处置方面的重大^变化9。

为了评估药物的一致性并预测药物的体内行为，需要当代正交分析方法来确定复杂纳米药物的物理化学性质。然而，方法缺乏标准化，这可能导致结果报告在实验室间存在很大差异¹³。尽管全球监管机构和科学界认识到这些挑战¹⁴，但IS的大多数理化特征仍然定义不清，现有监管指导文件中的关键质量属性的全部补充尚未定义¹⁵。FDA发布的铁碳水化合物复合物特定产品指导文件草案建议将DLS作为评估后续产品的大小和大小分布的程序^16,17。

一些出版物详细介绍了已建立的DLS协议来确定IS纳米颗粒尺寸^13,18。但是，由于已发布方法的样品制备、程序条件、仪器和仪器设置参数不同，因此在没有标准化方法来解释结果的情况下，无法直接比较DLS结果^13,18。方法和数据报告方法的多样性限制了为比较目的对这些特征进行适当评估¹⁹.重要的是，之前发布的许多用于评估IS的DLS协议都没有考虑到蔗糖在悬浮液中扩散的影响，因为游离蔗糖的存在已被证明会虚假地提高胶体溶液中纳米颗粒的Z平均值计算的流体动力学半径^13,18。本协议旨在标准化测量IS粒径和分布的方法。该方法已为此目的而开发和验证。

研究方案

1. 操作机器

1. 启动机器和软件
   注: 补充图 S1A-D 描述了启动机器和软件的步骤。
   1. 在开始测量前至少 30 分钟打开仪器，然后启动 PC。
   2. 双击 仪器软件图标 以启动程序。
   3. 在登录窗口中输入用户名和密码。确保每个用户都有自己的帐户。
   4. 等待右下角的所有三个黑条都亮起绿色，表示设备已准备好运行。
   5. 在长时间不活动的情况下，当用户自动注销时，在"安全性"下，单击"登录"，然后重新输入密码。
2. 创建测量文件
   注意:在每个测量日的开始时创建一个新的测量文件。所有测量值都列出并存储在测量文件中。有关此过程的详细信息，请参阅 补充图 S2A-B。
   1. 通过单击"文件"|" 创建新的测量文件新品 |测量文件。在打开的窗口中，选择存储位置，并命名测量文件。通过单击保存确认详细信息。
   2. 要打开文件，请单击" 文件"|"打开 |测量文件。在打开的窗口中选择测量文件，单击" 打开"确认详细信息，选择 文件名，然后单击 "保存"。
3. 打印结果
   1. 根据 补充图S3打印或保存系统适用性测试（SST）的结果（参见步骤1.5）和样品测量的平均值。
   2. 在测量文件的 记录视图中 标记 测量值。
   3. 右键单击 批量打印，然后等待另一个小窗口打开。
   4. 从选项中选择 PSD 强度报告 ，然后单击" 确定"进行确认。
4. 开始测量的一般程序
   注意:开始测量的过程在 补充图S4A-D中描述。按照下面概述的所需单位参数文件（称为 SOP）的路径进行操作:
   1. 从下拉列表中选择 所需的 SOP 。由于列表中显示了最近使用的 SOP，因此如果需要较旧的 SOP，请选择 浏览 SOP，然后单击 绿色箭头进行确认。SOP 的存储位置打开后，继续执行步骤 1.4.2。
      注:有关蔗糖铁特有的重要系统参数的详细信息（例如，衰减器的平衡时间），请参见 表1。
   2. 在打开的窗口中，在"示例名称和注释"下进行所需的输入。单击"确定"进行确认，然后等待测量窗口自动打开。
   3. 通过单击绿色的开始按钮 开始 测量。
   4. 一旦声音信号在测量结束时响起，请关闭 测量 窗口。
5. 系统适用性测试 （SST） 测量
   注意:请勿触摸比色皿的下部（测量区）。在序列的开始和结束时，测量20nm颗粒标准品。
   1. 将~1 mL未稀释的颗粒标准品填充到聚苯乙烯比色皿中，并盖上盖子。
      注意:步骤1.5.1中制备的稀释标准品可以使用1个月。
   2. 填充后，关闭比色皿，检查是否有气泡。轻轻敲击比色皿以去除气泡。
   3. 将比色皿放在仪器的池架中， 箭头标记 朝前，然后关闭测量室盖。
   4. 加载单位参数SOP，并在启动窗口中输入以下数据:
      样品名称: SST 20 nm 颗粒标准品
      然后，添加注释: 标准的标识符号和到期日期
   5. 开始测量。
   6. 测量结束后，当声音信号响起时，关闭测量窗口。
   7. 打印报告（见第 1.1.3 点）。
      注意:如果粒径 Z平均值 对应于 分析证书的值±10%，则通过SST。
6. 蔗糖铁溶液的测量
   1. 将 0.5 mL 铁含量为 2% m/V 的 IS 溶液移液到 25 mL 容量瓶中，并用低颗粒水填充至标记（例如新鲜去离子并过滤 [孔径 0.2 μm]）;该溶液含有0.4毫克铁/毫升。
      注意:样品制备在步骤1.6.1中。在方法开发过程中建立了这种特定的稀释度，并将其确定为用于此目的的最佳稀释度。
   2. 对于初步清洁，用准备好的测量溶液填充聚苯乙烯比色皿约3/4，轻轻旋转，然后尽可能完全清空。
      注意:请勿触摸比色皿的下部（测量区），不要摇晃比色皿，以免产生气泡。
   3. 测量时，将1 mL的测量溶液移入比色皿中，并盖上盖子。
   4. 检查比色皿中的测量溶液是否有气泡。如果有气泡，请轻轻敲击比色皿将其清除。
7. 执行测量
   1. 将装有测量溶液的塑料比色皿放入设备中， 箭头标记 朝前，然后盖上盖子。
   2. 加载参数 SOP（参见步骤 1.4.1），并在启动窗口中输入以下数据:
      样品名称:批号
   3. 开始测量。
   4. 测量结束后，当声音信号响起时，关闭 测量 窗口。
   5. 根据 补充图S5计算六个单独测量值的平均值。在测量文件的"记录" 视图中 标记单个 测量值，右键单击 "创建平均结果"，在" 样品名称"下添加平均值的名称，然后单击" 确定"进行确认。
   6. 等待软件在列表末尾创建新记录，然后在该记录中查找输入的名称和平均结果。
   7. 打印报告（请参阅步骤 1.1.3）。

结果

所述方法根据ICH Q2（R1）²⁰进行了验证，该方法涉及在不同条件下测量测试溶液。Z平均尺寸的精度仅为0.5%RSD，而PDI的计算最大RSD为3.5%。对于 Z 平均值大小，不同分析师和天数的平均结果仅相差 0.4%，PDI 相差 1.5%。统计数据是根据两位分析师在不同日期进行的 12 次测量计算得出的。测试浓度在50%-200%范围内的变化以及测试溶液在冷藏条件下储存长达5天都没有影响最终结果。

讨论

DLS已成为确定纳米颗粒尺寸和尺寸分布的基本方法，用于药物开发和监管评估。尽管DLS技术取得了进步，但在稀释剂选择和样品制备方面仍然存在方法学挑战，这与胶体溶液中的铁-碳水化合物复合物尤其相关。重要的是，铁碳水化合物纳米药物的DLS方法尚未在生物学环境（例如血浆）中得到广泛研究²²。因此，仍然迫切需要根据稀释剂的选择来协调最佳实践方案。稀释剂的选择?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Zetasizer Nano ZS	Malvern	NA	equipped with Zetasizer software 7.12, Helium Neon laser (633 nm, max. 4 mW) and 173° backscattering geometry
Materials
Disposable plastic cuvettes
LLG-Disposable plastic cells	LLG labware	LLG-Küvetten, Makro, PS; Order number 9.406011
low-particle water			(The use of freshly deionized and filtered (pore size 0.2 μm) water is recommended).
Microlitre pipette
Venofer 100 mg/5 mL	Vifor Pharma
Volumetric flask 25 mL
Nanosphere	Thermo	3020A	Particle Standard
Software
Origin Pro v.8.5	Origin Lab Corporation