Analyse dynamique de diffusion de la lumière pour la détermination de la taille des particules de complexes fer-glucides

Résumé

La diffusion dynamique de la lumière (DLS) est apparue comme un test approprié pour évaluer la taille et la distribution des particules de complexes fer-glucides administrés par voie intraveineuse. Cependant, les protocoles manquent de normalisation et doivent être modifiés pour chaque complexe fer-glucides analysé. Le présent protocole décrit l’application et les considérations spéciales pour l’analyse du saccharose de fer.

Résumé

Les complexes de nanoparticules fer-glucides administrés par voie intraveineuse sont largement utilisés pour traiter la carence en fer. Cette classe comprend plusieurs complexes de nanoparticules structurellement hétérogènes, qui présentent une sensibilité variable aux conditions requises pour les méthodologies disponibles pour caractériser physicochimiquement ces agents. À l’heure actuelle, les attributs de qualité critiques des complexes fer-glucides n’ont pas été entièrement établis. La diffusion dynamique de la lumière (DLS) est apparue comme une méthode fondamentale pour déterminer la taille et la distribution des particules intactes. Cependant, des défis subsistent en ce qui concerne la normalisation des méthodologies entre les laboratoires, les modifications spécifiques requises pour les produits individuels à base de glucides de fer et la meilleure façon de décrire la distribution granulométrique. Il est important de noter que les diluants et les dilutions en série utilisés doivent être normalisés. La grande variance des approches pour la préparation des échantillons et la communication des données limite l’utilisation de la DLS pour la comparaison des agents fer-glucides. Ici, nous détaillons un protocole robuste et facilement reproductible pour mesurer la taille et la distribution granulométrique du complexe fer-glucides, le saccharose de fer, en utilisant la moyenne Z et l’indice de polydispersité.

Introduction

Le saccharose de fer (IS) est une solution colloïdale composée de nanoparticules constituées d’un complexe d’un noyau polynucléaire d’oxyhydroxyde de fer et de saccharose. IS est largement utilisé pour traiter la carence en fer chez les patients atteints d’une grande variété d’états pathologiques sous-jacents qui ne tolèrent pas la supplémentation orale en fer ou pour lesquels le fer oral n’est pas efficace¹. IS appartient à la classe de médicaments complexes tels que définis par la Food and Drug Administration (FDA), qui est une classe de médicaments avec une chimie complexe proportionnelle aux produits biologiques². L’évaluation réglementaire des médicaments complexes peut nécessiter des méthodes physicochimiques orthogonales supplémentaires et/ou des études précliniques ou cliniques pour comparer avec précision les médicaments complexes de suivi ^3,4. Ceci est important parce que plusieurs études ont rapporté que l’utilisation de la SI par rapport à un produit de suivi ne produit pas les mêmes résultats cliniques. Cela souligne l’importance de l’utilisation de techniques de caractérisation nouvelles et orthogonales qui conviennent pour détecter les différences dans les propriétés physico-chimiques entre les produits IS ^5,6.

L’élucidation précise de la taille et de la distribution granulométrique de la SI est d’une importance clinique, car la taille des particules est un facteur influent majeur dans le taux et l’étendue de l’opsonisation - la première étape critique dans la biodistribution de ces médicaments complexes ^7,8. Même de légères variations dans la taille des particules et la distribution granulométrique ont été liées à des modifications du profil pharmacocinétique des complexes de nanoparticules d’oxyde de fer ^9,10. Une étude récente de Brandis et coll. a montré que la taille des particules mesurée par DLS était significativement différente (14,9 nm ± 0,1 nm contre 10,1 nm ± 0,1 nm, p < 0,001) lorsqu’on compare un médicament de référence et un gluconate ferrique de sodium générique, respectivement¹¹. La qualité, l’innocuité et l’efficacité constantes d’un lot à l’autre des produits glucidiques de fer dépendent entièrement de la mise à l’échelle du processus de fabrication, et la dérive potentielle de fabrication doit être soigneusement examinée⁹. Le procédé de fabrication peut entraîner la production de saccharose résiduel, et cela varie en fonction du fabricant¹². Toute modification des variables du procédé de fabrication peut entraîner des changements importants dans le produit pharmaceutique complexe final en ce qui concerne la structure, la stabilité complexe et la disposition in vivo ⁹.

Pour évaluer la cohérence du médicament et prédire son comportement in vivo, des méthodologies analytiques orthogonales contemporaines sont nécessaires pour déterminer les propriétés physico-chimiques de nanomédicaments complexes. Cependant, il y a un manque de normalisation des méthodologies, ce qui peut entraîner un degré élevé de variation interlaboratoires dans la communication des résultats¹³. Malgré la reconnaissance de ces défis par les autorités réglementaires mondiales et la communauté scientifique¹⁴, la plupart des caractéristiques physico-chimiques des SI restent mal définies, et l’ensemble des attributs de qualité critiques dans le contexte des documents d’orientation réglementaires disponibles n’a pas été défini¹⁵. Les projets de documents d’orientation spécifiques aux produits publiés par la FDA pour les complexes fer-glucides suggèrent le DLS comme procédure d’évaluation de la taille et de la distribution granulométrique des produits de suite^16,17.

Plusieurs publications ont détaillé les protocoles DLS établis pour déterminer les dimensions des nanoparticules IS^13,18. Toutefois, étant donné que la préparation de l’échantillon, les conditions de procédure, l’instrumentation et les paramètres de réglage de l’instrumentation diffèrent d’une méthode publiée à l’autre, les résultats du DLS ne peuvent pas être comparés directement en l’absence d’une méthode normalisée pour interpréter les résultats^13,18. La diversité des méthodologies et des méthodes de communication des données limite l’évaluation appropriée de ces caractéristiques à des fins de comparaison¹⁹. Il est important de noter que bon nombre des protocoles DLS précédemment publiés pour évaluer les IS ne tiennent pas compte de l’effet de la diffusion du saccharose dans la suspension en raison de la présence de saccharose libre, qui a été montré pour élever faussement les rayons hydrodynamiques calculés par la moyenne Z des nanoparticules dans les solutions colloïdales^13,18. Le présent protocole vise à normaliser la méthodologie de mesure de la taille et de la distribution des particules de l’IS. La méthode a été développée et validée à cette fin.

Protocole

1. Utilisation de la machine

1. Démarrage de la machine et du logiciel
   REMARQUE : La figure supplémentaire S1A-D décrit les étapes de démarrage de la machine et du logiciel.
   1. Allumez l’instrument au moins 30 minutes avant de commencer les mesures, puis démarrez le PC.
   2. Double-cliquez sur l’icône du logiciel de l’instrument pour démarrer le programme.
   3. Entrez le nom d’utilisateur et le mot de passe dans la fenêtre de connexion. Assurez-vous que chaque utilisateur a son propre compte.
   4. Attendez que les trois barres noires dans le coin inférieur droit s’allument en vert, indiquant que l’appareil est prêt à fonctionner.
   5. En cas de longues périodes d’inactivité, lorsque l’utilisateur est automatiquement déconnecté, sous Sécurité, cliquez sur Connexion et entrez à nouveau le mot de passe.
2. Création d’un fichier de mesure
   REMARQUE : Un nouveau fichier de mesure est créé au début de chaque jour de mesure. Toutes les mesures sont répertoriées et stockées dans le fichier de mesure. Pour plus de détails sur cette procédure, voir la figure supplémentaire S2A-B.
   1. Créez un nouveau fichier de mesure en cliquant sur Fichier | Nouveau | Fichier de mesure. Dans la fenêtre ouverte, sélectionnez l’emplacement de stockage et nommez le fichier de mesure. Confirmez les détails en cliquant sur Enregistrer.
   2. Pour ouvrir un fichier, cliquez sur Fichier | Ouvert | Fichier de mesure. Sélectionnez le fichier de mesure dans la fenêtre ouverte, confirmez les détails en cliquant sur Ouvrir, sélectionnez le nom du fichier et cliquez sur Enregistrer.
3. Impression des résultats
   1. Imprimez ou sauvegardez les résultats du test d’adéquation du système (SST) (voir étape 1.5) et la valeur moyenne de la mesure de l’échantillon conformément à la figure supplémentaire S3.
   2. Marquez la ou les mesures dans la vue Enregistrements du fichier de mesure.
   3. Cliquez avec le bouton droit sur Batch Print et attendez qu’une autre petite fenêtre s’ouvre.
   4. Sélectionnez le rapport Intensité PSD parmi les choix et confirmez-le en cliquant sur OK.
4. Procédure générale pour démarrer une mesure
   NOTA: La procédure de démarrage d’une mesure est décrite à la figure supplémentaire S4A-D. Suivez le chemin décrit ci-dessous pour le fichier de paramètres unitaires requis (appelé SOP) :
   1. Sélectionnez la POS requise dans la liste déroulante. Étant donné que les dernières POS utilisées sont affichées dans la liste, si une POS plus ancienne est nécessaire, sélectionnez Rechercher une POS et confirmez en cliquant sur la flèche verte. Une fois l’emplacement de stockage des SOP ouvert, passez à l’étape 1.4.2.
      REMARQUE : Pour plus de détails sur les paramètres importants du système propres au saccharose de fer (par exemple, le temps d’équilibrage d’un atténuateur), voir le tableau 1.
   2. Dans la fenêtre ouverte, effectuez les entrées requises sous Nom de l’échantillon et Notes. Confirmez en cliquant sur OK et attendez que la fenêtre de mesure s’ouvre automatiquement.
   3. Démarrez la mesure en cliquant sur le bouton vert Démarrer .
   4. Une fois qu’un signal acoustique retentit à la fin de la mesure, fermez la fenêtre de mesure .
5. Mesure du test d’adéquation du système (SST)
   NOTE: Ne touchez pas la partie inférieure de la cuvette (zone de mesure). Au début et à la fin de la séquence, mesurer l’étalon de particules de 20 nm.
   1. Remplir ~1 mL de l’étalon de particules non diluées dans une cuvette de polystyrène et fermer avec le couvercle.
      NOTE: L’étalon dilué préparé à l’étape 1.5.1 peut être utilisé pendant 1 mois.
   2. Après le remplissage, fermez la cuvette et vérifiez s’il n’y a pas de bulles d’air. Enlevez les bulles d’air en tapotant légèrement la cuvette.
   3. Placez la cuvette dans le support de cellule de l’instrument avec la flèche tournée vers l’avant et fermez le couvercle de la chambre de mesure.
   4. Chargez le paramètre d’unité SOP et entrez les données suivantes dans la fenêtre de démarrage :
      Nom de l’échantillon: SST 20 nm Particle Standard
      Ensuite, ajoutez une note: Numéro d’identification et date d’expiration de la norme
   5. Démarrez la mesure.
   6. Après la fin de la mesure, lorsque le signal acoustique retentit, fermez la fenêtre de mesure.
   7. Imprimer le rapport (voir point 1.1.3).
      NOTE: Le SST est réussi si la taille des particules Z-moyenne correspond à la valeur du certificat d’analyse ± 10%.
6. Mesure de la solution de saccharose de fer
   1. Introduire à la pipette 0,5 mL d’une solution IS d’une teneur en fer de 2 % m/V dans une fiole jaugée de 25 mL et remplir jusqu’au trait de jauge avec de l’eau à faible teneur en particules (p. ex. fraîchement désionisée et filtrée [taille des pores 0,2 μm]); cette solution contient 0,4 mg Fe/mL.
      NOTA: La préparation de l’échantillon à l’étape 1.6.1. Avec cette dilution spécifique a été établie au cours de l’élaboration de la méthode, et elle a été déterminée comme la dilution optimale à cette fin.
   2. Pour un nettoyage préliminaire, remplissez la cuvette de polystyrène aux 3/4 environ avec la solution de mesure préparée, agitez doucement, puis videz-la aussi complètement que possible.
      NOTE: Ne touchez pas la partie inférieure de la cuvette (zone de mesure), et évitez les bulles d’air en ne secouant pas la cuvette.
   3. Pour la mesure, pipeter 1 mL de la solution de mesure dans la cuvette et mettre sur un couvercle.
   4. Vérifiez la présence de bulles d’air dans la solution de mesure dans la cuvette. S’il y a des bulles d’air, retirez-les en tapotant légèrement la cuvette.
7. Exécution de la mesure
   1. Placez la cuvette en plastique avec la solution de mesure dans l’appareil, la flèche tournée vers l’avant, et fermez le couvercle.
   2. Chargez le paramètre SOP (voir étape 1.4.1) et entrez les données suivantes dans la fenêtre de démarrage :
      Nom de l’échantillon: Numéro de lot
   3. Démarrez la mesure.
   4. Après la fin de la mesure, lorsque le signal acoustique retentit, fermez la fenêtre de mesure .
   5. Calculer la valeur moyenne des six mesures individuelles conformément à la figure supplémentaire S5. Marquez les mesures individuelles dans la vue Enregistrements du fichier de mesure, cliquez avec le bouton droit sur Créer un résultat moyen, ajoutez le nom de la valeur moyenne sous Nom de l’échantillon et confirmez en cliquant sur OK.
   6. Attendez que le logiciel crée un nouvel enregistrement à la fin de la liste et recherchez le nom entré et le résultat moyenné dans cet enregistrement.
   7. Imprimez le rapport (voir étape 1.1.3).

Résultats

La méthode décrite a été validée conformément à la ligne directrice Q2(R1)²⁰ de l’ICH, qui impliquait la mesure de solutions d’essai dans différentes conditions. La précision n’était que de 0,5% RSD pour la taille moyenne Z, tandis qu’un maximum de 3,5% RSD a été calculé pour le PDI. Les résultats moyens des différents analystes et jours ne différaient que de 0,4% pour la taille moyenne Z et de 1,5% pour le PDI. Les statistiques ont été calculées à partir de 12 mesures ...

Discussion

Le DLS est devenu un test fondamental pour la détermination de la taille et de la distribution granulométrique des nanoparticules pour des applications dans le développement de médicaments et l’évaluation réglementaire. Malgré les progrès réalisés dans les techniques DLS, des défis méthodologiques subsistent en ce qui concerne la sélection des diluants et la préparation des échantillons, qui sont particulièrement pertinents pour les complexes fer-glucides dans les solutions colloïdales. Il est importan...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Zetasizer Nano ZS	Malvern	NA	equipped with Zetasizer software 7.12, Helium Neon laser (633 nm, max. 4 mW) and 173° backscattering geometry
Materials
Disposable plastic cuvettes
LLG-Disposable plastic cells	LLG labware	LLG-Küvetten, Makro, PS; Order number 9.406011
low-particle water			(The use of freshly deionized and filtered (pore size 0.2 μm) water is recommended).
Microlitre pipette
Venofer 100 mg/5 mL	Vifor Pharma
Volumetric flask 25 mL
Nanosphere	Thermo	3020A	Particle Standard
Software
Origin Pro v.8.5	Origin Lab Corporation