鉄-炭水化物複合体の粒径測定のための動的光散乱分析

要約

動的光散乱(DLS)は、静脈内投与された鉄-炭水化物複合体の粒子サイズおよび分布を評価するための適切なアッセイとして浮上している。ただし、プロトコルは標準化されておらず、分析する鉄-炭水化物複合体ごとに変更する必要があります。本プロトコルは、鉄スクロースの分析のための適用および特別な考慮事項を記載する。

要約

静脈内投与された鉄 - 炭水化物ナノ粒子複合体は、鉄欠乏症の治療に広く使用されている。このクラスには、いくつかの構造的に不均一なナノ粒子複合体が含まれ、これらの薬剤を物理化学的に特徴付けるために利用可能な方法論に必要な条件に対してさまざまな感度を示します。現在、鉄 - 炭水化物複合体の重要な品質属性は完全には確立されていない。動的光散乱(DLS)は、無傷の粒子サイズと分布を決定するための基本的な方法として浮上しています。しかし、ラボ間での方法論の標準化、個々の鉄炭水化物製品に必要な特定の変更、およびサイズ分布を最もよく記述する方法に関しては、依然として課題が残っています。重要なのは、使用する希釈液と段階希釈液を標準化する必要があることです。サンプル調製とデータ報告のアプローチが大きく異なるため、鉄-炭水化物剤の比較にDLSを使用することは限られています。ここでは、Z平均および多分散指数を使用して、鉄-炭水化物複合体である鉄スクロースのサイズおよびサイズ分布を測定するための堅牢で容易に再現可能なプロトコルについて詳述する。

概要

鉄スクロース(IS)は、多核鉄オキシ水酸化物コアとスクロースの複合体からなるナノ粒子で構成されるコロイド溶液です。ISは、経口鉄補給に耐えられない、または経口鉄が有効でないさまざまな基礎疾患状態の患者の鉄欠乏症の治療に広く使用されています¹。ISは、食品医薬品局(FDA)によって定義された複雑な薬物の薬物クラスに属し、生物学的製剤²に見合った複雑な化学的性質を持つ薬物のクラスです。複雑な医薬品の規制評価では、後続の複雑な医薬品を正確に比較するために、追加の直交物理化学的方法および/または前臨床または臨床試験が必要になる場合があります^3,4。いくつかの研究で、ISと後続IS製品の使用が同じ臨床転帰をもたらさないことが報告されているため、これは重要です。これは、IS製品間の物理化学的特性の違いを検出するのに適した新規で直交する特性評価技術の使用の重要性を強調しています^5,6。

粒子サイズはオプソニン化の速度と程度に大きな影響を与える要因であり、これらの複雑な薬物の生体内分布における最初の重要なステップであるため、ISのサイズとサイズ分布の正確な解明は臨床的に重要です^7,8。粒径および粒度分布のわずかな変動でさえ、酸化鉄ナノ粒子複合体の薬物動態プロファイルの変化に関連している9^、10。Brandisらによる最近の研究では、参照リストに記載されている薬物とジェネリックグルコン酸第二鉄ナトリウム製品をそれぞれ比較した場合、DLSによって測定された粒子サイズが有意に異なることが示されました(14.9 nm ± 0.1 nm対10.1 nm ± 0.1 nm、p < 0.001)。鉄炭水化物製品の一貫したバッチ間の品質、安全性、および有効性は、製造プロセスのスケールアップに完全に依存しており、潜在的な製造ドリフトを^{慎重に考慮する必要があります}9。製造工程は残留スクロースをもたらす可能性があり、これは製造業者¹²によって異なるであろう。製造プロセス変数に変更を加えると、構造、複雑な安定性、およびin vivoの性質に関して、最終的な複雑な薬物製品に大きな変化が生じる^{可能性があります9。}

薬物の一貫性を評価し、薬物のin vivo挙動を予測するには、複雑なナノ医薬品の物理化学的特性を決定するための最新の直交分析方法論が必要です。ただし、方法論の標準化が不足しているため、結果報告に実験室間のばらつきが大きくなる可能性があります¹³。世界の規制当局と科学界がこれらの課題を認識しているにもかかわらず¹⁴、ISの物理化学的特性のほとんどは十分に定義されておらず、利用可能な規制ガイダンス文書の文脈における重要な品質属性の完全な補完は定義されていません¹⁵。鉄-炭水化物複合体についてFDAが発行した製品固有のガイダンス文書の草案は、後続製品のサイズとサイズ分布を評価する手順としてDLSを示唆しています^16,17。

いくつかの刊行物は、ISナノ粒子の寸法を決定するために確立されたDLSプロトコルを詳述している^13、18。ただし、サンプル調製、手順条件、インスツルメンテーション、およびインスツルメンテーション設定パラメータは公開されている方法間で異なるため、結果を解釈するための標準化された方法がない場合、DLS結果を直接比較することはできません^13,18。方法論とデータ報告アプローチの多様性は、比較目的でこれらの特性の適切な評価を制限します¹⁹。重要なことに、ISを評価するために以前に公開されたDLSプロトコルの多くは、遊離スクロースの存在による懸濁液中のスクロースの拡散の影響を考慮しておらず、コロイド溶液中のナノ粒子のZ平均計算された流体力学的半径を偽りに上昇させることが示されている^13、18。本プロトコルは、ISの粒径および分布の測定方法を標準化することを目的としている。この方法は、この目的のために開発され、検証されています。

プロトコル

1.機械の操作

1. マシンとソフトウェアの起動
   メモ: 補足図S1A-Dは 、マシンとソフトウェアを起動する手順を説明しています。
   1. 測定を開始する少なくとも30分前に機器の電源を入れてから、PCを起動します。
   2. 計測器ソフトウェアアイコンをダブルクリックして、プログラムを開始します。
   3. ログインウィンドウにユーザー名とパスワードを入力します。各ユーザーが自分のアカウントを持っていることを確認します。
   4. 右下隅にある3つの黒いバーがすべて緑色に点灯し、ユニットが操作の準備ができていることを示すまで待ちます。
   5. 非アクティブな状態が長時間続く場合、ユーザーが自動的にログアウトしたら、[セキュリティ] で [ログイン] をクリックし、パスワードを再入力します。
2. 測定ファイルの作成
   注意: 新しい測定ファイルは、各測定日の初めに作成されます。すべての測定値が一覧表示され、測定ファイルに保存されます。この手順の詳細については、 補足図S2A-Bを参照してください。
   1. ファイルをクリックして新しい測定ファイルを作成します |新規 |測定ファイル。開いたウィンドウで、 保存場所を選択し、測定ファイルに 名前を付け ます。 [保存]をクリックして詳細を確認します。
   2. ファイルを開くには、[ ファイル] |開館時間 |測定ファイル。開いたウィンドウで測定ファイルを選択し、[ 開く]をクリックして詳細を確認し、 ファイル名を選択して [保存]をクリックします。
3. 結果の印刷
   1. システム適合性テスト(SST)の結果(手順1.5を参照)と、 補足図S3に従ってサンプル測定の平均値を印刷または保存します。
   2. 測定ファイルのレコードビューで測定値をマークします。
   3. バッチ印刷を右クリックし、別の小さなウィンドウが開くのを待ちます。
   4. 選択肢から PSD強度レポート を選択し、[ OK]をクリックして確認します。
4. 測定を開始するための一般的な手順
   注意: 測定を開始する手順は、 補足図S4A-Dに記載されています。必要なユニットパラメータファイル(SOPと呼ばれる)について、以下に概説するパスに従ってください。
   1. ドロップダウンリストから 必要なSOP を選択します。最近使用したSOPがリストに表示されるため、古いSOPが必要な場合は、[ SOPの参照]を選択し、 緑色の矢印をクリックして確定します。SOPの保存場所が開いたら、手順1.4.2に進みます。
      注:鉄スクロースに固有の重要なシステムパラメータ(減衰器の平衡時間など)の詳細については、 表1を参照してください。
   2. 開いたウィンドウで、[ サンプル名 と メモ]で必要なエントリを作成します。 OKをクリックして確定し、測定ウィンドウが自動的に開くのを待ちます。
   3. 緑色の [開始 ]ボタンをクリックして測定を開始します。
   4. 測定の最後に音響信号が鳴ったら、 測定 ウィンドウを閉じます。
5. システム適合性テスト(SST)測定
   注意: キュベットの下部(測定ゾーン)には触れないでください。シーケンスの開始時と終了時に、20 nmの粒子標準を測定します。
   1. 希釈していない粒子標準物質~1 mLをポリスチレンキュベットに充填し、蓋をして閉じます。
      注意: ステップ1.5.1で調製した希釈標準物質は1ヶ月間使用できます。
   2. 充填後、キュベットを閉じて気泡を確認します。キュベットを軽くたたいて気泡を取り除きます。
   3. 矢印マークを前に向けてキュベットを機器のセルホルダーに入れ、測定チャンバーカバーを閉じます。
   4. 単位パラメータSOPをロードし、開始ウィンドウに以下のデータを入力します。
      サンプル名: SST 20のnmの粒子の標準
      次に、メモを追加します: 標準の識別子番号と有効期限
   5. 測定を開始します。
   6. 音響信号が鳴ったときに測定が終了したら、測定ウィンドウを閉じます。
   7. レポートを印刷します(ポイント1.1.3を参照)。
      注:粒子サイズの Z平均 が 分析証明書の値±10%に対応する場合、SSTは合格です。
6. 鉄スクロース溶液の測定
   1. 鉄含有量2%m/VのIS溶液0.5 mLを25 mLメスフラスコにピペットで入れ、低粒子水(例:新たに脱イオンしてろ過した[孔径0.2 μm])でマークまで満たします。この溶液には0.4 mgのFe/mLが含まれています。
      注意: ステップ1.6.1のサンプル調製。これにより、メソッド開発中に特定の希釈が確立され、これがこの目的に最適な希釈として決定されました。
   2. 予備洗浄のために、ポリスチレンキュベットを調製した測定溶液で約3/4いっぱい満たし、穏やかに旋回させてから、できるだけ完全に空にします。
      注意: キュベットの下部(測定ゾーン)に触れたり、キュベットを振らないように気泡を避けたりしないでください。
   3. 測定のために、測定溶液1mLをキュベットにピペットで入れ、蓋をした。
   4. キュベット内の測定溶液に気泡がないか確認してください。気泡がある場合は、キュベットを軽くたたいて気泡を取り除きます。
7. 測定の実行
   1. 矢印マークを前に向けて、測定溶液の入ったプラスチックキュベットを装置に入れ、蓋を閉めます。
   2. パラメータSOPをロードし(ステップ1.4.1を参照)、スタートウィンドウに以下のデータを入力します。
      サンプル名: バッチ番号
   3. 測定を開始します。
   4. 測定終了後、音響信号が鳴ったら、 測定 ウィンドウを閉じます。
   5. 6つの個別測定値の平均値を補足図S5に従って算出する。測定ファイルのレコードビューで個々の測定値をマークし、[平均結果の作成]を右クリックし、[サンプル名]の下に平均値の名前を追加して、[OK]をクリックして確認します。
   6. ソフトウェアがリストの最後に新しいレコードを作成するのを待ち、入力された名前とそのレコードの平均結果を探します。
   7. レポートを印刷します (手順 1.1.3 を参照)。

結果

記載されている方法は、さまざまな条件下での試験溶液の測定を含むICH Q2(R1)²⁰に従って検証されました。精度はZ平均サイズでわずか0.5%のRSDでしたが、PDIでは最大3.5%のRSDが計算されました。異なるアナリストと日の平均結果は、Z平均サイズで0.4%、PDIで1.5%しか異なっていませんでした。統計は、2人のアナリストがさまざまな日に実施した12の測定から計算されました。50%〜2...

ディスカッション

DLSは、医薬品開発や規制評価への応用のために、ナノ粒子のサイズとサイズ分布を決定するための基本的なアッセイとなっています。DLS技術の進歩にもかかわらず、希釈剤の選択とサンプル調製に関して方法論的な課題が依然として存在し、特にコロイド溶液中の鉄-炭水化物複合体に関連しています。重要なことに、鉄-炭水化物ナノ医薬品のDLS法は、生物学的環境(血漿など)ではまだ広く研...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Zetasizer Nano ZS	Malvern	NA	equipped with Zetasizer software 7.12, Helium Neon laser (633 nm, max. 4 mW) and 173° backscattering geometry
Materials
Disposable plastic cuvettes
LLG-Disposable plastic cells	LLG labware	LLG-Küvetten, Makro, PS; Order number 9.406011
low-particle water			(The use of freshly deionized and filtered (pore size 0.2 μm) water is recommended).
Microlitre pipette
Venofer 100 mg/5 mL	Vifor Pharma
Volumetric flask 25 mL
Nanosphere	Thermo	3020A	Particle Standard
Software
Origin Pro v.8.5	Origin Lab Corporation