Análise dinâmica de espalhamento de luz para a determinação do tamanho de partículas de complexos ferro-carboidrato

Resumo

O espalhamento dinâmico de luz (DLS) surgiu como um ensaio adequado para avaliar o tamanho de partículas e a distribuição de complexos ferro-carboidratos administrados por via intravenosa. No entanto, os protocolos carecem de padronização e precisam ser modificados para cada complexo ferro-carboidrato analisado. O presente protocolo descreve a aplicação e considerações especiais para a análise da sacarose ferrosa.

Resumo

Complexos de nanopartículas ferro-carboidrato administrados por via intravenosa são amplamente utilizados para tratar a deficiência de ferro. Esta classe inclui vários complexos de nanopartículas estruturalmente heterogêneos, que exibem sensibilidade variável às condições requeridas para as metodologias disponíveis para caracterizar físico-quimicamente esses agentes. Atualmente, os atributos críticos de qualidade dos complexos ferro-carboidrato ainda não estão totalmente estabelecidos. O espalhamento dinâmico de luz (DLS) surgiu como um método fundamental para determinar o tamanho e a distribuição de partículas intactas. No entanto, ainda existem desafios em relação à padronização de metodologias entre laboratórios, modificações específicas necessárias para produtos individuais de ferro-carboidrato e como a distribuição de tamanho pode ser melhor descrita. É importante ressaltar que o diluente e as diluições seriadas utilizadas devem ser padronizados. A grande variância nas abordagens para preparação de amostras e relato de dados limita o uso de DLS para a comparação de agentes ferro-carboidratos. Neste artigo, detalhamos um protocolo robusto e facilmente reprodutível para medir o tamanho e a distribuição de tamanho do complexo ferro-carboidrato, a sacarose de ferro, usando a média Z e o índice de polidispersidade.

Introdução

Sacarose de ferro (IS) é uma solução coloidal composta por nanopartículas consistindo de um complexo de um núcleo polinuclear de ferro-oxihidróxido e sacarose. O SI é amplamente empregado para tratar a deficiência de ferro entre pacientes com uma ampla variedade de estados patológicos subjacentes que não toleram a suplementação oral de ferro ou para os quais o ferro oral não é eficaz¹. O SI pertence à classe de fármacos complexos definida pela Food and Drug Administration (FDA), que é uma classe de fármacos com química complexa compatível com os biológicos². A avaliação regulatória de fármacos complexos pode requerer métodos físico-químicos ortogonais adicionais e/ou estudos pré-clínicos ou clínicos para comparar com precisão os fármacos complexos de follow-on ^3,4. Isso é importante porque vários estudos relataram que o uso de SI versus um produto de SI de acompanhamento não produz os mesmos desfechos clínicos. Isso ressalta a criticidade do uso de técnicas de caracterização novas e ortogonais adequadas para detectar diferenças nas propriedades físico-químicas entre os produtos de SI ^5,6.

A elucidação precisa do tamanho e da distribuição de tamanho do SI é de importância clínica, uma vez que o tamanho das partículas é um importante fator influente na taxa e extensão da opsonização, o primeiro passo crítico na biodistribuição desses complexos fármacos ^7,8. Mesmo pequenas variações no tamanho de partículas e distribuição de tamanho de partículas têm sido relacionadas a mudanças no perfil farmacocinético de complexos nanoparticulados de óxido de ferro ^9,10. Um estudo recente de Brandis e col. mostrou que o tamanho das partículas medidas pela DLS foi significativamente diferente (14,9 nm ± 0,1 nm vs. 10,1 nm ± 0,1 nm, p < 0,001) quando comparados um medicamento de referência listado e um produto genérico de gluconato férrico de sódio, respectivamente¹¹. A qualidade, a segurança e a eficácia consistentes de lote a lote dos produtos de carboidrato de ferro dependem inteiramente do aumento da escala do processo de fabricação, e a possível deriva de fabricação deve ser cuidadosamente considerada⁹. O processo de fabricação pode resultar em sacarose residual, que varia de acordo com o fabricante¹². Quaisquer modificações nas variáveis do processo de fabricação podem levar a mudanças significativas no produto final do fármaco complexo no que diz respeito à estrutura, estabilidade complexa e disposição in vivo ⁹.

Para avaliar a consistência do fármaco e predizer o comportamento in vivo do fármaco, metodologias analíticas ortogonais contemporâneas são necessárias para determinar as propriedades físico-químicas de nanomedicamentos complexos. No entanto, há falta de padronização das metodologias, o que pode resultar em um alto grau de variação interlaboratorial no relato dos resultados¹³. Apesar do reconhecimento desses desafios pelas autoridades regulatórias globais e pela comunidade científica¹⁴, a maioria das características físico-químicas dos SI permanece pouco definida, e o complemento completo dos atributos críticos de qualidade no contexto dos documentos de orientação regulatória disponíveis não foi definido¹⁵. Os rascunhos de documentos de orientação específicos de produtos emitidos pelo FDA para complexos ferro-carboidrato sugerem a DLS como um procedimento para avaliar o tamanho e a distribuição de tamanho dos produtos de follow-on^16,17.

Várias publicações têm detalhado protocolos de DLS estabelecidos para determinar as dimensões das nanopartículas de^SI13,18. No entanto, como a preparação da amostra, as condições do procedimento, a instrumentação e os parâmetros de ajuste da instrumentação são diferentes entre os métodos publicados, os resultados do DLS não podem ser diretamente comparados na ausência de um método padronizado para interpretar os resultados^13,18. A diversidade de metodologias e abordagens de relato de dados limita a avaliação adequada dessas características para fins comparativos¹⁹. É importante ressaltar que muitos dos protocolos de DLS publicados anteriormente para avaliar o SI não explicam o efeito da difusão da sacarose na suspensão devido à presença de sacarose livre, que demonstrou elevar espuriosamente os raios hidrodinâmicos calculados pela média Z das nanopartículas em soluções coloidais^13,18. O presente protocolo visa padronizar a metodologia para a medição do tamanho de partícula e distribuição do SI. O método foi desenvolvido e validado para este fim.

Protocolo

1. Operação da máquina

1. Iniciando a máquina e o software
   NOTA: A Figura Suplementar S1A-D descreve as etapas para iniciar a máquina e o software.
   1. Ligue o instrumento pelo menos 30 minutos antes de iniciar as medições e, em seguida, ligue o PC.
   2. Clique duas vezes no ícone do software do instrumento para iniciar o programa.
   3. Digite o nome de usuário e a senha na janela de login. Certifique-se de que cada usuário tenha sua própria conta.
   4. Aguarde até que as três barras pretas no canto inferior direito acendam verde, indicando que a unidade está pronta para operação.
   5. No caso de longos períodos de inatividade, quando o usuário for desconectado automaticamente, em Segurança, clique em Login e digite novamente a senha.
2. Criando um arquivo de medição
   NOTA: Um novo arquivo de medição é criado no início de cada dia de medição. Todas as medições são listadas e armazenadas no arquivo de medição. Para obter detalhes desse procedimento, consulte Figura suplementar S2A-B.
   1. Crie um novo arquivo de medição clicando em Arquivo | Novo | Arquivo de medição. Na janela aberta, selecione o local de armazenamento e nomeie o arquivo de medição. Confirme os detalhes clicando em Salvar.
   2. Para abrir um arquivo, clique em Arquivo | Aberto | Arquivo de medição. Selecione o arquivo de medição na janela aberta, confirme os detalhes clicando em Abrir, selecione o nome do arquivo e clique em Salvar.
3. Imprimindo os resultados
   1. Imprimir ou guardar os resultados do teste de adequação do sistema (TSM) (ver passo 1.5) e o valor médio da medição da amostra de acordo com a Figura Suplementar S3.
   2. Marque a(s) medida(s) na Visualização de Registros do Arquivo de Medição.
   3. Clique com o botão direito do mouse em Batch Print e aguarde até que outra pequena janela seja aberta.
   4. Selecione o relatório de Intensidade PSD nas opções e confirme-o clicando em OK.
4. Procedimento geral para iniciar uma medição
   NOTA: O procedimento para iniciar uma medição é descrito na Figura suplementar S4A-D. Siga o caminho descrito abaixo para o arquivo de parâmetro de unidade necessário (conhecido como SOP):
   1. Selecione o SOP necessário na lista suspensa. Como os POPs usados mais recentemente são exibidos na lista, se um SOP mais antigo for necessário, selecione Procurar SOP e confirme clicando na seta verde. Assim que o local de armazenamento dos POPs for aberto, prossiga com a etapa 1.4.2.
      NOTA: Para obter detalhes sobre os parâmetros importantes do sistema específicos para a sacarose de ferro (por exemplo, tempo de equilíbrio de um atenuador), consulte a Tabela 1.
   2. Na janela aberta, faça as entradas necessárias em Nome do exemplo e Anotações. Confirme clicando em OK e aguarde até que a janela de medição seja aberta automaticamente.
   3. Inicie a medição clicando no botão verde Iniciar .
   4. Quando um sinal acústico soar no final da medição, feche a janela de medição .
5. Medição do teste de adequação do sistema (TSM)
   NOTA: Não toque na parte inferior da cubeta (zona de medição). No início e no final da sequência, meça o padrão de partículas de 20 nm.
   1. Encha ~1 mL do padrão de partículas não diluídas em uma cubeta de poliestireno e feche com a tampa.
      NOTA: O padrão diluído preparado na etapa 1.5.1 pode ser usado por 1 mês.
   2. Após o enchimento, feche a cubeta e verifique se há bolhas de ar. Remova as bolhas de ar batendo levemente na cubeta.
   3. Coloque a cubeta no suporte da célula do instrumento com a marca de seta voltada para a frente e feche a tampa da câmara de medição.
   4. Carregue o parâmetro de unidade SOP e insira os seguintes dados na janela inicial:
      Nome da amostra: SST 20 nm padrão de partícula
      Em seguida, adicione uma observação: Número identificador e data de validade do padrão
   5. Inicie a medição.
   6. Após o término da medição, quando soar o sinal acústico, feche a janela de medição.
   7. Imprimir o relatório (ver ponto 1.1.3).
      NOTA: O SST é passado se o tamanho da partícula Z-média corresponde ao valor do certificado de análise ± 10%.
6. Medição da solução de sacarose de ferro
   1. Pipetar 0,5 ml de uma solução de SI com um teor de ferro de 2% m/V para um balão volumétrico de 25 ml e encher até ao traço com água de baixas partículas (por exemplo, recém-desionizada e filtrada [tamanho dos poros 0,2 μm]); esta solução contém 0,4 mg Fe/ml.
      NOTA: A preparação da amostra na etapa 1.6.1. com esta diluição específica foi estabelecida durante o desenvolvimento do método, e esta foi determinada como a diluição ideal para este fim.
   2. Para limpeza preliminar, encha a cubeta de poliestireno aproximadamente 3/4 cheia com a solução de medição preparada, gire suavemente e, em seguida, esvazie o mais completamente possível.
      NOTA: Não toque na parte inferior da cubeta (zona de medição) e evite bolhas de ar não agitando a cubeta.
   3. Para a medição, pipetar 1 mL da solução de medição para a cubeta e colocar uma tampa.
   4. Verifique se há bolhas de ar na solução de medição na cubeta. Se houver bolhas de ar, remova-as batendo levemente na cubeta.
7. Realizando a medição
   1. Coloque a cubeta de plástico com a solução de medição no dispositivo com a marca de seta virada para a frente e feche a tampa.
   2. Carregue o parâmetro SOP (consulte a etapa 1.4.1) e insira os seguintes dados na janela inicial:
      Nome da amostra: Número do lote
   3. Inicie a medição.
   4. Após o término da medição, quando o sinal acústico soar, feche a janela de medição .
   5. Calcular o valor médio das seis medidas individuais de acordo com a Figura Suplementar S5. Marque as medidas individuais na Exibição de Registros do Arquivo de Medição, clique com o botão direito do mouse em Criar Resultado Médio, adicione o nome do valor médio em Nome da Amostra e confirme clicando em OK.
   6. Aguarde até que o software crie um novo registro no final da lista e procure o nome inserido e o resultado médio nesse registro.
   7. Imprima o relatório (consulte a etapa 1.1.3).

Resultados

O método descrito foi validado de acordo com a ICH Q2(R1)²⁰, que envolveu a medição de soluções de teste sob condições variadas. A precisão foi de apenas 0,5% RSD para o tamanho Z-médio, enquanto um máximo de 3,5% RSD foi calculado para o PDI. Os resultados médios dos diferentes analistas e dias diferiram apenas 0,4% para o tamanho médio Z e 1,5% para o PDI. As estatísticas foram calculadas a partir de 12 medições realizadas por dois analistas em dias variados. Nem as alterações n...

Discussão

A DLS tornou-se um ensaio fundamental para a determinação do tamanho e distribuição de tamanho de nanopartículas para aplicações no desenvolvimento de fármacos e avaliação regulatória. Apesar dos avanços nas técnicas de DLS, ainda existem desafios metodológicos em relação à seleção de diluentes e preparação de amostras, que são especialmente relevantes para complexos ferro-carboidrato em soluções coloidais. É importante ressaltar que os métodos DLS para nanomedicamentos ferro-carboidrato ainda n...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Zetasizer Nano ZS	Malvern	NA	equipped with Zetasizer software 7.12, Helium Neon laser (633 nm, max. 4 mW) and 173° backscattering geometry
Materials
Disposable plastic cuvettes
LLG-Disposable plastic cells	LLG labware	LLG-Küvetten, Makro, PS; Order number 9.406011
low-particle water			(The use of freshly deionized and filtered (pore size 0.2 μm) water is recommended).
Microlitre pipette
Venofer 100 mg/5 mL	Vifor Pharma
Volumetric flask 25 mL
Nanosphere	Thermo	3020A	Particle Standard
Software
Origin Pro v.8.5	Origin Lab Corporation