تصوير فائق الدقة خال من الملصقات يتم تمكينه عن طريق التصوير الاهتزازي للأنسجة المنتفخة والتحليل

Summary

من خلال الجمع بين كيمياء الهيدروجيل لتوسيع العينة والفحص المجهري المشبع الكيميائي الخالي من الملصقات ، يصف البروتوكول كيفية تحقيق تصوير حجمي فائق الدقة خال من الملصقات في العينات البيولوجية. باستخدام خوارزمية إضافية لتجزئة صور التعلم الآلي ، تم الحصول على صور متعددة المكونات الخاصة بالبروتين في الأنسجة بدون وضع علامات على الأجسام المضادة.

Abstract

إن الاستخدام الشامل للفحص المجهري الفلوري ، وخاصة الفحص المجهري فائق الدقة ، قد أدى إلى تطوير المعرفة حول علم الأحياء الحديث بشكل كبير. على العكس من ذلك ، فإن متطلبات وضع العلامات على الفلوروفور في تقنيات الفلورسنت تشكل تحديات كبيرة ، مثل التبييض الضوئي ووضع العلامات غير المنتظمة لمجسات الفلورسنت ومعالجة العينات لفترات طويلة. في هذا البروتوكول ، يتم تقديم إجراءات العمل التفصيلية للتصوير الاهتزازي للأنسجة المنتفخة وتحليلها (VISTA). يتحايل VISTA على العقبات المرتبطة بالفلوروفورات ويحقق تصويرا حجميا فائق الدقة خال من الملصقات في العينات البيولوجية بدقة مكانية تصل إلى 78 نانومتر. يتم إنشاء الإجراء عن طريق تضمين الخلايا والأنسجة في الهيدروجيل ، وتوسيع عينة الهيدروجيل الهجينة بشكل متناحي الخواص ، وتصور توزيعات البروتين الذاتية عن طريق التصوير الاهتزازي باستخدام الفحص المجهري المتناثر رامان المحفز. يتم توضيح هذه الطريقة على كل من الخلايا وأنسجة دماغ الفئران. لوحظت صور VISTA والتألق المناعي عالية الارتباط ، مما يثبت صحة أصل البروتين لخصائص التصوير. لاستغلال هذا الارتباط ، تم تدريب خوارزمية تجزئة الصور القائمة على التعلم الآلي لتحقيق تنبؤ متعدد المكونات للنوى والأوعية الدموية والخلايا العصبية والتشعبات من صور دماغ الفأر الخالية من الملصقات. تم تكييف الإجراء بشكل أكبر للتحقيق في مجاميع بولي الجلوتامين المرضية (polyQ) في الخلايا ولويحات الأميلويد بيتا (Aβ) في أنسجة المخ ذات الإنتاجية العالية ، مما يبرر إمكاناتها للعينات السريرية واسعة النطاق.

Introduction

أحدث تطور طرق التصوير البصري ثورة في فهم علم الأحياء الحديث لأنها توفر معلومات مكانية وزمانية غير مسبوقة للأهداف عبر مقاييس مختلفة ، من البروتينات تحت الخلوية إلى الأعضاء الكاملة¹. من بينها ، يعد الفحص المجهري الفلوري هو الأكثر رسوخا ، مع مجموعة كبيرة من الأصباغ العضوية ذات معاملات الانقراض العالية والعوائد الكمومية² ، وبروتينات الفلورسنت المشفرة وراثيا سهلة الاستخدام³ ، وطرق فائقة الدقة مثل STED و PALM و STORM لتصوير الهياكل ذات الحجم النانومي^4،5. بالإضافة إلى ذلك ، فإن التطورات الحديثة في هندسة العينات وكيمياء الحفظ ، والتي توسع العينات المضمنة في هيدروجيل البوليمر^{القابل للانتفاخ 6،7،8} ، تمكن من دقة محدودة الحيود الفرعي على المجاهر الفلورية التقليدية. على سبيل المثال ، يعمل الفحص المجهري التمدد النموذجي (ExM) على تحسين دقة الصورة بشكل فعال بمقدار أربع مرات مع توسيع العينة التماثلي أربعة^{أضعاف 7}.

على الرغم من مزاياه ، يشترك المجهر الفلوري فائق الدقة في القيود التي تنشأ من وضع العلامات على الفلوروفور. أولا ، يؤدي التبييض الضوئي وتعطيل الفلوروفورات إلى الإضرار بالقدرة على تقييمات التألق المتكررة والكمية. يعد التبييض الضوئي حدثا لا مفر منه عندما يستمر الضوء في ضخ الإلكترونات في حالات إثارة^{إلكترونية 9}. ثانيا ، إن وضع العلامات على الفلوروفورات بالأهداف المرغوبة ليس دائما مهمة مباشرة. على سبيل المثال ، يتطلب التلوين المناعي عملية تحضير عينة طويلة وشاقة ويعيق إنتاجية التصوير¹⁰. يمكن أن يقدم أيضا القطع الأثرية بسبب وضع العلامات غير المتجانسة على الأجسام المضادة ، خاصة في أعماق الأنسجة¹¹. علاوة على ذلك ، قد تكون استراتيجيات وضع العلامات المناسبة التي تستهدف الفلوروفورات للبروتينات المرغوبة متخلفة. على سبيل المثال ، كانت هناك حاجة إلى فحوصات مكثفة للعثور على أجسام مضادة فعالة لويحات Aβ¹². غالبا ما يكون للأصباغ العضوية الأصغر ، مثل الكونغو الأحمر ، خصوصية محدودة ، مما يؤدي فقط إلى تلطيخ لب لوحة Aβ. لذلك ، من المستحسن للغاية تطوير طريقة فائقة الدقة خالية من الملصقات تتحايل على عيوب وضع العلامات بالفلوروفور وتوفر صورا تكميليا عالي الدقة من الخلايا إلى الأنسجة ، وحتى العينات البشرية واسعة النطاق.

يوفر الفحص المجهري رامان تباينا خاليا من الملصقات للهياكل الخاصة بالمواد الكيميائية ويحدد توزيع الروابط الكيميائية غير المرئية من خلال النظر إلى التحولات الاهتزازية^{المتحمسة 13}. على وجه الخصوص ، ثبت أن تصوير تشتت رامان المحفز (SRS) على عينات خالية من الملصقات أو ذات العلامات الصغيرة لها سرعة ودقة مماثلة للفحص المجهري الفلوري^14،15. على سبيل المثال ، تم تمييز منطقة الدماغ السليمة بسهولة عن المنطقة التي تتسلل إلى الورم في أنسجة الإنسان والفأر^16،17. تم أيضا تصوير لويحات Aβ بوضوح من خلال استهداف اهتزاز البروتين CH₃ (2940 سم ⁻¹) والأميد الأول (1660 سم ⁻¹) على شريحة دماغ مجمدة حديثا دون أي وضع علامات¹⁸. لذلك ، يوفر تشتت رامان تباينا قويا خاليا من الملصقات يتغلب على قيود الفلوروفور. أصبح السؤال بعد ذلك كيف يمكن للمرء تحقيق قدرة فائقة الدقة باستخدام تشتت رامان ، والذي يمكن أن يكشف عن التفاصيل الهيكلية النانوية والآثار الوظيفية في العينات البيولوجية.

على الرغم من بذل جهود مكثفة لتحقيق دقة فائقة لفحص رامان المجهري باستخدام أجهزة بصرية أنيقة ، إلا أن تحسين الدقة على العينات البيولوجية كان محدودا إلى حد ما^19،20،21. هنا ، بناء على الأعمال الحديثة^22،23 ، نقدم بروتوكولا يجمع بين استراتيجية توسيع العينة وتشتت رامان المحفز للتصوير الاهتزازي الخالي من الملصقات فائق الدقة ، المسمى التصوير الاهتزازي للأنسجة المنتفخة والتحليل (VISTA). أولا ، تم تضمين الخلايا والأنسجة في مصفوفات الهيدروجيل من خلال بروتوكول تهجين بروتين هيدروجيل محسن. ثم تم تحضين أنسجة الهيدروجيل الهجينة في محاليل غنية بالمنظفات لإزالة الدهون ، تليها التوسع في الماء. ثم تم تصوير العينات الموسعة بواسطة مجهر SRS عادي من خلال استهداف اهتزازات CH₃ من البروتينات الداخلية المحتجزة. يتجاوز VISTA ، نظرا لميزة التصوير الخالية من الملصقات ، التبييض الضوئي ووضع العلامات غير المتجانسة الناشئة عن وضع العلامات على الفلوروفور ، مع إنتاجية معالجة عينات أعلى بكثير. هذا أيضا أول تصوير أقل من 100 نانومتر (حتى 78 نانومتر) تم الإبلاغ عنه. لا يلزم وجود أجهزة بصرية إضافية إلى جانب إعداد SRS^{النموذجي 22،24} ، مما يجعلها قابلة للتطبيق بسهولة. باستخدام صور VISTA المترابطة والتألق المناعي ، تم تدريب خوارزمية تجزئة صور التعلم الآلي^25،26 لإنشاء صور متعددة الإرسال الخاصة بالبروتين من الصور أحادية القناة. تم تطبيق الطريقة أيضا للتحقيق في لويحات Aβ في أنسجة دماغ الفئران ، مما يوفر صورة شاملة مناسبة للتنميط الظاهري الفرعي بناء على المناظر الدقيقة لنواة البلاك والخيوط الطرفية المحاطة بنوي الخلايا والأوعية الدموية.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية التي تم إجراؤها في هذه الدراسة من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسي في معهد كاليفورنيا للتكنولوجيا (IACUC) ، وامتثلت إجراءات البروتوكول لجميع اللوائح الأخلاقية ذات الصلة.

1. تحضير حلول المخزون للتثبيت وتوسيع العينة

1. قم بإعداد 40 مل من محلول التثبيت عن طريق إذابة 12 جم من مادة الأكريلاميد (30٪ وزن / حجم) صلب في 26 مل من الماء الخالي من النوكلياز. ثم أضف 10 مل من محلول مخزون PFA بنسبة 16٪ إلى الخليط. أخيرا ، أضف 4 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 10x (PBS ، درجة الحموضة 7.4). يمكن تخزين المحلول المحضر عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
   ملاحظة: مادة الأكريلاميد خطرة ، لذا يجب أن تتم خطوة إذابة مادة الأكريلاميد الصلبة في الماء في غطاء الدخان.
2. تحضير محلول التبلور (المخزون X) عن طريق إذابة 70 مجم من أكريلات الصوديوم (7٪ وزن / حجم) ، و 200 مجم من أكريل أميد (20٪ وزن / حجم) ، و 50 ميكرولتر من N ، N′-methylenebisacrylamide (0.1٪ وزن / حجم) في 420 ميكرولتر من الماء عالي النقاء. أضف 57 ميكرولتر من 10x PBS المعقم (الرقم الهيدروجيني 7.4) في النهاية وقم بتخزين هذا المحلول عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
   ملاحظة: تجنب صلبة أكريلات الصوديوم التي تشكل كتل. تأكد من أن أكريلات الصوديوم المستخدمة على شكل مساحيق مشتتة. سيكون المخزون X المصنوع سائلا عديم اللون. إذا كان السائل يبدو أصفر فاتح ، احصل على أكريلات الصوديوم الجديد.
3. تحضير محلول بادئ البلمرة عن طريق إذابة 1 جم من بيرسلفات الأمونيوم (APS ، 10٪ وزن / وزن) في 9 مل من الماء الخالي من النوكلياز. وبالمثل ، قم بإعداد محلول تسريع البلمرة عن طريق إذابة 1 جم من رباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TEMED ، 10٪ وزن / وزن) في 9 مل من الماء الخالي من النوكلياز. اقتبس المحاليل الناتجة وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
4. قم بإعداد 50 مل من المخزن المؤقت لتغيير الطبيعة عن طريق إذابة 2.88 جم من كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS ، 200 مل) ، و 0.584 جم من كلوريد الصوديوم (200 مل) ، و 2.5 مل من 1M Tris-HCl المؤقت (50 ملي مولار ، درجة الحموضة 8) في الماء الخالي من النوكلياز.
   ملاحظة: تركيز SDS قريب من حالة التشبع. بعض التبلور في المخزن المؤقت أمر طبيعي. يمكن أن يؤدي تسخينه الطفيف حتى 37 درجة مئوية إلى جعل المحلول واضحا وجاهزا للاستخدام.

2. تحضير عينات خلايا الثدييات

1. قم بزراعة 3.5 × 10⁴ خلايا HeLa على غطاء بورسليكات 12 مم (# 1.5) في صفيحة 24 بئرا ثم قم بزراعة الخلايا في 400 ميكرولتر من Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ مضادات حيوية البنسلين والستربتومايسين (DMEM كامل) تحت جو مرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية.
2. للحصول على خلايا في مراحل انقسامية مختلفة ، احتضان الخلايا في DMEM كامل حتى التقاء 60٪. بعد ذلك ، عالج الخلايا باستخدام DMEM بدون مصل بقري الجنين لمدة 20 ساعة لمزامنة مراحل الخلية. بعد التزامن ، قم بتبديل الوسيط للخلايا لإكمال DMEM واحتضانه لمدة 2-6 ساعات أخرى لاستهداف المراحل المختلفة من الانقسام.
3. اغسل خلايا HeLa على الغطاء باستخدام PBS معقم واحتضانها بمحلول تثبيت (4٪ PFA ، 30٪ أكريلاميد [AA] في PBS) عند 37 درجة مئوية لمدة 7-8 ساعات قبل المعالجة الإضافية.
   ملاحظة: تساعد درجة حرارة التثبيت المرتفعة مع التركيز العالي من مادة الأكريلاميد على إخماد التشابك بين الجزيئات بين البروتينات أثناء عمليات التثبيت ويقال إنها تحافظ على الهياكل الفائقة التفصيلية^{للبروتينات 8}.
4. بالنسبة للخلايا التي تحتوي على مجاميع polyQ ، قم بزراعة الخلايا في DMEM كامل حتى تصل إلى 70٪ -90٪ من التقاء. بعد التغيير إلى DMEM كامل جديد ، قم بنقل 1 ميكروغرام من البلازميد الذي يشفر mHtt97Q-GFP في الخلايا باستخدام عامل التعداء (التفاصيل في جدول المواد). قم بإجراء التعداء وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
5. بعد 24-48 ساعة من التعدي ، قم بإزالة وسط المزرعة وأضف 800 ميكرولتر من محلول التثبيت (4٪ PFA ، 30٪ AA) إلى الغطاء مع الخلايا. احتضان الغطاء عند 37 درجة مئوية لمدة 6-8 ساعات. اغسل الغطاء باستخدام PBS 3x ، وتكون عينات الخلايا الناتجة جاهزة لمزيد من المعالجة.

3. تحضير عينات دماغ الفئران

1. قم بشراء الفئران C57BL / 6J (من 6 إلى 8 أسابيع ، ذكور وإناث ، ستة فئران) وفئران الزهايمر (بعمر 9 أشهر ، أنثى ، ثلاثة فئران) من مصادر تجارية (التفاصيل في جدول المواد). إجراء القتل الرحيم عن طريق تخدير ثاني أكسيد الكربون وفقا للبروتوكول^{القياسي 27}. باختصار ، ضع الفئران في غرفة واملأ الغرفة بتدفق 100٪ من ثاني أكسيد الكربون₂ في حدود 30٪ -70٪ من حجم الغرفة / دقيقة وحافظ على التدفق لمدة دقيقة واحدة على الأقل بعد الموت السريري.
2. بعد التأكد من القتل الرحيم الإنساني ، قم بقطع رأس الفئران بسرعة باستخدام مقص. كشف الجمجمة بشق كبير عبر الجلد أسفل خط الوسط. اسحب الجلد باتجاه أنف لكشف الجمجمة بالكامل.
3. اقطع الجمجمة على طول خط الوسط بمقص ناعم وقشر نصفي الجمجمة بعيدا إلى الجانب. استخدم الملقط لإخراج الدماغ في طبق بتري على الثلج باستخدام PBS. اغسل دماغ الفأر الطازج باستخدام PBS المثلج وانقل الدماغ إلى 10 مل من المخزن المؤقت للتثبيت (4٪ PFA ، 30٪ AA).
4. احتضان دماغ الفأر في مخزن مؤقت للتثبيت عند 4 درجات مئوية لمدة 24-48 ساعة ثم انقله إلى 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد غسله باستخدام PBS معقم ، قم بتقطيع دماغ الفأر إلى أقسام 150 ميكرومتر باستخدام اهتزاز وتخزينه في PBS عند 4 درجات مئوية.

4. تضمين الهيدروجيل ، وتمسخ ، وتوسيع عينات الخلايا والأنسجة

1. تأكد من احتضان العينات في مخزن التثبيت المؤقت للفترة الزمنية المطلوبة ، كما هو موضح أعلاه. قم بإذابة حلول مخزون X ، وبادئ الجذور الحرة ، ومسرع المخزون واحتفظ بها على الجليد أثناء العملية برمتها.
   ملاحظة: يمكن أن يتسبب وقت الحضانة غير الكافي في انخفاض عدد البروتينات المحتجزة على هجين الهيدروجيل ، وبالتالي يتسبب في انخفاض الإشارة.
2. التقط الغطاء بالخلايا وضعه على شريحة زجاجية باستخدام ملاقط. اختر شرائح الدماغ (بسمك 150 ميكرومتر) وضعها على شريحة زجاجية أخرى باستخدام فرشاة رسم من الصوف الناعم ، مع التأكد من أنها مسطحة. تخلص من السوائل الزائدة التي تأتي مع العينات.
3. قم بتكديس اثنين من الغطاء (# 1.5) ، عن طريق إضافة قطرات من الماء بينهما ، على جانبي العينة على الشريحة الزجاجية لعمل غرفة التبلور. ضع الشريحة الزجاجية بحيث تكون العينة متجهة لأعلى على كتلة حرارية مثلجة وقم بتبريدها إلى 4 درجات مئوية لمدة دقيقة واحدة.
4. أضف 10٪ (وزن / وزن) TEMED إلى المخزون X ثم 10٪ محلول APS. دوامة بسرعة ، وفي غضون دقيقة واحدة بعد الخلط ، قم بإسقاط المحلول الناتج ببطء في الغرفة على العينات لتغطية سطح العينة ، وتجنب فقاعات الهواء. احتفظ بالمحلول والعينات على الثلج (أو كتلة حرارية مثلجة) لتجنب تكوين الهلام (درجة عالية من البلمرة) قبل إضافتها إلى العينة.
5. بمجرد غمر العينة بالكامل في المحلول ، ضع غطاء مسطح وشفاف ومغطى بالفيلم أعلى العينة كغطاء للغرفة. اترك الغرفة على الثلج أو كتلة حرارية مثلجة لمدة 1 دقيقة أخرى قبل احتضانها في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
6. أخرج حجرة التبلور على الشريحة الزجاجية من الحاضنة 37 درجة مئوية. يجب ملاحظة هلام غير شفاف بعد إزالة الغطاء. استرجع الجل عن طريق القطع بشفرة حلاقة أو ، بدلا من ذلك ، ضع الشريحة الزجاجية في عازلة تغيير الطبيعة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. سوف يفصل الجل نفسه عن الشريحة الزجاجية.
7. احتضان الجل المعزول في المخزن المؤقت لتغيير الطبيعة تحت ظروف الحرارة لتحقيق المزيد من التمسخ وإزالة الشحوم. بالنسبة لعينات الخلايا ، قم بتغيير طبيعة طبيعتها عند 95 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. بالنسبة لشرائح الدماغ التي يبلغ سمكها 150 ميكرومتر ، تشوه عند 70 درجة مئوية لمدة 3 ساعات ، متبوعة ب 95 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
   ملاحظة: يمكن أن يصبح الجل مجعدا عند تحضينه لأول مرة مع مخزن مؤقت لتغيير الطبيعة في درجة حرارة الغرفة. إنه أمر طبيعي وسيصبح مسطحا بعد تمسخ درجة الحرارة العالية. عند العمل مع عينات من الأنسجة السميكة ، هناك حاجة إلى وقت تمسخ أطول.
8. بعد المعالجة الحرارية ، اغسل العينة المشوهة 3x باستخدام PBS لمدة 10 دقائق. في هذه المرحلة ، يجب أن يتوسع الجل إلى حوالي 1.5 ضعف الحجم الأصلي. احتضن الجل المغسول بالماء فائق النقاء في وعاء كبير (20 ضعف حجم الجل على الأقل) لتحقيق نسبة تمدد أعلى. قم بتغيير الماء كل 1 ساعة و 3x واترك العينة في الظلام طوال الليل. الجل الناتج جاهز للتصوير.
   ملاحظة: تعتمد نسبة التمدد إلى حد كبير على الخواص الميكانيكية للعينة الأصلية. تم الحصول على توسع 4.2 مرة لعينات الخلايا و 3.4 مرة تمدد لعينة أنسجة المخ.

5. تصوير خال من الملصقات لتوزيع البروتين الداخلي في عينات الخلايا والأنسجة الموسعة

1. احتفظ بعينات الجل الموسعة في الماء أثناء عملية التصوير. الجل هش بعد التمدد لذا يجب التعامل معه بحذر. ضع الجل الموسع الحامل للعينة على شريحة مجهرية (بسمك 1 مم) باستخدام فاصل مجهر بأحجام وأعماق فتح مناسبة مملوءة بالماء. قم بتغطية الفاصل بغطاء (# 1.5) وتأكد من إغلاقه بشكل صحيح لتجنب حركة العينة.
2. ضع العينة مع الخلية أو الأنسجة الموسعة على المرحلة الآلية بحيث يكون الغطاء مواجها للهدف. انقر فوق Ocular على البرنامج لتغيير مسار الضوء إلى مجال ساطع وضبط موضع z باستخدام مقبض يدوي.
3. أضف زيت الغاطس في الجزء العلوي من العينة واضبط المكثف على الموضع الصحيح لإضاءة Köhler أثناء المشاهدة تحت المجال الساطع بتكبير 25x من الهدف. أدخل 791.3 نانومتر في نافذة الطول الموجي OPO على لوحة الليزر لاستهداف اهتزاز البروتين CH₃ عند 2940 سم ⁻¹.
4. قم بتبديل ضوء المجهر من المجال الساطع (قطعة العين) إلى وضع المسح بالليزر بالنقر فوق الزر LSM وافتح غالق الليزر SRS عن طريق الضغط على زر الغالق على لوحة التحكم بالليزر. اضغط على الزر LIVE في برنامج المجهر لبدء الحصول على الصور في الوقت الفعلي.
5. ابحث عن التركيز البؤري المناسب عن طريق تغيير z أثناء النظر إلى صورة SRS في ظل وقت سكون قصير للبكسل (12.5 ميكرو ثانية/بكسل) ودقة صورة منخفضة (256 بكسل × 256 بكسل). بمجرد العثور على موضع z المثالي ، قم بتغيير حجم المسح ووقت السكون بالبكسل عن طريق سحب الشريط المعني في برنامج المجهر.
6. احصل على الصورة عن طريق الضغط على زر LSM باستخدام حالة أخذ العينات الفائقة (1024 بكسل × 1024 بكسل) مع وقت مكوث أطول للبكسل (80 ميكرو ثانية/بكسل) يطابق ثابت الوقت لمكبر الصوت القفل. احصل على صور حجمية عن طريق جمع مكدس z بحجم خطوة 1 ميكرومتر في الاتجاه z. معالجة وتحليل ملف OIR المحفوظ من البرنامج باستخدام ImageJ.
   ملاحظة: تم الإبلاغ مؤخرا عن إعداد SRS التفصيلي في Mutlu et ^al.24. هنا ، تم توجيه ليزر بيكو ثانية قابل للضبط بمعدل تكرار 80 ميجاهرتز وعرض نطاق ترددي 2 ps للمضخة (770-990 نانومتر) و stokes (1031.2 نانومتر) إلى مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر (مفصل في جدول المواد). تحسين التداخل الزمني والمكاني للحزمتين للإشارات ذات D₂O النقي. يتطلب الأمر بعض الجهد للعثور على z الصحيح للعينة الموسعة تحت المجال الساطع لأن معامل الانكسار متجانس جدا في جميع أنحاء الجل.
7. حدد دقة VISTA عن طريق التقاط صورة SRS لخرز البوليسترين (100 نانومتر) باستخدام هدف 25x وهدف 60x. اضبط ليزر المضخة على 784.5 نانومتر ، وهو ما يتوافق مع إزاحة رامان 3050 سم ⁻¹ ، وهي سمة من سمات العطرية C-H التي تمتد اهتزازات البوليسترين.
   ملاحظة: الطول الموجي لليزر المضخة المستخدم هنا مشابه للطول الموجي المستخدم في VISTA للبروتينات.
8. مع هدف 60x ، كان الحد الأقصى لنصف الموجة الكاملة التجريبية (FWHM ، وهو عرض شكل الخط عند نصف السعة) لصورة الخرزة 276.17 نانومتر. نمذجة وظيفة كائن الخرزة كنصف دائرة.
   ملاحظة: عندما تحتوي الدالة PSF Gaussian على c (σ) = 269 نانومتر / 2.35 ، فإن صورة الخرزة الملتوية سيكون لها FWHM مقاس يبلغ 276.17 نانومتر. نتيجة لذلك ، تبلغ دقة نظام SRS 269 نانومتر × 1.22 = 328 نانومتر وفقا لمعيار رايلي. نظرا لأن VISTA لديها متوسط 4.2 مرة من التوسع في عينات الخلايا ، فإن الدقة الفعالة تنخفض إلى 328 نانومتر / 4.2 = 78 نانومتر.

6. التصوير الفلوري VISTA والفلورسنت المترابط لعينات الأنسجة الموسعة والموسعة

1. بعد التمسخ ، قم باحتضان عينات الهيدروجيل المضمنة مسبقا (على سبيل المثال ، 150 ميكرومتر من القسم الإكليلي للدماغ) في 1٪ (حجم / حجم) Triton X-100 (PBST) لمدة 15 دقيقة. قم بتبديل المخزن المؤقت للحضانة إلى PBST مع الجسم المضاد الأساسي عند تخفيف 1: 100. إذا كانت هناك حاجة إلى أهداف بروتينية متعددة للتصوير المتعدد ، فقم بتخفيف الأجسام المضادة الأولية المعنية لأهداف مختلفة إلى تركيزات مناسبة في نفس الكوكتيل واحتضانها مع العينات في وقت واحد.
2. احتضان المواد الهلامية بالأجسام المضادة الأولية المخففة عند 37 درجة مئوية مع رج لطيف عند 80 دورة في الدقيقة لمدة 16-18 ساعة ، متبوعا بغسيل مكثف 3x باستخدام PBST لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية. اقلب الجل أثناء الحضانة لمنع وضع العلامات غير المتجانسة على الأجسام المضادة هنا وفي جميع الحضانات اللاحقة.
3. احتضان العينات بالأجسام المضادة الثانوية لأهداف الأنواع المقابلة عند 1: 100 تخفيفات مع PBST عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة ، محمية من الضوء. اغسل عينات الهيدروجيل المسمى 3x باستخدام PBST لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف.
4. تخفيف DAPI إلى تركيز نهائي 3 ميكرومتر في PBS. أضف حجما كافيا من محلول DAPI إلى عينة الهيدروجيل بحيث يتم غمر الجل في المحلول. احتضن لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع رج لطيف عند 80 دورة في الدقيقة. اغسل العينة 3x باستخدام PBS.
5. قم بتوسيع عينات الجل ذات العلامات المناعية عن طريق احتضانها بكمية كبيرة من H₂O منزوع الأيونات المزدوج ، قم بتغيير الماء كل 1 ساعة و 3x واحتضان العينات في H₂O طوال الليل ، محمية من الضوء. أثناء وضع العلامات ، يجب أن يتمدد الجل 1.5 مرة مقارنة بالمخزن المؤقت PBS.
6. قم بإعداد عينة التصوير كما هو موضح في الخطوة 5.1. ضع عينة التصوير على المجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر باستخدام هدف الغمر في الماء 25x ، 1.05 NA للتصوير الفلوري.
7. حدد القناة المناسبة باستخدام ليزر الإثارة المعني (405 نانومتر و 488 نانومتر و 561 نانومتر و 640 نانومتر) وزوج PMT وفقا للأجسام المضادة المستهدفة في القائمة المنسدلة على برنامج المجهر. اضغط على الزر LIVE للحصول على الصور في الوقت الفعلي.
8. اضبط موضع التركيز البؤري بواسطة مقبض يدوي بناء على إشارة التألق في الوقت الفعلي. قم بتحسين طاقة الليزر ووقت سكون البكسل واكتساب PMT في برنامج المجهر وفقا لإشارة التألق في الوقت الفعلي لتجنب الإشارة الخافتة أو التشبع الزائد.
   ملاحظة: قم بتقييم المظهر والميزات بناء على الهياكل المبلغ عنها للأجسام المضادة المختلفة للتخلص من التفاعلات المتبادلة المحتملة للأجسام المضادة وتجنب الحديث المتبادل بين قنوات التألق المختلفة.
9. اضغط على زر LSM لبدء الحصول على صور SRS وفلورسنت مترابطة. أولا ، اجمع صور التألق الحجمي على عينات تحمل علامة مناعية. بمجرد الانتهاء من التصوير الفلوري ، قم بتبديل مسار ضوء المجهر إلى حالة الأشعة تحت الحمراء (IR) الشفافة.
10. قم بتغيير قناة الكشف من PMT الفلوري إلى SRS على برنامج المجهر. افتح الغالق الخاص بليزر SRS وقم بإجراء التصوير الحجمي SRS في مجال رؤية نفس العينة بنفس نطاق z. يتراوح النطاق الطبيعي بين 100-200 ميكرومتر ويمكن أن يصل إلى 700 ميكرومتر.
    ملاحظة: هناك انحراف لوني طفيف يتسبب في حدوث تحول في موضع z بين الصور الفلورية وصور SRS بسبب اختلاف الطول الموجي في ليزر الإثارة. هناك حاجة إلى مقارنة يدوية جنبا إلى جنب بين صور SRS و z-stack الفلورية. ابحث عن ميزات المطابقة الدقيقة من كل من SRS وقناة التألق لمطابقة موضع z بدقة.

7. بناء وتدريب والتحقق من صحة بنية U-Net

ملاحظة: يوصى بالتثبيت على Linux. مطلوب بطاقة رسومات بسعة >10 جيجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي.

1. إعداد البيئة
   1. قم بتثبيت Anaconda أو Miniconda على 3-5.3.0-linux-x86_64. استنساخ الملفات التالية أو تنزيلها: https://github.com/Li-En-Good/VISTA. إنشاء بيئة Conda للنظام الأساسي باستخدام سطر الأوامر التالي:
      conda env create -f environment.yml
2. تدريب نموذج التنبؤ
   1. قم بإقران أدلة صور SRS المقابلة مع صور الحقيقة الأرضية في ملف csv. ضع دلائل صور SRS أسفل صور الحقيقة path_signal والأرضية تحت path_target الأعمدة.
   2. ضع ملف csv في المجلد data/csvs. قم بتعديل التكوين في البرامج النصية / train_model_2d.sh إذا لزم الأمر. تنشيط البيئة باستخدام سطر الأوامر:
      Conda تنشيط FNET
   3. ابدأ تدريب النموذج باستخدام سطر الأوامر:
      ./scripts/train_model_2d.sh <اسم الملف لملف CSV> 0
      سيبدأ التدريب بعد ذلك. سيتم عرض الخسائر لكل تكرار في سطر الأوامر وحفظها مع النموذج في المجلد save_models / اسم الملف <لملف csv>.
3. تحقق من صحة الصور في مجموعة التدريب ومجموعة الاختبار باستخدام سطر الأوامر:
   ./scripts/train_model_2d.sh <اسم الملف لملف CSV> 0
   سيتم حفظ نتائج التنبؤ في نتائج المجلد / اسم الملف < لملف csv>.

8. VISTA جنبا إلى جنب مع تنبؤات U-Net لتعدد الإرسال الخاص بالبروتين في الصور الخالية من الملصقات

1. قم بتعديل ملف csv في اسم ملف data/csvs/< لملف csv>/test.csv. استبدل دلائل كل من path_signal و path_target بدليل صور SRS الجديدة.
2. قم بإزالة نتائج التنبؤ من التدريب ، وهو نتائج المجلد / اسم ملف < لملف csv>. قم بتشغيل التنبؤات باستخدام سطر الأوامر:
   ./scripts/train_model_2d.sh <اسم الملف لملف CSV> 0
   سيتم حفظ نتائج التنبؤ في نتائج المجلد / اسم الملف < لملف csv > / test.

النتائج

بعد تحديد مبدأ العمل لطريقة التصوير والتحليل ، تم تسجيل الصور لتقييم نسبة التمدد وضمان التمدد المتناحي أثناء معالجة العينة (الشكل 1 أ ، ب). تم تصوير كل من العينات غير المعالجة و VISTA أثناء استهداف اهتزاز الرابطة عند 2940 سم ⁻¹ ، والذي ينشأ من CH

Discussion

باختصار ، نقدم بروتوكول VITA ، وهو طريقة خالية من الملصقات لتصوير الهياكل الخلوية وتحت الخلوية الغنية بالبروتين للخلايا والأنسجة. من خلال استهداف CH₃ الذاتي من البروتينات الموجودة في الخلايا والأنسجة المضمنة في الهيدروجيل ، تحقق الطريقة دقة تصوير فعالة تصل إلى 78 نان...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 M Tris pH 8	Sigma-Aldrich	648314
16% Paraformaldehyde	Electron microscopy science	15710	diluted to 4% in PBS
25x water immersion objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	NA 1.05
5XFAD Mice	Mutant Mouse Resource and Research Centers and the Jackson Laboratory	B6SJL-Tg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286 V) 6799Vas/Mmjax	Alzheimer brain
60x water immersion objective	Olympus	UPLSAPO60XWIR	NA 1.2
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
anti-MAP2	Cell Signaling Technology	8707
anti-NeuN	Cell Signaling Technology	24307
borosilicate coverslip #1.5	Fisher Scientific	1254581
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratory (JAX)	664	Normal mice
D2O	Sigma-Aldrich	151882	for SRS calibration
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM	GIBCO	10566-016
FBS	GIBCO	A4766
glass slide 3" x 1" x 1 mm	VWR	16004-430
goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21449
goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21236
goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
goat anti-rat IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11077
Grace Bio-Labs Press-To-Seal silicone isolators	Sigma-Aldrich	GBL664108	microscope spacer
Htt-97Q-GFP Plasmid	Gift from Prof. R. Kopito and Prof. F.-U.Hartl.
Laser scanning microscope	Olympus	FV3000	laser scanning confocal microscope
lipofectamine 3000	Thermo Fisher	L3000001	transfection agent
Lycopersicon Esculentum Lectin DyLight®594 (lectin)	Vector Laboratories	DL-1177-1
Microscope spacer	Grace Bio-Labs	621502
N,N′-methylenebisacrylamide (BIS)	Sigma-Aldrich	M1533	bought as 2% solution in water
Nuclease free water	Thermo Fisher	10977-015
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15140-122
poly-strene beads	Sigma-Aldrich	43302	for resolution characterization
Sodium Acrylate	Sigma-Aldrich	408220
sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	71725
soft-wool paint brush #3	TANIS	000333
SRS Laser	A.P.E	picoEmerald	2ps pulse width
tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
Tissue culture flask 25 cm2	Corning	430639
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
tweezer	Fine Science Tool	11295-51
Vibrotome	Leica	VT1200S	the vibratome