Imagens de super-resolução sem rótulos habilitadas por imagens vibracionais de tecido inchado e análise

Resumo

Ao combinar a química do hidrogel de expansão da amostra com a microscopia de espalhamento Raman estimulada específica para produtos químicos sem marcadores, o protocolo descreve como obter imagens volumétricas de super-resolução sem rótulos em amostras biológicas. Com um algoritmo adicional de segmentação de imagem de aprendizado de máquina, foram obtidas imagens multicomponentes específicas de proteínas em tecidos sem marcação de anticorpos.

Resumo

A utilização universal da microscopia de fluorescência, especialmente a microscopia de super-resolução, avançou muito o conhecimento sobre a biologia moderna. Por outro lado, a exigência de marcação de fluoróforos em técnicas fluorescentes apresenta desafios significativos, como fotobranqueamento e marcação não uniforme de sondas fluorescentes e processamento prolongado de amostras. Neste protocolo, são apresentados os procedimentos de trabalho detalhados de imagem vibracional de tecido inchado e análise (VISTA). O VISTA contorna os obstáculos associados aos fluoróforos e obtém imagens volumétricas de super-resolução sem marcação em amostras biológicas com resolução espacial de até 78 nm. O procedimento é estabelecido pela incorporação de células e tecidos em hidrogel, expandindo isotropicamente o híbrido de amostra de hidrogel e visualizando as distribuições de proteínas endógenas por imagem vibracional com microscopia de espalhamento Raman estimulada. O método é demonstrado em células e tecidos cerebrais de camundongos. Imagens VISTA e imunofluorescência altamente correlativas foram observadas, validando a origem proteica das especificidades de imagem. Explorando essa correlação, um algoritmo de segmentação de imagem baseado em aprendizado de máquina foi treinado para obter a previsão de vários componentes de núcleos, vasos sanguíneos, células neuronais e dendritos a partir de imagens cerebrais de camundongos sem rótulos. O procedimento foi posteriormente adaptado para investigar agregados patológicos de poliglutamina (poliQ) em células e placas beta-amilóide (Aβ) em tecidos cerebrais com alto rendimento, justificando seu potencial para amostras clínicas em larga escala.

Introdução

O desenvolvimento de métodos de imagem óptica revolucionou a compreensão da biologia moderna porque fornecem informações espaciais e temporais sem precedentes de alvos em diferentes escalas, de proteínas subcelulares a órgãos inteiros¹. Entre eles, a microscopia de fluorescência é a mais bem estabelecida, com uma grande paleta de corantes orgânicos com altos coeficientes de extinção e rendimentos quânticos², proteínas fluorescentes codificadas geneticamente fáceis de usar³ e métodos de super-resolução como STED, PALM e STORM para imagens de estruturas em escala nanométrica ^4,5. Além disso, avanços recentes na engenharia de amostras e química de preservação, que expandem amostras incorporadas em hidrogéis de polímero expansíveis ^6,7,8, permitem resolução limitada por subdifração em microscópios de fluorescência convencionais. Por exemplo, a microscopia de expansão típica (ExM) aumenta efetivamente a resolução da imagem em quatro vezes com expansão de amostra isotrópica de quatro vezes⁷.

Apesar de suas vantagens, a microscopia de fluorescência de super-resolução compartilha limitações que se originam da marcação de fluoróforos. Primeiro, o fotobranqueamento e a inativação de fluoróforos comprometem a capacidade de avaliações repetitivas e quantitativas de fluorescência. O fotobranqueamento é um evento inevitável quando a luz continua bombeando elétrons para estados eletronicamente excitados⁹. Em segundo lugar, rotular os fluoróforos para os alvos desejados nem sempre é uma tarefa simples. Por exemplo, a imunocoloração exige um processo de preparação de amostra longo e trabalhoso e dificulta o rendimento da imagem¹⁰. Também pode introduzir artefatos devido à marcação não homogênea de anticorpos, especialmente no interior dos tecidos¹¹. Além disso, estratégias de rotulagem adequadas que visam fluoróforos para as proteínas desejadas podem ser subdesenvolvidas. Por exemplo, foram necessárias triagens extensivas para encontrar anticorpos eficazes para as placas Aβ¹². Corantes orgânicos menores, como o vermelho Congo, geralmente têm especificidade limitada, corando apenas o núcleo da placa Aβ. É, portanto, altamente desejável desenvolver uma modalidade de super-resolução sem marcação que contorne as desvantagens da marcação com fluoróforos e forneça imagens complementares de alta resolução de células a tecidos e até mesmo a amostras humanas em grande escala.

A microscopia Raman fornece contraste sem rótulo para estruturas específicas de produtos químicos e mapeia a distribuição de ligações químicas invisíveis observando as transições vibracionais excitadas¹³. Em particular, a imagem de espalhamento Raman estimulado (SRS) em amostras sem marcação ou marcadas com minúsculos demonstrou ter velocidade e resolução semelhantes à microscopia de fluorescência ^14,15. Por exemplo, a região saudável do cérebro foi prontamente diferenciada da região infiltrada por tumor em tecidos humanos e de camundongos^16,17. As placas Aβ também foram claramente visualizadas visando a vibração da proteína CH₃ (2940 cm⁻¹) e amida I (1660 cm⁻¹) em uma fatia de cérebro recém-congelada sem qualquer rotulagem¹⁸. O espalhamento Raman, portanto, oferece contraste robusto sem rótulos que supera as limitações dos fluoróforos. A questão então passou a ser como se pode alcançar a capacidade de super-resolução usando o espalhamento Raman, que poderia revelar detalhes estruturais em nanoescala e implicações funcionais em amostras biológicas.

Embora extensos esforços tenham sido feitos para alcançar super-resolução para microscopia Raman com instrumentações ópticas elegantes, o aumento da resolução em amostras biológicas tem sido bastante limitado 19,20,21. Aqui, com base nos trabalhos recentes ^22,23, apresentamos um protocolo que combina uma estratégia de expansão de amostra com espalhamento Raman estimulado para imagens vibracionais sem marcação de super-resolução, denominado Vibrational Imaging of Swelled Tissues and Analysis (VISTA). Primeiro, células e tecidos foram incorporados em matrizes de hidrogel por meio de um protocolo otimizado de hibridização proteína-hidrogel. Os híbridos de tecido de hidrogel foram então incubados em soluções ricas em detergente para delipidação, seguida de expansão em água. As amostras expandidas foram então visualizadas por um microscópio SRS comum, visando as vibrações CH₃ de proteínas endógenas retidas. O VISTA, devido ao seu recurso de imagem sem marcação, ignora o fotobranqueamento e a rotulagem não homogênea decorrente da marcação com fluoróforo, com um rendimento de processamento de amostra muito maior. Esta também é a primeira imagem sem rótulo abaixo de 100 nm (até 78 nm) relatada. Nenhuma instrumentação óptica adicional além da configuração típica do SRS^22,24 é necessária, tornando-a prontamente aplicável. Com imagens correlativas de VISTA e imunofluorescência, um algoritmo de segmentação de imagem de aprendizado de máquina estabelecido foi treinado^25,26 para gerar imagens multiplex específicas de proteínas a partir de imagens de canal único. O método foi aplicado para investigar placas Aβ em tecidos cerebrais de camundongos, fornecendo uma imagem holística adequada para subfenotipagem com base nas vistas finas do núcleo da placa e filamentos periféricos cercados por núcleos celulares e vasos sanguíneos.

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Protocolo

Todos os procedimentos em animais realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Tecnologia da Califórnia (IACUC), e os procedimentos do protocolo cumpriram todos os regulamentos éticos relevantes.

1. Preparação de soluções de estoque para fixação e expansão da amostra

1. Prepare 40 mL de solução de fixação dissolvendo primeiro 12 g de acrilamida (30% p / v) sólida em 26 mL de água livre de nuclease. Em seguida, adicione 10 mL de solução estoque de PFA a 16% à mistura. Finalmente, adicione 4 mL de solução salina tamponada com fosfato 10x (PBS, pH 7,4). A solução preparada pode ser conservada a 4 °C durante um período máximo de 2 semanas.
   NOTA: A acrilamida é perigosa, portanto, a etapa de dissolução da acrilamida sólida em água deve ser feita em uma capela de exaustão.
2. Prepare a solução de gelificação (estoque X) dissolvendo 70 mg de acrilato de sódio (7% p / v), 200 mg de acrilamida (20% p / v) e 50 μL de N, N'-metilenobisacrilamida (0,1% p / v) em 420 μL de água ultrapura. Adicione 57 μL de PBS 10x filtrado estéril (pH 7,4) no final e armazene esta solução a -20 ° C por até 1 semana.
   NOTA: Evite o sólido de acrilato de sódio que forma aglomerados; Certifique-se de que o acrilato de sódio usado esteja na forma de pós dispersivos. O estoque X feito será um líquido incolor; Se o líquido parecer amarelo claro, obtenha um novo acrilato de sódio.
3. Preparar a solução iniciadora de polimerização dissolvendo 1 g de persulfato de amónio (APS, 10% p/p) em 9 ml de água isenta de nuclease. Da mesma forma, prepare a solução do acelerador de polimerização dissolvendo 1 g de tetrametiletilenodiamina (TEMED, 10% p / p) em 9 mL de água livre de nuclease. Alicote as soluções resultantes e armazene a -20 °C.
4. Prepare 50 mL de tampão desnaturante dissolvendo 2,88 g de dodecil sulfato de sódio (SDS, 200 mM), 0,584 g de cloreto de sódio (200 mM) e 2,5 mL de tampão Tris-HCl 1M (50 mM, pH 8) em água livre de nuclease.
   NOTA: A concentração de SDS está próxima de sua condição de saturação. Alguma cristalização no tampão é normal. Um leve aquecimento até 37 °C pode tornar a solução clara e pronta para uso.

2. Preparação de amostras de células de mamíferos

1. Semear 3,5 x 10⁴ células HeLa em uma lamínula de borossilicato de 12 mm (# 1,5) em uma placa de 24 poços e, em seguida, cultivar as células em 400 μL de Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibióticos penicilina-estreptomicina (DMEM completo) sob uma atmosfera umidificada com 5% de CO₂ a 37 ° C.
2. Para obter células em diferentes estágios mitóticos, incubar as células em DMEM completo até 60% de confluência. Em seguida, trate as células com DMEM sem soro fetal bovino por 20 h para sincronizar os estágios celulares. Após a sincronização, troque o meio para que as células completem o DMEM e incubem por mais 2-6 h para atingir os vários estágios da mitose.
3. Lave as células HeLa em lamínulas com PBS estéril e incube-as com solução de fixação (4% PFA 30% de acrilamida [AA] em PBS) a 37 ° C por 7-8 h antes do processamento posterior.
   NOTA: Temperatura de fixação mais alta junto com alta concentração de acrilamida ajuda a extinguir a reticulação intermolecular entre proteínas durante os processos de fixação e é relatada para preservar as ultraestruturas detalhadas das proteínas⁸.
4. Para células com agregados polyQ, cultive as células em DMEM completo até atingirem 70%-90% de confluência. Depois de mudar para o novo DMEM completo, transfecte 1 μg de plasmídeo que codifica mHtt97Q-GFP nas células usando o agente de transfecção (detalhes na Tabela de Materiais). Realize a transfecção de acordo com o protocolo do fabricante.
5. Após 24-48 h de transfecção, remova o meio de cultura e adicione 800 μL de solução de fixação (4% PFA, 30% AA) às lamínulas com células. Incubar as lamínulas a 37 °C durante 6-8 h. Lave a lamínula com PBS 3x e as amostras de células resultantes estarão prontas para processamento posterior.

3. Preparação de amostras de cérebro de camundongo

1. Compre camundongos C57BL/6J (6 a 8 semanas de idade, machos e fêmeas, seis camundongos) e camundongos Alzheimer (9 meses de idade, fêmeas, três camundongos) de fontes comerciais (detalhes na Tabela de Materiais). Realizar a eutanásia via narcose por dióxido de carbono de acordo com o protocolo padrão²⁷. Em resumo, coloque os camundongos em uma câmara e encha a câmara com um fluxo de 100% de CO₂ na ordem de 30% a 70% do volume da câmara/min e mantenha o fluxo por pelo menos 1 min após a morte clínica.
2. Depois de confirmar a eutanásia humana, decapite rapidamente os ratos usando uma tesoura. Exponha o crânio com uma grande incisão através da pele na linha média. Puxe a pele em direção ao nariz do animal para expor totalmente o crânio.
3. Corte o crânio ao longo da linha média com uma tesoura fina e descasque as duas metades do crânio para o lado. Use uma pinça para retirar o cérebro em uma placa de Petri no gelo com PBS. Lave o cérebro fresco do camundongo com PBS gelado e transfira o cérebro para 10 mL de tampão de fixação (4% PFA, 30% AA).
4. Incubar o cérebro do rato em tampão de fixação a 4 °C durante 24-48 h e depois transferi-lo para 37 °C durante a noite. Depois de lavá-lo com PBS estéril, corte o cérebro do rato em seções de 150 μm usando um vibratomo e armazene em PBS a 4 ° C.

4. Incorporação de hidrogel, desnaturação e expansão de amostras de células e tecidos

1. Certifique-se de que as amostras foram incubadas no tampão de fixação pelo tempo necessário, conforme indicado acima. Descongele as soluções de estoque X, iniciador de radicais livres e acelerador e mantenha-as no gelo durante todo o processo.
   NOTA: O tempo de incubação insuficiente pode causar um número reduzido de proteínas retidas no híbrido de hidrogel e, portanto, causar uma diminuição no sinal.
2. Pegue a lamínula com células e coloque-a sobre uma lâmina de vidro usando uma pinça. Pegue as fatias de cérebro (150 μm de espessura) e coloque-as em outra lâmina de vidro usando um pincel de lã macia, certificando-se de que estejam planas. Livre-se do excesso de líquido que acompanha as amostras.
3. Empilhe duas lamínulas (# 1.5), adicionando gotas de água entre elas, em ambos os lados da amostra na lâmina de vidro para fazer uma câmara de gelificação. Coloque a lâmina de vidro com a amostra voltada para cima em um bloco de calor gelado e resfrie-a a 4 °C por 1 min.
4. Adicione 10% (p / p) de TEMED ao estoque X e, em seguida, 10% de solução APS. Rapidamente vórtice e, dentro de 1 minuto após a mistura, solte lentamente a solução resultante na câmara sobre as amostras para cobrir a superfície da amostra, evitando bolhas de ar. Mantenha a solução e as amostras no gelo (ou em um bloco de calor gelado) para evitar a formação de gel (alto grau de polimerização) antes de adicionar à amostra.
5. Uma vez que a amostra esteja totalmente imersa na solução, coloque uma lamínula plana, transparente e coberta de filme em cima da amostra como uma tampa para a câmara. Deixe a câmara no gelo ou em um bloco de calor gelado por mais 1 min antes de incubá-la em uma incubadora umidificadora a 37 ° C por 30 min.
6. Retire a câmara de gelificação da lâmina de vidro da incubadora a 37 °C. Um gel não transparente deve ser observado após a remoção da tampa. Recupere o gel cortando com uma lâmina de barbear ou, alternativamente, coloque a lâmina de vidro em tampão desnaturante em temperatura ambiente por 15 min. O gel se separará da lâmina de vidro.
7. Incube o gel isolado em tampão desnaturante sob condições de calor para obter mais desnaturação e delipidação. Para amostras de células, desnaturar a 95 °C por 1 h. Para fatias de cérebro de 150 μm de espessura, desnaturar a 70 ° C por 3 h, seguido de 95 ° C por 1 h.
   NOTA: O gel pode ficar encaracolado quando incubado pela primeira vez com tampão desnaturante à temperatura ambiente. É normal e ficará plano após a desnaturação em alta temperatura. Ao trabalhar com amostras de tecido mais espessas, é necessário um tempo de desnaturação mais longo.
8. Após o tratamento térmico, lave a amostra desnaturada 3x com PBS por 10 min. Neste ponto, o gel deve ter se expandido para cerca de 1,5 vezes o tamanho original. Incube o gel lavado com água ultrapura em um recipiente grande (pelo menos 20 vezes o volume do gel) para obter uma taxa de expansão mais alta. Troque a água a cada 1 h 3x e deixe a amostra na escuridão durante a noite. O gel resultante está pronto para a imagem.
   NOTA: A taxa de expansão depende muito das propriedades mecânicas da amostra original. Obteve-se uma expansão de 4,2 vezes para as amostras de células e 3,4 vezes a expansão para a amostra de tecido cerebral.

5. Imagem sem marcação da distribuição de proteínas endógenas em amostras de células e tecidos expandidos

1. Mantenha as amostras de gel expandido em água durante o processo de imagem. O gel é frágil após a expansão, por isso deve ser manuseado com cautela. Coloque o gel de amostra expandido em uma lâmina de microscópio (1 mm de espessura) com um espaçador de microscópio com tamanhos e profundidades de abertura apropriados, cheio de água. Cubra o espaçador com uma lamínula (# 1.5) e certifique-se de que esteja devidamente vedado para evitar o movimento da amostra.
2. Coloque a amostra com a célula ou tecido expandido no estágio motorizado com a lamínula voltada para a objetiva. Clique em Ocular no software para alterar o caminho da luz para campo claro e ajustar a posição z usando um botão manual.
3. Adicione óleo de imersão na parte superior da amostra e ajuste o condensador para a posição correta para iluminação Köhler enquanto observa sob campo claro com ampliação de 25x da objetiva. Insira 791,3 nm na janela de comprimento de onda OPO no painel de laser para direcionar a vibração da proteína CH₃ a 2940 cm⁻¹.
4. Mude a luz do microscópio do campo claro (ocular) para o modo de varredura a laser clicando no botão LSM e abra o obturador do laser SRS pressionando o botão Obturador no painel de controle do laser. Pressione o botão LIVE no software do microscópio para iniciar a aquisição de imagens em tempo real.
5. Encontre o foco adequado alterando o z enquanto olha para a imagem SRS em um curto tempo de permanência de pixel (12,5 μs/pixel) e baixa resolução de imagem (256 pixels x 256 pixels). Assim que a posição z ideal for encontrada, altere o tamanho da varredura e o tempo de permanência em pixels puxando a respectiva barra no software do microscópio.
6. Adquira a imagem pressionando o botão LSM usando a condição de superamostragem (1024 pixels x 1024 pixels) com um tempo de permanência de pixel mais longo (80 μs/pixel) que corresponda à constante de tempo do amplificador de bloqueio. Adquira imagens volumétricas coletando uma pilha z com um tamanho de passo de 1 μm na direção z. Processe e analise o arquivo OIR salvo do software usando o ImageJ.
   NOTA: A configuração detalhada do SRS foi recentemente relatada em Mutlu et ^al.24. Aqui, um laser de picossegundos sintonizável com taxa de repetição de 80 MHz e largura de banda de 2 ps para bomba (770-990 nm) e stokes (1031,2 nm) foi encaminhado para um microscópio confocal de varredura a laser ( detalhado na Tabela de Materiais). Otimize a sobreposição temporal e espacial dos dois feixes para sinais com D₂O puro. É preciso algum esforço para encontrar o z certo para a amostra expandida sob campo claro porque o índice de refração é muito homogêneo em todo o gel.
7. Determine a resolução do VISTA tirando uma imagem SRS de esferas de poliestireno (100 nm) usando uma objetiva de 25x e uma objetiva de 60x. Defina o laser da bomba para 784.5 nm, correspondendo ao deslocamento Raman de 3050 cm⁻¹, característico das vibrações aromáticas de poliestireno CH.
   NOTA: O comprimento de onda do laser da bomba usado aqui é semelhante ao usado no VISTA para proteínas.
8. Com a objetiva de 60x, a metade máxima de onda completa experimental (FWHM, que é a largura da forma da linha na metade da amplitude) da imagem do cordão foi de 276,17 nm. Modele a função do objeto de conta como um semicírculo.
   NOTA: Quando a função gaussiana PSF tem um c (σ) = 269 nm/2.35, a imagem complicada do cordão teria um FWHM medido de 276.17 nm. Como resultado, a resolução do sistema SRS é de 269 nm × 1,22 = 328 nm pelo Critério de Rayleigh. Como o VISTA tem uma expansão média de 4,2 vezes as amostras de células, a resolução efetiva é de 328 nm/4,2 = 78 nm.

6. VISTA correlativo e imagem fluorescente de amostras de tecido imunomarcado e expandido

1. Após a desnaturação, pré-incube as amostras embebidas em hidrogel (por exemplo, corte coronal cerebral de 150 μm) em Triton X-100 (PBST) a 1% (v / v) por 15 min. Mude o tampão de incubação para PBST com anticorpo primário em uma diluição de 1:100. Se vários alvos proteicos forem necessários para imagens multiplex, dilua os respectivos anticorpos primários para diferentes alvos em concentrações adequadas no mesmo coquetel e incube com as amostras simultaneamente.
2. Incubar os géis com anticorpos primários diluídos a 37 °C com agitação suave a 80 rpm por 16-18 h, seguido de lavagem extensiva 3x com PBST por 1-2 h a 37 °C. Vire o gel durante a incubação para evitar a marcação não homogênea de anticorpos aqui e em todas as incubações subsequentes.
3. Incubar as amostras com anticorpos secundários das espécies-alvo correspondentes em diluições de 1:100 com PBST a 37 °C durante 12-16 h, protegidas da luz. Lave as amostras de hidrogel rotuladas 3x com PBST por 1-2 h a 37 °C com agitação suave.
4. Diluir o DAPI até à concentração final de 3 μM em PBS. Adicionar um volume suficiente de solução de DAPI ao hidrogel da amostra para que o gel fique submerso na solução. Incubar durante 1-2 h à temperatura ambiente com agitação suave a 80 rpm. Lave a amostra 3x com PBS.
5. Expanda as amostras de gel imunomarcadas incubando com um grande volume de H₂O duplamente deionizado. Troque a água a cada 1 h 3x e incube as amostras em H₂O durante a noite, protegidas da luz. Durante a rotulagem, o gel deve se expandir 1,5 vezes em comparação com o tampão PBS.
6. Prepare a amostra de imagem conforme descrito na etapa 5.1. Coloque a amostra de imagem no microscópio confocal de varredura a laser com a objetiva de imersão em água de 25x, 1,05 NA, para imagens fluorescentes.
7. Selecione o canal adequado com o respectivo laser de excitação (405 nm, 488 nm, 561 nm e 640 nm) e o par PMT de acordo com os anticorpos direcionados no menu suspenso do software do microscópio. Pressione o botão AO VIVO para aquisição de imagens em tempo real.
8. Ajuste a posição de foco por um botão manual com base no sinal de fluorescência em tempo real. Otimize a potência do laser, o tempo de permanência em pixels e o ganho de PMT no software do microscópio de acordo com o sinal de fluorescência em tempo real para evitar um sinal fraco ou supersaturação.
   NOTA: Avalie a aparência e as características com base nas estruturas relatadas de diferentes anticorpos para eliminar possíveis reatividades cruzadas de anticorpos e evitar diafonia entre diferentes canais de fluorescência.
9. Aperte o botão LSM para começar a adquirir imagens SRS e fluorescentes correlativas. Primeiro, colete imagens de fluorescência volumétrica em amostras imunomarcadas. Quando a imagem de fluorescência estiver concluída, mude o caminho da luz do microscópio para a condição transparente de infravermelho (IR).
10. Altere o canal de detecção de PMT de fluorescência para SRS no software do microscópio. Abra o obturador do laser SRS e execute a imagem volumétrica SRS no campo de view da mesma amostra com a mesma faixa de z. A faixa normal está entre 100-200 μm e pode ir até 700 μm.
    NOTA: Há uma ligeira aberração cromática que causa uma mudança na posição z entre as imagens fluorescentes e as imagens SRS devido à diferença de comprimento de onda nos lasers de excitação. É necessária uma comparação manual lado a lado entre as imagens SRS e de fluorescência z-stack. Procure os recursos de correspondência exata do SRS e do canal de fluorescência para corresponder à posição z com precisão.

7. Construção, treinamento e validação da arquitetura U-Net

NOTA: A instalação no Linux é recomendada. É necessária uma placa gráfica com >10 GB de RAM.

1. Configurando o ambiente
   1. Instale o Anaconda ou o Miniconda em um x86_64 3-5.3.0-linux-. Clone ou baixe os seguintes arquivos: https://github.com/Li-En-Good/VISTA. Crie um ambiente Conda para a plataforma usando a seguinte linha de comando:
      conda env create -f environment.yml
2. Treinando o modelo de previsão
   1. Emparelhe os diretórios das imagens SRS correspondentes com imagens verdadeiras em um arquivo csv. Coloque os diretórios de imagens SRS em path_signal e imagens verdadeiras em path_target colunas.
   2. Coloque o arquivo csv na pasta data/csvs. Modifique a configuração em scripts/train_model_2d.sh se necessário. Ative o ambiente usando a linha de comando:
      conda ativar fnet
   3. Inicie o treinamento do modelo usando a linha de comando:
      ./scripts/train_model_2d.sh 0
      O treinamento será então iniciado. As perdas para cada iteração serão mostradas na linha de comando e salvas com o modelo na pasta save_models/.
3. Valide as imagens no conjunto de treinamento e no conjunto de teste usando a linha de comando:
   ./scripts/train_model_2d.sh 0
   Os resultados da previsão serão salvos na pasta results/.

8. VISTA combinado com previsões U-Net para multiplexidade específica de proteína em imagens sem rótulo

1. Modifique o arquivo csv em data/csvs//test.csv. Substitua os diretórios de path_signal e path_target pelo diretório de novas imagens SRS.
2. Remova os resultados da previsão do treinamento, que é a pasta results/. Execute previsões usando a linha de comando:
   ./scripts/train_model_2d.sh 0
   Os resultados da previsão serão salvos na pasta results//test.

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Resultados

Após estabelecer o princípio de funcionamento do método de imagem e análise, o registro da imagem foi feito para avaliar a taxa de expansão e garantir a expansão isotrópica durante o processamento da amostra (Figura 1A,B). As amostras não tratadas e VISTA foram fotografadas visando a vibração da ligação em 2940 cm⁻¹, que se origina do CH₃ de proteínas endógenas. Em amostras não tratadas, as estruturas r...

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Discussão

Em resumo, apresentamos o protocolo para VISTA, que é uma modalidade livre de marcação para imagens de estruturas celulares e subcelulares ricas em proteínas de células e tecidos. Ao visar o CH₃ endógeno a partir de proteínas em células e tecidos embebidos em hidrogel, o método atinge uma resolução de imagem eficaz até 78 nm em amostras biológicas e resolve uma pequena extrusão em agregados de huntingtina e fibrilas em placas Aβ. Esta técnica é a primeira inst...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 M Tris pH 8	Sigma-Aldrich	648314
16% Paraformaldehyde	Electron microscopy science	15710	diluted to 4% in PBS
25x water immersion objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	NA 1.05
5XFAD Mice	Mutant Mouse Resource and Research Centers and the Jackson Laboratory	B6SJL-Tg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286 V) 6799Vas/Mmjax	Alzheimer brain
60x water immersion objective	Olympus	UPLSAPO60XWIR	NA 1.2
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
anti-MAP2	Cell Signaling Technology	8707
anti-NeuN	Cell Signaling Technology	24307
borosilicate coverslip #1.5	Fisher Scientific	1254581
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratory (JAX)	664	Normal mice
D2O	Sigma-Aldrich	151882	for SRS calibration
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM	GIBCO	10566-016
FBS	GIBCO	A4766
glass slide 3" x 1" x 1 mm	VWR	16004-430
goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21449
goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21236
goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
goat anti-rat IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11077
Grace Bio-Labs Press-To-Seal silicone isolators	Sigma-Aldrich	GBL664108	microscope spacer
Htt-97Q-GFP Plasmid	Gift from Prof. R. Kopito and Prof. F.-U.Hartl.
Laser scanning microscope	Olympus	FV3000	laser scanning confocal microscope
lipofectamine 3000	Thermo Fisher	L3000001	transfection agent
Lycopersicon Esculentum Lectin DyLight®594 (lectin)	Vector Laboratories	DL-1177-1
Microscope spacer	Grace Bio-Labs	621502
N,N′-methylenebisacrylamide (BIS)	Sigma-Aldrich	M1533	bought as 2% solution in water
Nuclease free water	Thermo Fisher	10977-015
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15140-122
poly-strene beads	Sigma-Aldrich	43302	for resolution characterization
Sodium Acrylate	Sigma-Aldrich	408220
sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	71725
soft-wool paint brush #3	TANIS	000333
SRS Laser	A.P.E	picoEmerald	2ps pulse width
tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
Tissue culture flask 25 cm2	Corning	430639
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
tweezer	Fine Science Tool	11295-51
Vibrotome	Leica	VT1200S	the vibratome