Imaging a super-risoluzione label-free abilitato dall'imaging vibrazionale del tessuto gonfio e dall'analisi

Riepilogo

Combinando la chimica dell'idrogel ad espansione del campione con la microscopia a scattering Raman stimolata chimica-specifica senza marcatura, il protocollo descrive come ottenere l'imaging volumetrico a super-risoluzione senza marcatura in campioni biologici. Con un ulteriore algoritmo di segmentazione delle immagini di apprendimento automatico, sono state ottenute immagini multicomponente specifiche per le proteine nei tessuti senza marcatura degli anticorpi.

Abstract

L'utilizzo universale della microscopia a fluorescenza, in particolare della microscopia a super-risoluzione, ha notevolmente avanzato le conoscenze sulla biologia moderna. Al contrario, il requisito della marcatura con fluorofori nelle tecniche fluorescenti pone sfide significative, come il fotosbiancamento e la marcatura non uniforme delle sonde fluorescenti e l'elaborazione prolungata dei campioni. In questo protocollo, vengono presentate le procedure di lavoro dettagliate dell'imaging vibrazionale del tessuto gonfio e dell'analisi (VISTA). VISTA aggira gli ostacoli associati ai fluorofori e consente di ottenere immagini volumetriche a super-risoluzione label-free in campioni biologici con risoluzione spaziale fino a 78 nm. La procedura viene stabilita incorporando cellule e tessuti in idrogel, espandendo isotropicamente l'ibrido del campione di idrogel e visualizzando le distribuzioni proteiche endogene mediante imaging vibrazionale con microscopia a diffusione Raman stimolata. Il metodo è dimostrato sia sulle cellule che sui tessuti cerebrali di topo. Sono state osservate immagini VISTA e di immunofluorescenza altamente correlate, che convalidano l'origine proteica delle specificità di imaging. Sfruttando tale correlazione, un algoritmo di segmentazione delle immagini basato sull'apprendimento automatico è stato addestrato per ottenere la previsione multicomponente di nuclei, vasi sanguigni, cellule neuronali e dendriti da immagini cerebrali di topo prive di marcatura. La procedura è stata ulteriormente adattata per studiare gli aggregati patologici di poli-glutammina (polyQ) nelle cellule e le placche di amiloide-beta (Aβ) nei tessuti cerebrali ad alto rendimento, giustificando il suo potenziale per campioni clinici su larga scala.

Introduzione

Lo sviluppo dei metodi di imaging ottico ha rivoluzionato la comprensione della biologia moderna perché forniscono informazioni spaziali e temporali senza precedenti di bersagli su diverse scale, dalle proteine subcellulari agli organi^interi. Tra questi, la microscopia a fluorescenza è la più consolidata, con un'ampia gamma di coloranti organici con alti coefficienti di estinzione e rese quantistiche^{2, proteine} fluorescenti codificate geneticamente 3 facili da usare e metodi di super-risoluzione come STED, PALM e STORM per l'imaging di strutture su scala nanometrica ^4,5. Inoltre, i recenti progressi nell'ingegneria dei campioni e nella chimica della conservazione, che espandono i campioni incorporati in idrogel polimerici rigonfiabili ^6,7,8, consentono una risoluzione limitata alla sub-diffrazione sui microscopi a fluorescenza convenzionali. Ad esempio, la microscopia ad espansione (ExM) migliora efficacemente la risoluzione dell'immagine di quattro volte con un'espansione isotropa del campione di quattro volte⁷.

Nonostante i suoi vantaggi, la microscopia a fluorescenza a super-risoluzione condivide i limiti che derivano dalla marcatura con fluoroforo. In primo luogo, il fotobleaching e l'inattivazione dei fluorofori compromettono la capacità di valutazioni ripetitive e quantitative della fluorescenza. Il fotosbiancamento è un evento inevitabile quando la luce continua a pompare elettroni in stati eccitati elettronicamente⁹. In secondo luogo, etichettare i fluorofori sui bersagli desiderati non è sempre un compito semplice. Ad esempio, l'immunocolorazione richiede un processo di preparazione del campione lungo e laborioso e ostacola la produttività dell'imaging¹⁰. Potrebbe anche introdurre artefatti dovuti a una marcatura disomogenea degli anticorpi, specialmente in profondità all'interno dei tessuti¹¹. Inoltre, le strategie di marcatura appropriate che mirano ai fluorofori per le proteine desiderate potrebbero essere sottosviluppate. Ad esempio, sono stati necessari screening approfonditi per trovare anticorpi efficaci per le placche Aβ¹². I coloranti organici più piccoli, come il rosso Congo, hanno spesso una specificità limitata, colorando solo il nucleo della placca Aβ. È quindi altamente auspicabile sviluppare una modalità di super-risoluzione label-free che eluda gli svantaggi della marcatura con fluoroforo e fornisca immagini complementari ad alta risoluzione dalle cellule ai tessuti e persino a campioni umani su larga scala.

La microscopia Raman fornisce un contrasto senza marcatura per strutture chimiche specifiche e mappa la distribuzione di legami chimici altrimenti invisibili osservando le transizioni vibrazionali eccitate¹³. In particolare, è stato dimostrato che l'imaging a diffusione Raman stimolata (SRS) su campioni label-free o minuscoli marcati ha una velocità e una risoluzione simili alla microscopia a fluorescenza^14,15. Ad esempio, la regione sana del cervello è stata facilmente differenziata dalla regione infiltrata dal tumore nei tessuti umani e murini^16,17. Le placche Aβ sono state anche chiaramente visualizzate prendendo di mira la vibrazione della proteina CH₃ (2940 ^cm-1) e l'ammide I (1660 ^cm-1) su una fetta di cervello appena congelata senza alcuna marcatura¹⁸. Lo scattering Raman, quindi, offre un robusto contrasto label-free che supera i limiti dei fluorofori. La domanda è quindi diventata come si possa raggiungere la capacità di super-risoluzione utilizzando lo scattering Raman, che potrebbe rivelare dettagli strutturali su scala nanometrica e implicazioni funzionali nei campioni biologici.

Sebbene siano stati fatti ampi sforzi per ottenere la super-risoluzione per la microscopia Raman con eleganti strumentazioni ottiche, il miglioramento della risoluzione sui campioni biologici è stato piuttosto limitato 19,20,21. Qui, sulla base dei recenti lavori ^22,23, presentiamo un protocollo che combina una strategia di espansione del campione con lo scattering Raman stimolato per l'imaging vibrazionale senza etichetta a super-risoluzione, denominato Vibrational Imaging of Swelled Tissues and Analysis (VISTA). In primo luogo, le cellule e i tessuti sono stati incorporati in matrici di idrogel attraverso un protocollo di ibridazione proteina-idrogel ottimizzato. Gli ibridi tissutali in idrogel sono stati quindi incubati in soluzioni ricche di detergenti per la delipidazione, seguita dall'espansione in acqua. I campioni espansi sono stati quindi ripresi da un normale microscopio SRS mirando alle vibrazioni CH₃ dalle proteine endogene trattenute. VISTA, grazie alla sua funzione di imaging label-free, bypassa il fotobleaching e l'etichettatura disomogenea derivanti dall'etichettatura con fluorofori, con una produttività di elaborazione del campione molto più elevata. Questo è anche il primo imaging label-free al di sotto dei 100 nm (fino a 78 nm) riportato. Non è necessaria alcuna strumentazione ottica aggiuntiva oltre alla tipica configurazione SRS^22,24, il che la rende facilmente applicabile. Con immagini VISTA e immunofluorescenza correlate, è stato addestrato un algoritmo di segmentazione delle immagini basato sull'apprendimento automatico^25,26 per generare immagini multiplex specifiche per proteine da immagini a canale singolo. Il metodo è stato ulteriormente applicato per studiare le placche Aβ nei tessuti cerebrali di topo, fornendo un'immagine olistica adatta per la sottofenotipizzazione basata sulle viste fini del nucleo della placca e dei filamenti periferici circondati da nuclei cellulari e vasi sanguigni.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali eseguite in questo studio sono state approvate dal California Institute of Technology Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) e le procedure del protocollo sono state conformi a tutte le normative etiche pertinenti.

1. Preparazione di soluzioni madre per la fissazione e l'espansione del campione

1. Preparare 40 mL di soluzione di fissazione sciogliendo prima 12 g di acrilammide (30% p/v) solido in 26 mL di acqua priva di nucleasi. Quindi, aggiungere alla miscela 10 ml di soluzione madre di PFA al 16%. Infine, aggiungere 4 ml di soluzione salina tamponata con fosfato 10x (PBS, pH 7,4). La soluzione preparata può essere conservata a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
   NOTA: L'acrilammide è pericolosa, quindi la fase di dissoluzione dell'acrilammide solido in acqua deve essere eseguita in una cappa aspirante.
2. Preparare la soluzione di gelificazione (stock X) sciogliendo 70 mg di acrilato di sodio (7% p/v), 200 mg di acrilammide (20% p/v) e 50 μl di N, N'-metilenbisacrilammide (0,1% p/v) in 420 μl di acqua ultrapura. Aggiungere 57 μl di PBS 10x filtrato sterile (pH 7,4) alla fine e conservare questa soluzione a -20 °C per un massimo di 1 settimana.
   NOTA: Evitare il solido acrilato di sodio che forma grumi; Assicurarsi che l'acrilato di sodio utilizzato sia sotto forma di polveri dispersive. Il calcio X prodotto sarà un liquido incolore; Se il liquido appare giallo chiaro, procurati nuovo acrilato di sodio.
3. Preparare la soluzione iniziatrice della polimerizzazione sciogliendo 1 g di persolfato di ammonio (APS, 10% p/p) in 9 mL di acqua priva di nucleasi. Allo stesso modo, preparare la soluzione dell'acceleratore di polimerizzazione sciogliendo 1 g di tetrametiletilendiammina (TEMED, 10% p/p) in 9 mL di acqua priva di nucleasi. Aliquotare le soluzioni risultanti e conservare a -20 °C.
4. Preparare 50 mL di tampone denaturante sciogliendo 2,88 g di sodio dodecil solfato (SDS, 200 mM), 0,584 g di cloruro di sodio (200 mM) e 2,5 mL di tampone Tris-HCl 1M (50 mM, pH 8) in acqua priva di nucleasi.
   NOTA: La concentrazione di SDS è vicina alla sua condizione di saturazione. Una certa cristallizzazione nel tampone è normale. Un leggero riscaldamento fino a 37 °C può rendere la soluzione limpida e pronta all'uso.

2. Preparazione di campioni di cellule di mammifero

1. Seminare 3,5 x 10⁴ cellule HeLa su un vetrino coprioggetti borosilicato da 12 mm (#1,5) in una piastra a 24 pozzetti e quindi coltivare le cellule in 400 μL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino e l'1% di antibiotici penicillina-streptomicina (DMEM completo) in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO₂ a 37 °C.
2. Per ottenere cellule in diversi stadi mitotici, incubare le cellule in DMEM completo fino al 60% di confluenza. Quindi, trattare le cellule con DMEM senza siero fetale bovino per 20 ore per sincronizzare gli stadi cellulari. Dopo la sincronizzazione, cambiare il terreno per consentire alle cellule di completare il DMEM e incubare per altre 2-6 ore per mirare alle varie fasi della mitosi.
3. Lavare le cellule HeLa su vetrini coprioggetti con PBS sterile e incubarle con una soluzione di fissazione (4% PFA, 30% acrilammide [AA] in PBS) a 37 °C per 7-8 ore prima di un'ulteriore lavorazione.
   NOTA: Una temperatura di fissazione più elevata insieme a un'alta concentrazione di acrilammide aiuta a spegnere la reticolazione intermolecolare tra le proteine durante i processi di fissazione e si dice che preservi le ultra-strutture dettagliate delle proteine⁸.
4. Per le cellule con aggregati polyQ, far crescere le cellule in DMEM completo fino a raggiungere la confluenza del 70%-90%. Dopo il passaggio al nuovo DMEM completo, trasfettare 1 μg di plasmide codificante mHtt97Q-GFP nelle cellule utilizzando l'agente di trasfezione (dettagli nella tabella dei materiali). Eseguire la trasfezione secondo il protocollo del produttore.
5. Dopo 24-48 ore di trasfezione, rimuovere il terreno di coltura e aggiungere 800 μL di soluzione di fissazione (4% PFA, 30% AA) ai vetrini coprioggetti con cellule. Incubare i vetrini coprioggetti a 37 °C per 6-8 ore. Lavare il vetrino coprioggetti con PBS 3x e i campioni di cellule risultanti sono pronti per l'ulteriore elaborazione.

3. Preparazione di campioni di cervello di topo

1. Acquista topi C57BL/6J (da 6 a 8 settimane, maschi e femmine, sei topi) e topi Alzheimer (9 mesi, femmine, tre topi) da fonti commerciali (dettagli nella Tabella dei materiali). Eseguire l'eutanasia tramite narcosi da anidride carbonica secondo il protocollo standard²⁷. In breve, posizionare i topi in una camera e riempire la camera con un flusso di CO₂ al 100% nell'ordine del 30%-70% del volume della camera/min e mantenere il flusso per almeno 1 minuto dopo la morte clinica.
2. Dopo aver confermato l'eutanasia umana, decapita rapidamente i topi usando una forbice. Esporre il cranio con una grande incisione attraverso la pelle lungo la linea mediana. Tira la pelle verso il naso dell'animale per esporre completamente il cranio.
3. Taglia il cranio lungo la linea mediana con le forbici sottili e stacca le due metà del cranio di lato. Usa le pinzette per estrarre il cervello in una capsula di Petri con ghiaccio con PBS. Lavare il cervello di topo fresco con PBS ghiacciato e trasferire il cervello in 10 ml di tampone di fissazione (4% PFA, 30% AA).
4. Incubare il cervello di topo in tampone di fissazione a 4 °C per 24-48 ore e poi trasferirlo a 37 °C durante la notte. Dopo averlo lavato con PBS sterile, tagliare il cervello del topo in sezioni di 150 μm utilizzando un vibratomo e conservarlo in PBS a 4 °C.

4. Inclusione, denaturazione ed espansione dell'idrogel di campioni di cellule e tessuti

1. Assicurarsi che i campioni siano stati incubati nel tampone di fissazione per il tempo richiesto, come indicato sopra. Scongelare le soluzioni stock X, iniziatore di radicali liberi e acceleratore e mantenerle in ghiaccio durante l'intero processo.
   NOTA: Un tempo di incubazione insufficiente potrebbe causare una riduzione del numero di proteine trattenute sull'ibrido di idrogel e, quindi, causare una diminuzione del segnale.
2. Raccogli il vetrino coprioggetti con le cellule e posizionalo su un vetrino usando una pinzetta. Raccogli le fette di cervello (150 μm di spessore) e posizionale su un altro vetrino usando un pennello di lana morbida, assicurandoti che siano piatte. Elimina il liquido in eccesso che viene fornito con i campioni.
3. Impilare due vetrini coprioggetti (#1.5), aggiungendo gocce d'acqua tra di loro, su entrambi i lati del campione sul vetrino per creare una camera di gelificazione. Posizionare il vetrino con il campione rivolto verso l'alto su un blocco di calore ghiacciato e raffreddarlo a 4 °C per 1 minuto.
4. Aggiungere il 10% (p/p) di TEMED alla soluzione di serie X e poi il 10% di APS. Agitare rapidamente e, entro 1 minuto dalla miscelazione, far cadere lentamente la soluzione risultante nella camera sui campioni per coprire la superficie del campione, evitando bolle d'aria. Conservare la soluzione e i campioni su ghiaccio (o un blocco di calore ghiacciato) per evitare la formazione di gel (alto grado di polimerizzazione) prima di aggiungerli al campione.
5. Una volta che il campione è completamente immerso nella soluzione, posizionare un vetrino coprioggetti piatto, trasparente e ricoperto di pellicola sopra il campione come coperchio per la camera. Lasciare la camera sul ghiaccio o su un blocco di calore ghiacciato per un altro 1 minuto prima di incubarla in un'incubatrice umidificatrice a 37 °C per 30 minuti.
6. Estrarre la camera di gelificazione dal vetrino dell'incubatore a 37 °C. Dopo aver rimosso il coperchio, si deve osservare un gel non trasparente. Recuperare il gel tagliandolo con una lametta o, in alternativa, mettere il vetrino in tampone denaturante a temperatura ambiente per 15 min. Il gel si separerà dal vetrino.
7. Incubare il gel isolato in un tampone denaturante in condizioni di calore per ottenere un'ulteriore denaturazione e delipidazione. Per i campioni cellulari, denaturare a 95 °C per 1 ora. Per fette di cervello spesse 150 μm, denaturare a 70 °C per 3 ore, quindi a 95 °C per 1 ora.
   NOTA: Il gel potrebbe diventare riccio quando viene incubato per la prima volta con un tampone denaturante a temperatura ambiente. È normale e diventerà piatto dopo la denaturazione ad alta temperatura. Quando si lavora con campioni di tessuto più spessi, è necessario un tempo di denaturazione più lungo.
8. Dopo il trattamento termico, lavare il campione denaturato 3 volte con PBS per 10 minuti. A questo punto, il gel dovrebbe essersi espanso fino a circa 1,5 volte la dimensione originale. Incubare il gel lavato con acqua ultrapura in un contenitore capiente (almeno 20 volte il volume del gel) per ottenere un rapporto di espansione più elevato. Cambiare l'acqua ogni 1 ora 3 volte e lasciare il campione al buio durante la notte. Il gel risultante è pronto per l'immagine.
   NOTA: Il rapporto di espansione dipende in gran parte dalle proprietà meccaniche del campione originale. Sono stati ottenuti un'espansione di 4,2 volte per i campioni di cellule e un'espansione di 3,4 volte per il campione di tessuto cerebrale.

5. Imaging label-free della distribuzione endogena delle proteine in campioni di cellule e tessuti espansi

1. Conservare i campioni di gel espanso in acqua durante il processo di imaging. Il gel è fragile dopo l'espansione, quindi deve essere maneggiato con cautela. Posizionare il gel espanso per campioni su un vetrino da microscopio (spessore 1 mm) con un distanziatore per microscopio con aperture e profondità adeguate, riempito d'acqua. Coprire il distanziatore con un vetrino coprioggetti (#1.5) e assicurarsi che sia adeguatamente sigillato per evitare il movimento del campione.
2. Posizionare il campione con la cellula espansa o il tessuto sul tavolino motorizzato con il vetrino coprioggetti rivolto verso l'obiettivo. Fare clic su Ocular sul software per modificare il percorso della luce in campo chiaro e regolare la posizione z utilizzando una manopola manuale.
3. Aggiungere olio da immersione sulla parte superiore del campione e regolare il condensatore nella posizione corretta per l'illuminazione Köhler mentre si osserva in campo luminoso con ingrandimento 25x dall'obiettivo. Immettere 791,3 nm nella finestra di lunghezza d'onda OPO sul pannello laser per indirizzare la vibrazione della proteina CH₃ a 2940 cm⁻¹.
4. Cambia la luce del microscopio dal campo chiaro (oculare) alla modalità di scansione laser facendo clic sul pulsante LSM e apri l'otturatore laser SRS premendo il pulsante Otturatore sul pannello di controllo del laser. Premere il pulsante LIVE nel software del microscopio per avviare l'acquisizione delle immagini in tempo reale.
5. Trova la messa a fuoco corretta cambiando la z mentre guardi l'immagine SRS con un tempo di permanenza dei pixel breve (12,5 μs/pixel) e una bassa risoluzione dell'immagine (256 pixel x 256 pixel). Una volta trovata la posizione z ideale, modificare le dimensioni della scansione e il tempo di permanenza dei pixel tirando la rispettiva barra nel software del microscopio.
6. Acquisire l'immagine premendo il pulsante LSM utilizzando la condizione di supercampionamento (1024 pixel x 1024 pixel) con un tempo di permanenza dei pixel più lungo (80 μs/pixel) che corrisponde alla costante di tempo dell'amplificatore di blocco. Acquisizione di immagini volumetriche raccogliendo uno z-stack con una dimensione del passo di 1 μm nella direzione z. Elabora e analizza il file OIR salvato dal software utilizzando ImageJ.
   NOTA: La configurazione dettagliata di SRS è stata recentemente riportata in Mutlu et ^al.24. Qui, un laser a picosecondi sintonizzabile con una frequenza di ripetizione di 80 MHz e una larghezza di banda di 2 ps per la pompa (770-990 nm) e le corse (1031,2 nm) è stato instradato in un microscopio confocale a scansione laser (dettagliato nella Tabella dei materiali). Ottimizza la sovrapposizione temporale e spaziale dei due raggi per segnali con D₂O puro. Ci vuole un certo sforzo per trovare il giusto z per il campione espanso in campo chiaro perché l'indice di rifrazione è molto omogeneo in tutto il gel.
7. Determinare la risoluzione di VISTA scattando un'immagine SRS di perle di polistirene (100 nm) utilizzando sia un obiettivo 25x che un obiettivo 60x. Impostare il laser della pompa a 784,5 nm, corrispondente a uno spostamento Raman di 3050 cm⁻¹, caratteristico delle vibrazioni aromatiche C-H del polistirene.
   NOTA: La lunghezza d'onda del laser a pompa utilizzata qui è simile a quella utilizzata in VISTA per le proteine.
8. Con l'obiettivo 60x, la metà massima sperimentale dell'onda intera (FWHM, che è la larghezza della forma della linea a metà dell'ampiezza) dell'immagine del perline era di 276,17 nm. Modella la funzione dell'oggetto perlina come un semicerchio.
   NOTA: Quando la funzione gaussiana PSF ha un c (σ) = 269 nm/2,35, l'immagine del bead contorto avrebbe un FWHM misurato di 276,17 nm. Di conseguenza, la risoluzione del sistema SRS è di 269 nm × 1,22 = 328 nm secondo il criterio di Rayleigh. Poiché VISTA ha una media di espansione di 4,2 volte dei campioni di cellule, la risoluzione effettiva è scesa a 328 nm/4,2 = 78 nm.

6. VISTA correlata e imaging fluorescente di campioni di tessuto immunomarcato ed espanso

1. Dopo la denaturazione, pre-incubare i campioni inclusi in idrogel (ad es. sezione coronale cerebrale da 150 μm) in Triton X-100 (PBST) all'1% (v/v) per 15 minuti. Passare il tampone di incubazione a PBST con anticorpo primario a una diluizione 1:100. Se sono necessari più bersagli proteici per l'imaging multiplex, diluire i rispettivi anticorpi primari per bersagli diversi a concentrazioni corrette nello stesso cocktail e incubare con i campioni contemporaneamente.
2. Incubare i gel con anticorpi primari diluiti a 37 °C agitando delicatamente a 80 giri/min per 16-18 ore, seguito da un lavaggio prolungato 3 volte con PBST per 1-2 ore a 37 °C. Capovolgere il gel durante l'incubazione per evitare la marcatura disomogenea degli anticorpi qui e in tutte le incubazioni successive.
3. Incubare i campioni con anticorpi secondari di specie corrispondenti a diluizioni 1:100 con PBST a 37 °C per 12-16 ore, al riparo dalla luce. Lavare i campioni di idrogel marcati 3 volte con PBST per 1-2 ore a 37 °C agitando delicatamente.
4. Diluire DAPI alla concentrazione finale di 3 μM in PBS. Aggiungere un volume sufficiente di soluzione DAPI all'idrogel campione in modo che il gel sia immerso nella soluzione. Incubare per 1-2 ore a temperatura ambiente agitando delicatamente a 80 giri/min. Lavare il campione 3 volte con PBS.
5. Espandere i campioni di gel immunomarcati incubandoli con un grande volume di H₂O deionizzato doppio. Cambiare l'acqua ogni 1 ora 3 volte e incubare i campioni in H₂O durante la notte, al riparo dalla luce. Durante l'etichettatura, il gel dovrebbe espandersi di 1,5 volte rispetto al tampone PBS.
6. Preparare il campione di imaging come descritto nel passaggio 5.1. Posizionare il campione di imaging sul microscopio confocale a scansione laser con l'obiettivo a immersione in acqua 25x, 1,05 NA, per l'imaging fluorescente.
7. Selezionare il canale corretto con il rispettivo laser di eccitazione (405 nm, 488 nm, 561 nm e 640 nm) e la coppia PMT in base agli anticorpi mirati nel menu a discesa del software del microscopio. Premere il pulsante LIVE per l'acquisizione di immagini in tempo reale.
8. Regola la posizione di messa a fuoco tramite una manopola manuale in base al segnale di fluorescenza in tempo reale. Ottimizza la potenza del laser, il tempo di permanenza dei pixel e il guadagno PMT nel software del microscopio in base al segnale di fluorescenza in tempo reale per evitare un segnale debole o una sovrasaturazione.
   NOTA: Valutare l'aspetto e le caratteristiche in base alle strutture riportate di diversi anticorpi per eliminare potenziali reattività crociate degli anticorpi ed evitare la diafonia tra diversi canali di fluorescenza.
9. Premi il pulsante LSM per iniziare ad acquisire immagini SRS e fluorescenti correlate. Innanzitutto, raccogliere immagini di fluorescenza volumetrica su campioni immunomarcati. Una volta terminato l'imaging a fluorescenza, impostare il percorso luminoso del microscopio sulla condizione trasparente a infrarossi (IR).
10. Modificare il canale di rilevamento da PMT a fluorescenza a SRS sul software del microscopio. Aprire l'otturatore per il laser SRS ed eseguire l'imaging volumetrico SRS sul campo visivo dello stesso campione con lo stesso intervallo di z. L'intervallo normale è compreso tra 100-200 μm e può arrivare fino a 700 μm.
    NOTA: C'è una leggera aberrazione cromatica che provoca uno spostamento della posizione z tra le immagini fluorescenti e le immagini SRS a causa della differenza di lunghezza d'onda nei laser di eccitazione. È necessario un confronto manuale fianco a fianco tra le immagini SRS e z-stack a fluorescenza. Cerca le caratteristiche di corrispondenza esatte sia dall'SRS che dal canale di fluorescenza per abbinare esattamente la posizione z.

7. Costruzione, formazione e validazione dell'architettura U-Net

NOTA: Si consiglia l'installazione su Linux. È necessaria una scheda grafica con >10 GB di RAM.

1. Configurazione dell'ambiente
   1. Installa Anaconda o Miniconda su un 3-5.3.0-linux-x86_64. Clona o scarica i seguenti file: https://github.com/Li-En-Good/VISTA. Creare un ambiente Conda per la piattaforma utilizzando la riga di comando seguente:
      conda env create -f environment.yml
2. Addestramento del modello di stima
   1. Abbina le directory delle immagini SRS corrispondenti con le immagini di verità di base in un file csv. Posiziona le directory delle immagini SRS sotto path_signal e le immagini di verità di base sotto path_target colonne.
   2. Metti il file csv nella cartella data/csvs. Se necessario, modificare la configurazione in script/train_model_2d.sh. Attiva l'ambiente utilizzando la riga di comando:
      conda attiva fnet
   3. Avviare l'addestramento del modello utilizzando la riga di comando:
      ./scripts/train_model_2d.sh 0
      A questo punto inizierà la formazione. Le perdite per ogni iterazione verranno mostrate nella riga di comando e salvate con il modello nella cartella save_models/.
3. Convalidare le immagini nel set di training e nel set di test utilizzando la riga di comando:
   ./scripts/train_model_2d.sh 0
   I risultati della previsione verranno salvati nella cartella results/.

8. VISTA combinato con le previsioni U-Net per la multiplexità proteino-specifica in immagini label-free

1. Modificare il file csv in data/csvs//test.csv. Sostituire le directory di path_signal e path_target con la directory delle nuove immagini SRS.
2. Rimuovere i risultati della stima dal training, ovvero il nome del file < dei risultati della cartella del file CSV>. Esegui le previsioni utilizzando la riga di comando:
   ./scripts/train_model_2d.sh 0
   I risultati della previsione verranno salvati nella cartella results//test.

Risultati

Dopo aver stabilito il principio di funzionamento del metodo di imaging e analisi, è stata eseguita la registrazione dell'immagine per valutare il rapporto di espansione e garantire l'espansione isotropa durante l'elaborazione del campione (Figura 1A, B). Sia i campioni non trattati che quelli VISTA sono stati sottoposti a imaging mentre miravano alla vibrazione di legame a 2940 ^cm-1, che origina dal CH₃ delle proteine...

Discussione

In sintesi, presentiamo il protocollo per VISTA, che è una modalità label-free per visualizzare strutture cellulari e subcellulari ricche di proteine di cellule e tessuti. Prendendo di mira il CH₃ endogeno dalle proteine nelle cellule e nei tessuti inclusi in idrogel, il metodo raggiunge una risoluzione di imaging efficace fino a 78 nm in campioni biologici e risolve l'estrusione minore negli aggregati di huntingtina e nelle fibrille nelle placche Aβ. Questa tecnica è il p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 M Tris pH 8	Sigma-Aldrich	648314
16% Paraformaldehyde	Electron microscopy science	15710	diluted to 4% in PBS
25x water immersion objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	NA 1.05
5XFAD Mice	Mutant Mouse Resource and Research Centers and the Jackson Laboratory	B6SJL-Tg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286 V) 6799Vas/Mmjax	Alzheimer brain
60x water immersion objective	Olympus	UPLSAPO60XWIR	NA 1.2
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
anti-MAP2	Cell Signaling Technology	8707
anti-NeuN	Cell Signaling Technology	24307
borosilicate coverslip #1.5	Fisher Scientific	1254581
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratory (JAX)	664	Normal mice
D2O	Sigma-Aldrich	151882	for SRS calibration
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM	GIBCO	10566-016
FBS	GIBCO	A4766
glass slide 3" x 1" x 1 mm	VWR	16004-430
goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21449
goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21236
goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
goat anti-rat IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11077
Grace Bio-Labs Press-To-Seal silicone isolators	Sigma-Aldrich	GBL664108	microscope spacer
Htt-97Q-GFP Plasmid	Gift from Prof. R. Kopito and Prof. F.-U.Hartl.
Laser scanning microscope	Olympus	FV3000	laser scanning confocal microscope
lipofectamine 3000	Thermo Fisher	L3000001	transfection agent
Lycopersicon Esculentum Lectin DyLight®594 (lectin)	Vector Laboratories	DL-1177-1
Microscope spacer	Grace Bio-Labs	621502
N,N′-methylenebisacrylamide (BIS)	Sigma-Aldrich	M1533	bought as 2% solution in water
Nuclease free water	Thermo Fisher	10977-015
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15140-122
poly-strene beads	Sigma-Aldrich	43302	for resolution characterization
Sodium Acrylate	Sigma-Aldrich	408220
sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	71725
soft-wool paint brush #3	TANIS	000333
SRS Laser	A.P.E	picoEmerald	2ps pulse width
tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
Tissue culture flask 25 cm2	Corning	430639
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
tweezer	Fine Science Tool	11295-51
Vibrotome	Leica	VT1200S	the vibratome