Imagerie à super-résolution sans marquage rendue possible par l’imagerie vibrationnelle des tissus gonflés et l’analyse

Résumé

En combinant la chimie de l’hydrogel à expansion d’échantillon avec la microscopie à diffusion Raman stimulée sans marquage spécifique aux produits chimiques, le protocole décrit comment obtenir une imagerie volumétrique à super-résolution sans marquage dans des échantillons biologiques. Avec un algorithme supplémentaire de segmentation d’images d’apprentissage automatique, des images multi-composants spécifiques aux protéines dans les tissus sans marquage d’anticorps ont été obtenues.

Résumé

L’utilisation universelle de la microscopie à fluorescence, en particulier la microscopie à super-résolution, a considérablement fait progresser les connaissances sur la biologie moderne. À l’inverse, l’exigence d’un marquage fluorophore dans les techniques fluorescentes pose des défis importants, tels que le photoblanchiment et le marquage non uniforme des sondes fluorescentes et le traitement prolongé des échantillons. Dans ce protocole, les procédures de travail détaillées de l’imagerie vibrationnelle des tissus gonflés et de l’analyse (VISTA) sont présentées. VISTA contourne les obstacles associés aux fluorophores et réalise une imagerie volumétrique à super-résolution sans marquage dans des échantillons biologiques avec une résolution spatiale allant jusqu’à 78 nm. La procédure est établie en intégrant des cellules et des tissus dans de l’hydrogel, en élargissant isotrope l’hybride de l’échantillon d’hydrogel et en visualisant les distributions de protéines endogènes par imagerie vibrationnelle avec la microscopie à diffusion Raman stimulée. La méthode est démontrée à la fois sur des cellules et des tissus cérébraux de souris. Des images VISTA et d’immunofluorescence fortement corrélatives ont été observées, validant l’origine protéique des spécificités d’imagerie. Exploitant une telle corrélation, un algorithme de segmentation d’images basé sur l’apprentissage automatique a été formé pour réaliser une prédiction multi-composants des noyaux, des vaisseaux sanguins, des cellules neuronales et des dendrites à partir d’images de cerveau de souris sans marquage. La procédure a été adaptée pour étudier les agrégats pathologiques de polyglutamine (polyQ) dans les cellules et les plaques de bêta-amyloïde (Aβ) dans les tissus cérébraux à haut débit, justifiant son potentiel pour des échantillons cliniques à grande échelle.

Introduction

Le développement des méthodes d’imagerie optique a révolutionné la compréhension de la biologie moderne car elles fournissent des informations spatiales et temporelles sans précédent sur des cibles à différentes échelles, des protéines subcellulaires aux organes entiers¹. Parmi eux, la microscopie à fluorescence est la mieux établie, avec une large palette de colorants organiques avec des coefficients d’extinction et des rendements quantiques élevés²,^{des protéines} fluorescentes codées génétiquement 3 faciles à utiliser et des méthodes de super-résolution telles que STED, PALM et STORM pour l’imagerie de structures à l’échelle nanométrique ^4,5. De plus, les progrès récents en ingénierie des échantillons et en chimie de conservation, qui élargissent les échantillons noyés dans des hydrogels polymères gonflants ^6,7,8, permettent une résolution limitée par sous-diffraction sur les microscopes à fluorescence conventionnels. Par exemple, la microscopie à expansion typique (ExM) multiplie par quatre la résolution de l’image avec une expansion isotrope de l’échantillon quadruplée⁷.

Malgré ses avantages, la microscopie à fluorescence à super-résolution partage les limites qui proviennent du marquage au fluorophore. Premièrement, le photoblanchiment et l’inactivation des fluorophores compromettent la capacité d’évaluations répétitives et quantitatives de la fluorescence. Le photoblanchiment est un événement inévitable lorsque la lumière continue de pomper des électrons dans des états excités électroniquement⁹. Deuxièmement, le marquage des fluorophores sur les cibles souhaitées n’est pas toujours une tâche simple. Par exemple, l’immunocoloration exige un processus de préparation d’échantillons long et laborieux et entrave le débit d’imagerie¹⁰. Il pourrait également introduire des artefacts dus à un marquage inhomogène des anticorps, en particulier profondément à l’intérieur des tissus¹¹. De plus, les stratégies de marquage appropriées qui ciblent les fluorophores pour les protéines souhaitées pourraient être sous-développées. Par exemple, des dépistages approfondis ont été nécessaires pour trouver des anticorps efficaces contre les plaques Aβ¹². Les colorants organiques plus petits, tels que le rouge Congo, ont souvent une spécificité limitée, ne colorant que le noyau de la plaque Aβ. Il est donc hautement souhaitable de développer une modalité de super-résolution sans marquage qui contourne les inconvénients du marquage au fluorophore et fournit une imagerie complémentaire à haute résolution des cellules aux tissus, et même aux échantillons humains à grande échelle.

La microscopie Raman fournit un contraste sans marquage pour les structures spécifiques à des produits chimiques et cartographie la distribution de liaisons chimiques autrement invisibles en examinant les transitions vibrationnelles excitées¹³. En particulier, il a été démontré que l’imagerie par diffusion Raman stimulée (SRS) sur des échantillons sans marquage ou minuscules marqués a une vitesse et une résolution similaires à celles de la microscopie à fluorescence^14,15. Par exemple, la région saine du cerveau a été facilement différenciée de la région infiltrée par la tumeur dans les tissus humains et de souris^16,17. Les plaques Aβ ont également été clairement imagées en ciblant la vibration de la protéine CH₃ (2940 cm⁻¹) et l’amide I (1660 cm⁻¹) sur une tranche de cerveau fraîchement congelée sans aucun marquage¹⁸. La diffusion Raman offre donc un contraste robuste sans marquage qui surmonte les limites des fluorophores. La question était alors de savoir comment on pouvait atteindre une capacité de super-résolution en utilisant la diffusion Raman, qui pourrait révéler des détails structurels à l’échelle nanométrique et des implications fonctionnelles dans des échantillons biologiques.

Bien que des efforts considérables aient été déployés pour obtenir une super-résolution pour la microscopie Raman avec des instruments optiques élégants, l’amélioration de la résolution sur les échantillons biologiques a été plutôt limitée 19,20,21. Ici, sur la base des travaux récents^22,23, nous présentons un protocole qui combine une stratégie d’expansion d’échantillon avec une diffusion Raman stimulée pour une imagerie vibrationnelle sans marquage à super-résolution, appelée Vibrational Imaging of Swelled Tissues and Analysis (VISTA). Tout d’abord, les cellules et les tissus ont été intégrés dans des matrices d’hydrogel grâce à un protocole d’hybridation protéine-hydrogel optimisé. Les hybrides de tissus d’hydrogel ont ensuite été incubés dans des solutions riches en détergents pour la délipidation, suivie d’une expansion dans l’eau. Les échantillons élargis ont ensuite été imagés par un microscope SRS régulier en ciblant les vibrations CH₃ des protéines endogènes conservées. VISTA, grâce à sa fonction d’imagerie sans marquage, contourne le photoblanchiment et le marquage inhomogène résultant du marquage au fluorophore, avec un débit de traitement d’échantillons beaucoup plus élevé. Il s’agit également de la première imagerie sans marquage à moins de 100 nm (jusqu’à 78 nm) signalée. Aucune instrumentation optique supplémentaire n’est requise en plus de la configuration SRS^22,24 typique, ce qui la rend facilement applicable. Avec des images corrélatives VISTA et d’immunofluorescence, un algorithme de segmentation d’images d’apprentissage automatique établi a été formé^25,26 pour générer des images multiplex spécifiques aux protéines à partir d’images monocanaux. La méthode a ensuite été appliquée pour étudier les plaques Aβ dans les tissus cérébraux de souris, fournissant une image holistique adaptée au sous-phénotypage basée sur les vues fines du noyau de la plaque et des filaments périphériques entourés de noyaux cellulaires et de vaisseaux sanguins.

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Protocole

Toutes les procédures animales effectuées dans cette étude ont été approuvées par le California Institute of Technology Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), et les procédures du protocole étaient conformes à toutes les réglementations éthiques pertinentes.

1. Préparation de solutions mères pour la fixation et l’expansion de l’échantillon

1. Préparez 40 ml de solution de fixation en dissolvant d’abord 12 g d’acrylamide (30 % p/v) solide dans 26 ml d’eau sans nucléases. Ensuite, ajoutez 10 ml de solution mère de PFA à 16 % au mélange. Enfin, ajoutez 4 ml de solution saline tamponnée au phosphate 10x (PBS, pH 7,4). La solution préparée peut être conservée à 4 °C jusqu’à 2 semaines.
   REMARQUE : L’acrylamide est dangereux, donc l’étape de dissolution de l’acrylamide solide dans l’eau doit être effectuée dans une hotte.
2. Préparez la solution de gélification (type X) en dissolvant 70 mg d’acrylate de sodium (7 % p/v), 200 mg d’acrylamide (20 % p/v) et 50 μL de N, N'-méthylènebisacrylamide (0,1 % p/v) dans 420 μL d’eau ultrapure. Ajoutez 57 μL de PBS 10x filtré stérile (pH 7,4) à la fin et conservez cette solution à -20 °C jusqu’à 1 semaine.
   REMARQUE : Évitez l’acrylate de sodium solide qui forme des grumeaux ; Assurez-vous que l’acrylate de sodium utilisé se présente sous forme de poudres dispersives. La crosse X fabriquée sera un liquide incolore ; Si le liquide est jaune clair, obtenez du nouvel acrylate de sodium.
3. Préparez la solution initiatrice de polymérisation en dissolvant 1 g de persulfate d’ammonium (APS, 10 % p/p) dans 9 mL d’eau exempte de nucléases. De même, préparer une solution d’accélérateur de polymérisation en dissolvant 1 g de tétraméthyléthylènediamine (TEMED, 10 % p/p) dans 9 mL d’eau exempte de nucléases. Aliquote-tion des solutions résultantes et stockage à −20 °C.
4. Préparez 50 ml de tampon dénaturant en dissolvant 2,88 g de dodécylsulfate de sodium (SDS, 200 mM), 0,584 g de chlorure de sodium (200 mM) et 2,5 mL de tampon Tris-HCl 1M (50 mM, pH 8) dans de l’eau exempte de nucléases.
   REMARQUE : La concentration de SDS est proche de sa condition de saturation. Une certaine cristallisation dans le tampon est normale. Un léger réchauffement jusqu’à 37 °C permet de rendre la solution claire et prête à l’emploi.

2. Préparation d’échantillons de cellules de mammifères

1. Implanter 3,5 x 10^{cellules 4} HeLa sur une lamelle en borosilicate de 12 mm (#1.5) dans une plaque à 24 puits, puis cultiver les cellules dans 400 μL de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10 % de sérum de bovin fœtal et 1 % d’antibiotiques pénicilline-streptomycine (DMEM complet) sous une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO₂ à 37 °C.
2. Pour obtenir des cellules à différents stades mitotiques, incubez les cellules en DMEM complet jusqu’à une confluence de 60 %. Ensuite, traitez les cellules avec du DMEM sans sérum de veau fœtal pendant 20 h pour synchroniser les stades cellulaires. Après la synchronisation, changez le milieu pour que les cellules terminent le DMEM et incubez pendant 2 à 6 h supplémentaires pour cibler les différentes étapes de la mitose.
3. Lavez les cellules HeLa sur des lamelles avec du PBS stérile et incuberez-les avec une solution de fixation (4 % de PFA, 30 % d’acrylamide [AA] dans du PBS) à 37 °C pendant 7 à 8 h avant de poursuivre le traitement.
   REMARQUE : Une température de fixation plus élevée associée à une concentration élevée d’acrylamide aide à éteindre la réticulation intermoléculaire entre les protéines pendant les processus de fixation et préserverait les ultra-structures détaillées des protéines⁸.
4. Pour les cellules avec des agrégats polyQ, cultivez les cellules dans du DMEM complet jusqu’à ce qu’elles atteignent une confluence de 70 % à 90 %. Après être passé au nouveau DMEM complet, transfectez 1 μg de plasmide codant pour mHtt97Q-GFP dans les cellules à l’aide d’un agent de transfection (détails dans le tableau des matériaux). Effectuez la transfection selon le protocole du fabricant.
5. Après 24 à 48 h de transfection, retirer le milieu de culture et ajouter 800 μL de solution de fixation (4 % de PFA, 30 % d’AA) dans les lamelles contenant des cellules. Incuber les lamelles à 37 °C pendant 6 à 8 h. Lavez la lamelle avec du PBS 3x et les échantillons de cellules résultants sont prêts pour un traitement ultérieur.

3. Préparation d’échantillons de cerveau de souris

1. Achetez des souris C57BL/6J (âgées de 6 à 8 semaines, mâles et femelles, six souris) et des souris Alzheimer (âgées de 9 mois, femelles, trois souris) auprès de sources commerciales (détails dans la table des matières). Effectuer l’euthanasie par narcose au dioxyde de carbone selon le protocole standard²⁷. En bref, placez les souris dans une chambre et remplissez la chambre avec un débit de 100 % de CO₂ de l’ordre de 30 % à 70 % du volume de la chambre/min et maintenez le débit pendant au moins 1 minute après la mort clinique.
2. Après avoir confirmé l’euthanasie sans cruauté, décapitez rapidement les souris à l’aide de ciseaux. Exposez le crâne avec une grande incision à travers la peau le long de la ligne médiane. Tirez la peau vers le nez de l’animal pour exposer complètement le crâne.
3. Coupez le crâne le long de la ligne médiane avec des ciseaux fins et décollez les deux moitiés du crâne sur le côté. Utilisez une pince à épiler pour retirer le cerveau dans une boîte de Pétri sur de la glace avec PBS. Lavez le cerveau de souris frais avec du PBS glacé et transférez le cerveau dans 10 ml de tampon de fixation (4 % de PFA, 30 % d’AA).
4. Incuber le cerveau de la souris dans un tampon de fixation à 4 °C pendant 24 à 48 h, puis transférez-le à 37 °C pendant la nuit. Après l’avoir lavé avec du PBS stérile, coupez le cerveau de souris en sections de 150 μm à l’aide d’un vibratome et conservez-le dans du PBS à 4 °C.

4. Enrobage d’hydrogel, dénaturation et expansion d’échantillons de cellules et de tissus

1. Assurez-vous que les échantillons ont été incubés dans le tampon de fixation pendant la durée requise, comme indiqué ci-dessus. Décongelez les solutions mères X, initiateur de radicaux libres et accélérateur et conservez-les sur la glace pendant tout le processus.
   REMARQUE : Un temps d’incubation insuffisant pourrait entraîner une réduction du nombre de protéines retenues sur l’hybride d’hydrogel et, par conséquent, entraîner une diminution du signal.
2. Prenez la lamelle avec les cellules et placez-la sur une lame de verre à l’aide d’une pince à épiler. Prélevez les tranches de cerveau (150 m d’épaisseur) et placez-les sur une autre lame de verre à l’aide d’un pinceau en laine douce, en veillant à ce qu’elles soient plates. Débarrassez-vous de l’excès de liquide qui accompagne les échantillons.
3. Empilez deux lamelles (#1.5), en ajoutant des gouttes d’eau entre elles, des deux côtés de l’échantillon sur la lame de verre pour faire une chambre de gélification. Placez la lame de verre avec l’échantillon vers le haut sur un bloc de chaleur glacé et refroidissez-la à 4 °C pendant 1 min.
4. Ajouter 10 % (p/p) de TEMED au stock X, puis 10 % de solution APS. Agitez rapidement le vortex et, dans la minute qui suit le mélange, déposez lentement la solution obtenue dans la chambre sur les échantillons pour couvrir la surface de l’échantillon, en évitant les bulles d’air. Conservez la solution et les échantillons sur de la glace (ou un bloc de chaleur glaciale) pour éviter la formation de gel (degré élevé de polymérisation) avant de les ajouter à l’échantillon.
5. Une fois que l’échantillon est complètement immergé dans la solution, placez une lamelle plate, transparente et recouverte d’un film sur l’échantillon comme couvercle pour la chambre. Laissez la chambre sur de la glace ou un bloc de chaleur glacé pendant encore 1 min avant de l’incuber dans un incubateur humidificateur à 37 °C pendant 30 min.
6. Sortez la chambre de gélification de la lame de verre de l’incubateur à 37 °C. Un gel non transparent doit être observé après avoir retiré le couvercle. Récupérez le gel en le coupant avec une lame de rasoir ou, alternativement, placez la lame de verre dans un tampon dénaturant à température ambiante pendant 15 min. Le gel se séparera de la lame de verre.
7. Incuber le gel isolé dans un tampon de dénaturation dans des conditions de chaleur pour obtenir une dénaturation et une délipidation supplémentaires. Pour les échantillons de cellules, dénaturer à 95 °C pendant 1 h. Pour des tranches de cerveau de 150 μm d’épaisseur, dénaturer à 70 °C pendant 3 h, puis à 95 °C pendant 1 h.
   REMARQUE : Le gel peut devenir bouclé lors de la première incubation avec un tampon dénaturant à température ambiante. Il est normal et deviendra plat après une dénaturation à haute température. Lorsque l’on travaille avec des échantillons de tissus plus épais, un temps de dénaturation plus long est nécessaire.
8. Après le traitement thermique, laver l’échantillon dénaturé 3 fois avec du PBS pendant 10 min. À ce stade, le gel devrait avoir atteint environ 1,5 fois la taille d’origine. Incuber le gel lavé avec de l’eau ultra-pure dans un grand récipient (au moins 20 fois le volume du gel) pour obtenir un taux d’expansion plus élevé. Changez l’eau toutes les 1 h 3x et laissez l’échantillon dans l’obscurité pendant la nuit. Le gel obtenu est prêt à être photographié.
   REMARQUE : Le taux de dilatation dépend en grande partie des propriétés mécaniques de l’échantillon d’origine. Une expansion de 4,2 fois pour les échantillons de cellules et de 3,4 fois pour l’échantillon de tissu cérébral a été obtenue.

5. Imagerie sans marquage de la distribution des protéines endogènes dans des échantillons de cellules et de tissus élargis

1. Conservez les échantillons de gel expansé dans l’eau pendant le processus d’imagerie. Le gel est fragile après l’expansion et doit donc être manipulé avec prudence. Placez le gel expansé porteur d’échantillon sur une lame de microscope (1 mm d’épaisseur) avec une entretoise de microscope avec des ouvertures et des profondeurs appropriées, remplie d’eau. Couvrez l’entretoise avec une lamelle (#1.5) et assurez-vous qu’elle est correctement scellée pour éviter tout mouvement de l’échantillon.
2. Placez l’échantillon avec la cellule expansée ou le tissu sur la platine motorisée avec la lamelle de recouvrement face à l’objectif. Cliquez sur Oculaire dans le logiciel pour changer le chemin de la lumière en champ clair et ajustez la position z à l’aide d’un bouton manuel.
3. Ajoutez de l’huile d’immersion sur le dessus de l’échantillon et ajustez le condenseur à la bonne position pour l’éclairage Köhler tout en regardant en fond clair avec un grossissement de 25x depuis l’objectif. Entrez 791,3 nm dans la fenêtre de longueur d’onde OPO sur le panneau laser pour cibler la vibration de la protéine CH₃ à 2940 cm⁻¹.
4. Basculez la lumière du microscope du champ clair (oculaire) au mode de balayage laser en cliquant sur le bouton LSM et ouvrez l’obturateur laser SRS en appuyant sur le bouton Obturateur sur le panneau de commande laser. Appuyez sur le bouton LIVE du logiciel du microscope pour démarrer l’acquisition d’images en temps réel.
5. Trouvez la mise au point appropriée en modifiant le z tout en regardant l’image SRS avec un temps de séjour de pixel court (12,5 μs/pixel) et une résolution d’image faible (256 pixels x 256 pixels). Une fois la position z idéale trouvée, modifiez la taille du balayage et le temps de séjour au pixel près en tirant sur la barre correspondante dans le logiciel du microscope.
6. Acquérez l’image en appuyant sur le bouton LSM en utilisant la condition de super-échantillonnage (1024 pixels x 1024 pixels) avec un temps de séjour plus long (80 μs/pixel) qui correspond à la constante de temps de l’amplificateur de verrouillage. Acquérez des images volumétriques en collectant une pile z d’une taille de pas de 1 μm dans la direction z. Traitez et analysez le fichier OIR enregistré à partir du logiciel à l’aide d’ImageJ.
   REMARQUE : La configuration détaillée de la SRS a récemment été rapportée dans Mutlu et ^al.24. Ici, un laser picoseconde accordable avec un taux de répétition de 80 MHz et une bande passante de 2 ps pour la pompe (770-990 nm) et les stokes (1031,2 nm) a été acheminé dans un microscope confocal à balayage laser (détaillé dans la Table des matériaux). Optimiser le chevauchement temporel et spatial des deux faisceaux pour les signaux avec du D₂O pur. Il faut un certain effort pour trouver le bon z pour l’échantillon élargi en fond clair, car l’indice de réfraction est très homogène dans tout le gel.
7. Déterminez la résolution de VISTA en prenant une image SRS de billes de polystyrène (100 nm) à l’aide d’un objectif 25x et d’un objectif 60x. Réglez le laser de la pompe sur 784,5 nm, ce qui correspond à un décalage Raman de 3050 cm⁻¹, caractéristique des vibrations aromatiques des étirements C-H du polystyrène.
   REMARQUE : La longueur d’onde du laser de pompe utilisée ici est similaire à celle utilisée dans VISTA pour les protéines.
8. Avec l’objectif 60x, la demi-onde pleine étendue expérimentale (FWHM, qui est la largeur de la forme de la ligne à la moitié de l’amplitude) de l’image de la perle était de 276,17 nm. Modélisez la fonction de l’objet perle sous la forme d’un demi-cercle.
   REMARQUE : Lorsque la fonction gaussienne PSF a un c (σ) = 269 nm/2,35, l’image de la perle alvéolée aura un FWHM mesuré de 276,17 nm. En conséquence, la résolution du système SRS est de 269 nm × 1,22 = 328 nm selon le critère de Rayleigh. Comme VISTA a une expansion moyenne de 4,2 fois les échantillons de cellules, la résolution effective est descendue à 328 nm/4,2 = 78 nm.

6. Imagerie corrélative VISTA et fluorescente d’échantillons de tissus immunomarqués et élargis

1. Après la dénaturation, pré-incuber les échantillons inclus dans l’hydrogel (p. ex., section coronale cérébrale de 150 μm) dans 1 % (v/v) de Triton X-100 (PBST) pendant 15 min. Passer le tampon d’incubation au PBST avec anticorps primaire à une dilution de 1:100. Si plusieurs cibles protéiques sont nécessaires pour l’imagerie multiplex, diluez les anticorps primaires respectifs pour différentes cibles à des concentrations appropriées dans le même cocktail et incubez avec les échantillons simultanément.
2. Incuber les gels avec des anticorps primaires dilués à 37 °C avec une légère agitation à 80 tr/min pendant 16 à 18 h, suivi d’un lavage intensif 3 fois avec PBST pendant 1 à 2 h à 37 °C. Retournez le gel pendant l’incubation pour éviter un marquage inhomogène des anticorps ici et dans toutes les incubations ultérieures.
3. Incuber les échantillons avec des anticorps secondaires d’espèces cibles correspondantes à des dilutions de 1:100 avec du PBST à 37 °C pendant 12 à 16 h, à l’abri de la lumière. Laver les échantillons d’hydrogel étiquetés 3 fois avec du PBST pendant 1 à 2 h à 37 °C en secouant doucement.
4. Diluer le DAPI à la concentration finale de 3 μM dans le PBS. Ajoutez un volume suffisant de solution de DAPI à l’hydrogel de l’échantillon pour que le gel soit immergé dans la solution. Incuber pendant 1 à 2 h à température ambiante en secouant doucement à 80 tr/min. Lavez l’échantillon 3 fois avec du PBS.
5. Élargir les échantillons de gel immuno-marqués en les incubant avec un grand volume de H₂O double désionisé. Changez l’eau toutes les 1 h 3x et incubez les échantillons en H₂O pendant la nuit, à l’abri de la lumière. Lors de l’étiquetage, le gel doit se dilater 1,5 fois par rapport au tampon PBS.
6. Préparez l’échantillon d’imagerie comme décrit à l’étape 5.1. Placez l’échantillon d’imagerie sur le microscope confocal à balayage laser avec l’objectif à immersion dans l’eau 25x, 1,05 NA, pour l’imagerie fluorescente.
7. Sélectionnez le canal approprié avec le laser d’excitation respectif (405 nm, 488 nm, 561 nm et 640 nm) et la paire PMT en fonction des anticorps ciblés dans le menu déroulant du logiciel du microscope. Appuyez sur le bouton LIVE pour l’acquisition d’images en temps réel.
8. Ajustez la position de mise au point à l’aide d’un bouton manuel en fonction du signal de fluorescence en temps réel. Optimisez la puissance du laser, le temps de séjour des pixels et le gain PMT dans le logiciel du microscope en fonction du signal de fluorescence en temps réel pour éviter un signal faible ou une sursaturation.
   REMARQUE : Évaluez l’apparence et les caractéristiques en fonction des structures signalées des différents anticorps afin d’éliminer les réactivités croisées potentielles des anticorps et d’éviter la diaphonie entre les différents canaux de fluorescence.
9. Appuyez sur le bouton LSM pour commencer à acquérir des images SRS et fluorescentes corrélatives. Tout d’abord, collecter des images de fluorescence volumétrique sur des échantillons immuno-marqués. Une fois l’imagerie de fluorescence terminée, basculez le chemin de la lumière du microscope à l’état transparent infrarouge (IR).
10. Changez le canal de détection de la fluorescence PMT à SRS sur le logiciel du microscope. Ouvrez l’obturateur du laser SRS et effectuez une imagerie volumétrique SRS sur le champ de vision du même échantillon avec la même plage de z. La plage normale est comprise entre 100 et 200 μm et peut aller jusqu’à 700 μm.
    REMARQUE : Il y a une légère aberration chromatique qui provoque un décalage de la position z entre les images fluorescentes et les images SRS en raison de la différence de longueur d’onde dans les lasers d’excitation. Une comparaison manuelle côte à côte entre les images SRS et les images de fluorescence z-stack est nécessaire. Recherchez les caractéristiques de correspondance exactes à la fois de la SRS et du canal de fluorescence pour correspondre précisément à la position z.

7. Construction, formation et validation de l’architecture U-Net

REMARQUE : L’installation sur Linux est recommandée. Une carte graphique avec >10 Go de RAM est requise.

1. Mise en place de l’environnement
   1. Installez Anaconda ou Miniconda sur un 3-5.3.0-linux-x86_64. Clonez ou téléchargez les fichiers suivants : https://github.com/Li-En-Good/VISTA. Créez un environnement Conda pour la plate-forme à l’aide de la ligne de commande suivante:
      conda env create -f environment.yml
2. Entraînement du modèle de prédiction
   1. Associez les répertoires des images SRS correspondantes avec des images de vérité terrain dans un fichier csv. Placez les répertoires d’images SRS sous path_signal et les images de vérité terrain sous path_target colonnes.
   2. Placez le fichier csv dans le dossier data/csvs. Modifiez la configuration dans scripts/train_model_2d.sh si nécessaire. Activez l’environnement à l’aide de la ligne de commande :
      Conda Activate FNET
   3. Lancez l’entraînement du modèle à l’aide de la ligne de commande :
      ./scripts/train_model_2d.sh 0
      La formation commencera alors. Les pertes pour chaque itération seront affichées dans la ligne de commande et enregistrées avec le modèle dans le dossier save_models/.
3. Validez les images dans le jeu d’apprentissage et le jeu de test à l’aide de la ligne de commande :
   ./scripts/train_model_2d.sh 0
   Les résultats de la prédiction seront enregistrés dans le dossier results/.

8. VISTA combiné aux prédictions U-Net pour la multiplexité spécifique aux protéines dans les images sans marquage

1. Modifiez le fichier csv dans data/csvs//test.csv. Remplacez les répertoires des path_signal et des path_target par le répertoire des nouvelles images SRS.
2. Supprimez les résultats de la prédiction de l’entraînement, c’est-à-dire le dossier results/. Exécutez des prédictions à l’aide de la ligne de commande :
   ./scripts/train_model_2d.sh 0
   Les résultats de la prédiction seront enregistrés dans le dossier results//test.

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Résultats

Après avoir établi le principe de fonctionnement de la méthode d’imagerie et d’analyse, un recalage d’images a été effectué pour évaluer le rapport de dilatation et assurer l’expansion isotrope pendant le traitement de l’échantillon (Figure 1A,B). Les échantillons non traités et VISTA ont été imagés en ciblant la vibration de liaison à 2940 cm⁻¹, qui provient du CH₃ des protéines endogènes. D...

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Discussion

En résumé, nous présentons le protocole de VISTA, qui est une modalité sans marquage pour imager les structures cellulaires et subcellulaires riches en protéines des cellules et des tissus. En ciblant le CH₃ endogène à partir de protéines dans des cellules et des tissus intégrés dans de l’hydrogel, la méthode atteint une résolution d’imagerie efficace jusqu’à 78 nm dans les échantillons biologiques et résout l’extrusion mineure dans les agrégats de hunt...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 M Tris pH 8	Sigma-Aldrich	648314
16% Paraformaldehyde	Electron microscopy science	15710	diluted to 4% in PBS
25x water immersion objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	NA 1.05
5XFAD Mice	Mutant Mouse Resource and Research Centers and the Jackson Laboratory	B6SJL-Tg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286 V) 6799Vas/Mmjax	Alzheimer brain
60x water immersion objective	Olympus	UPLSAPO60XWIR	NA 1.2
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
anti-MAP2	Cell Signaling Technology	8707
anti-NeuN	Cell Signaling Technology	24307
borosilicate coverslip #1.5	Fisher Scientific	1254581
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratory (JAX)	664	Normal mice
D2O	Sigma-Aldrich	151882	for SRS calibration
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM	GIBCO	10566-016
FBS	GIBCO	A4766
glass slide 3" x 1" x 1 mm	VWR	16004-430
goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21449
goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21236
goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
goat anti-rat IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11077
Grace Bio-Labs Press-To-Seal silicone isolators	Sigma-Aldrich	GBL664108	microscope spacer
Htt-97Q-GFP Plasmid	Gift from Prof. R. Kopito and Prof. F.-U.Hartl.
Laser scanning microscope	Olympus	FV3000	laser scanning confocal microscope
lipofectamine 3000	Thermo Fisher	L3000001	transfection agent
Lycopersicon Esculentum Lectin DyLight®594 (lectin)	Vector Laboratories	DL-1177-1
Microscope spacer	Grace Bio-Labs	621502
N,N′-methylenebisacrylamide (BIS)	Sigma-Aldrich	M1533	bought as 2% solution in water
Nuclease free water	Thermo Fisher	10977-015
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15140-122
poly-strene beads	Sigma-Aldrich	43302	for resolution characterization
Sodium Acrylate	Sigma-Aldrich	408220
sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	71725
soft-wool paint brush #3	TANIS	000333
SRS Laser	A.P.E	picoEmerald	2ps pulse width
tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
Tissue culture flask 25 cm2	Corning	430639
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
tweezer	Fine Science Tool	11295-51
Vibrotome	Leica	VT1200S	the vibratome