JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Сочетая химию гидрогеля с расширением образца с безметочной химически специфической химически стимулированной микроскопией комбинационного рассеяния, протокол описывает, как достичь объемной визуализации сверхвысокого разрешения без меток в биологических образцах. С помощью дополнительного алгоритма сегментации изображений с помощью машинного обучения были получены белок-специфические многокомпонентные изображения в тканях без мечения антителами.

Аннотация

Повсеместное использование флуоресцентной микроскопии, особенно микроскопии сверхвысокого разрешения, значительно продвинуло вперед знания о современной биологии. С другой стороны, требование флуорофорного мечения в флуоресцентных методах создает значительные проблемы, такие как фотообесцвечивание и неравномерное мечение флуоресцентных зондов, а также длительная обработка образцов. В этом протоколе подробно описаны рабочие процедуры вибрационной визуализации набухшей ткани и анализа (VISTA). VISTA обходит препятствия, связанные с флуорофорами, и обеспечивает безмаркерную объемную визуализацию со сверхвысоким разрешением в биологических образцах с пространственным разрешением до 78 нм. Процедура устанавливается путем встраивания клеток и тканей в гидрогель, изотропного расширения гибридного образца гидрогеля и визуализации распределения эндогенных белков с помощью вибрационной визуализации с помощью вынужденной микроскопии комбинационного рассеяния. Метод демонстрируется как на клетках, так и на тканях мозга мыши. Были получены высококоррелятивные изображения VISTA и иммунофлуоресцентные изображения, подтверждающие белковое происхождение специфичности визуализации. Используя такую корреляцию, алгоритм сегментации изображений на основе машинного обучения был обучен для достижения многокомпонентного прогнозирования ядер, кровеносных сосудов, нейронных клеток и дендритов по изображениям мозга мышей без меток. Процедура была дополнительно адаптирована для исследования патологических агрегатов полиглутамина (polyQ) в клетках и бляшек бета-амилоида (Aβ) в тканях мозга с высокой пропускной способностью, что оправдывает ее потенциал для крупномасштабных клинических образцов.

Введение

Развитие методов оптической визуализации произвело революцию в понимании современной биологии, поскольку они предоставляют беспрецедентную пространственную и временную информацию о мишенях в различных масштабах, от субклеточных белков до целыхорганов. Среди них наиболее хорошо зарекомендовала себя флуоресцентная микроскопия с большой палитрой органических красителей с высокими коэффициентами экстинкции и квантовымивыходами2, простыми в использовании генетически кодируемыми флуоресцентными белками3 и методами сверхвысокого разрешения, такими как STED, PALM и STORM, для визуализации структур нанометрового масштаба4,5. Кроме того, последние достижения в области пробоотборной инженерии и консервационной химии, которые расширяют образцы, встроенные в набухающие полимерные гидрогели 6,7,8, позволяют использовать субдифракционное ограниченное разрешение на обычных флуоресцентных микроскопах. Например, типичная расширяющая микроскопия (ExM) эффективно повышает разрешение изображения в четыре раза за счет четырехкратного изотропного расширения образца7.

Несмотря на свои преимущества, флуоресцентная микроскопия со сверхвысоким разрешением имеет ограничения, которые возникают из-за мечения флуорофорами. Во-первых, фотообесцвечивание и инактивация флуорофоров ставят под угрозу способность к повторным и количественным оценкам флуоресценции. Фотообесцвечивание является неизбежным явлением, когда свет продолжает накачивать электроны в электронно-возбужденные состояния9. Во-вторых, маркировка флуорофоров по нужным мишеням не всегда является простой задачей. Например, иммуноокрашивание требует длительного и трудоемкого процесса подготовки образцов и затрудняет производительность визуализации10. Он также может вносить артефакты из-за неоднородного мечения антителами, особенно глубоко внутри тканей11. Более того, правильные стратегии мечения, нацеленные на флуорофоры для желаемых белков, могут быть недостаточно разработаны. Например, для выявления эффективных антител к бляшкам Aβ12 требовался обширный скрининг. Более мелкие органические красители, такие как конголезский красный, часто имеют ограниченную специфичность, окрашивая только ядро Aβ-бляшки. Таким образом, крайне желательно разработать безмаркерный метод сверхвысокого разрешения, который обходит недостатки флуорофорного мечения и обеспечивает дополнительную визуализацию с высоким разрешением от клеток к тканям и даже к крупномасштабным образцам человека.

Рамановская микроскопия обеспечивает безмаркерный контраст для структур, специфичных для химических веществ, и составляет карту распределения невидимых в противном случае химических связей, рассматривая возбужденные колебательныепереходы. В частности, было продемонстрировано, что визуализация методом вынужденного комбинационного рассеяния света (SRS) на образцах без меток или с крошечными метками имеет скорость, аналогичную флуоресцентной микроскопии14,15. Например, здоровая область мозга была легко дифференцирована от инфильтрированной опухолью области в тканях человека и мыши16,17. Бляшки Aβ также были четко визуализированы путем нацеливания на белки CH3 vibration (2940 см-1) и амид I (1660 см-1) на свежезамороженном срезе мозга без какой-либомаркировки. Таким образом, комбинационное рассеяние дает мощный контраст без меток, который преодолевает ограничения флуорофоров. Тогда вопрос заключался в том, как можно достичь сверхвысокого разрешения с помощью комбинационного рассеяния, которое могло бы выявить наноразмерные структурные детали и функциональные последствия в биологических образцах.

Несмотря на то, что были предприняты значительные усилия для достижения сверхвысокого разрешения для рамановской микроскопии с помощью элегантных оптических инструментов, повышение разрешения на биологических образцах было довольно ограниченным 19,20,21. Здесь, основываясь на последних работах22,23, мы представляем протокол, который сочетает в себе стратегию расширения выборки со стимулированным комбинационным рассеянием для вибрационной визуализации без меток со сверхвысоким разрешением, названный Vibrational Imaging of Soured Ttissue and Analysis (VISTA). Во-первых, клетки и ткани были встроены в гидрогелевые матрицы с помощью оптимизированного протокола белок-гидрогелевой гибридизации. Затем гибриды гидрогелевых тканей инкубировали в богатых моющими средствами растворах для делипидации с последующим расширением в воде. Затем расширенные образцы были визуализированы с помощью обычного микроскопа SRS путем нацеливания на колебанияCH3 из сохраненных эндогенных белков. VISTA, благодаря своей функции безметочной визуализации, позволяет избежать фотообесцвечивания и неоднородного мечения, возникающих при флуорофорном мечении, с гораздо более высокой производительностью обработки образцов. Это также первая зарегистрированная визуализация без меток с длиной волны менее 100 нм (до 78 нм). Никаких дополнительных оптических приборов, кроме типичной настройки SRS22,24, не требуется, что делает ее легко применимой. С помощью коррелятивных изображений VISTA и иммунофлуоресцентных изображений установленный алгоритм сегментации изображений с машинным обучением был обучен25,26 для создания белково-специфических мультиплексных изображений из одноканальных изображений. В дальнейшем этот метод был применен для исследования Aβ-бляшек в тканях мозга мышей, что позволило получить целостное изображение, пригодное для субфенотипирования, основанное на тонких изображениях ядра бляшки и периферических филаментов, окруженных ядрами клеток и кровеносными сосудами.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все процедуры на животных, выполненные в этом исследовании, были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Калифорнийского технологического института (IACUC), а протокольные процедуры соответствовали всем соответствующим этическим нормам.

1. Подготовка стоковых растворов к фиксации и наращиванию образца

  1. Приготовьте 40 мл фиксирующего раствора, предварительно растворив 12 г твердого акриламида (30% по массе) в 26 мл воды, не содержащей нуклеаз. Затем добавьте в смесь 10 мл 16% исходного раствора PFA. Наконец, добавьте 4 мл 10-кратного фосфатно-солевого буфера (PBS, pH 7,4). Приготовленный раствор можно хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Акриламид опасен, поэтому этап растворения твердого вещества акриламида в воде следует проводить в вытяжном шкафу.
  2. Приготовьте раствор для гелеобразования (запас X) путем растворения 70 мг акрилата натрия (7% по массе), 200 мг акриламида (20% по массе) и 50 мкл N, N'-метиленбисакриламида (0,1% по массе) в 420 мкл сверхчистой воды. Добавьте 57 мкл стерильно отфильтрованного 10x PBS (pH 7,4) в конце и храните этот раствор при температуре −20 °C до 1 недели.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте твердого вещества акрилата натрия, которое образует комки; Убедитесь, что используемый акрилат натрия находится в виде дисперсионных порошков. Полученный запас X будет бесцветной жидкостью; Если жидкость выглядит светло-желтой, приобретите новый акрилат натрия.
  3. Приготовьте раствор инициатора полимеризации, растворив 1 г персульфата аммония (АФС, 10% по массе) в 9 мл воды, не содержащей нуклеаз. Аналогичным образом приготовьте раствор ускорителя полимеризации, растворив 1 г тетраметилэтилендиамина (TEMED, 10% мас./вес) в 9 мл воды, не содержащей нуклеаз. Аликвотировать полученные растворы и хранить при температуре −20 °С.
  4. Приготовьте 50 мл денатурирующего буфера, растворив 2,88 г додецилсульфата натрия (SDS, 200 мМ), 0,584 г натрия хлорида (200 мМ) и 2,5 мл 1М Tris-HCl буфера (50 мМ, pH 8) в воде, не содержащей нуклеаз.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация SDS близка к ухудшению состояния насыщения. Некоторая кристаллизация в буфере является нормальным явлением. Небольшой подогрев его до 37 °C может сделать раствор прозрачным и готовым к использованию.

2. Подготовка образцов клеток млекопитающих

  1. Высадите 3,5 x 104 клеток HeLa на боросиликатный покровный стекло диаметром 12 мм (#1,5) в 24-луночный планшет, а затем культивируйте клетки в 400 μл модифицированной орлиной среды Dulbecco (DMEM) с 10% эмбриональной бычьей сывороткой и 1% антибиотиками пенициллин-стрептомицин (полный DMEM) во влажной атмосфере с 5%CO2 при 37 °C.
  2. Чтобы получить клетки на разных митотических стадиях, инкубируйте клетки в полном DMEM до 60% конфлюенции. Затем обрабатывайте клетки DMEM без фетальной бычьей сыворотки в течение 20 часов для синхронизации клеточных стадий. После синхронизации переключите среду для клеток, чтобы они завершили DMEM, и инкубируйте еще 2-6 часов, чтобы нацелиться на различные стадии митоза.
  3. Клетки HeLa на покровных стеклах промойте стерильным PBS и инкубируйте их с фиксирующим раствором (4% PFA, 30% акриламид [AA] в PBS) при 37 °C в течение 7-8 часов перед дальнейшей обработкой.
    Примечание: Более высокая температура фиксации в сочетании с высокой концентрацией акриламида помогает погасить межмолекулярные сшивки между белками во время процессов фиксации и, как сообщается, сохраняет детализированные ультраструктуры белков8.
  4. Для клеток с агрегатами polyQ выращивайте клетки в полном DMEM до тех пор, пока они не достигнут 70%-90% конфлюенции. После перехода на новую полную DMEM трансфектируйте 1 г плазмиды, кодирующей mHtt97Q-GFP, в клетки с помощью трансфекционного агента (подробнее в таблице материалов). Выполняйте трансфекцию в соответствии с протоколом производителя.
  5. Через 24-48 ч после трансфекции удалить питательную среду и добавить 800 мкл фиксирующего раствора (4% PFA, 30% AA) в покровные стекла с клетками. Инкубировать покровные стекла при температуре 37 °C в течение 6-8 часов. Промойте покровное стекло PBS 3x, и полученные образцы клеток готовы к дальнейшей обработке.

3. Подготовка образцов мозга мыши

  1. Приобретите мышей C57BL/6J (от 6 до 8 недель, самец и самка, шесть мышей) и мышей с болезнью Альцгеймера (9 месяцев, самка, три мыши) из коммерческих источников (подробности в Таблице материалов). Проведение эвтаназии с помощью углекислого наркоза в соответствии со стандартным протоколом27. Короче говоря, поместите мышей в камеру и заполните камеру потоком 100%CO2 в размере 30%-70% объема камеры/мин и поддерживайте поток в течение как минимум 1 минуты после клинической смерти.
  2. После подтверждения гуманной эвтаназии быстро обезглавьте мышей с помощью ножниц. Обнажите череп большим разрезом через кожу по средней линии. Потяните кожу к носу животного, чтобы полностью обнажить череп.
  3. Разрежьте череп по средней линии тонкими ножницами и снимите две половины черепа в сторону. Используйте пинцет, чтобы вычерпать мозг в чашку Петри на льду с PBS. Промойте свежий мозг мыши ледяным PBS и перенесите мозг на 10 мл фиксирующего буфера (4% PFA, 30% AA).
  4. Инкубируйте мозг мыши в фиксирующем буфере при температуре 4 °C в течение 24-48 часов, а затем перенесите его на ночь при температуре 37 °C. После промывки стерильным PBS разрежьте мозг мыши на участки размером 150 мкм с помощью вибратома и храните в PBS при температуре 4 °C.

4. Встраивание гидрогеля, денатурация и расширение образцов клеток и тканей

  1. Убедитесь, что образцы инкубировались в фиксирующем буфере в течение необходимого количества времени, как указано выше. Размораживайте исходные растворы X, свободнорадикального инициатора и ускорителя и держите их на льду в течение всего процесса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Недостаточное время инкубации может привести к уменьшению количества белков, удерживаемых в гидрогелевом гибриде, и, следовательно, вызвать снижение сигнала.
  2. Возьмите в руки покровный лист с ячейками и поместите его на предметное стекло с помощью пинцета. Выберите срезы мозга (толщиной 150 мкм) и положите их на другое предметное стекло с помощью мягкошерстяной кисти, следя за тем, чтобы они были плоскими. Избавьтесь от лишней жидкости, которая поступает вместе с образцами.
  3. Сложите два покровных стекла (#1.5), добавив капли воды между ними, с обеих сторон образца на предметное стекло, чтобы получилась камера гелеобразования. Поместите предметное стекло образцом вверх на ледяной термоблок и охладите его до 4 °C в течение 1 минуты.
  4. Добавьте 10% (w/w) TEMED к исходному раствору X, а затем 10% раствор APS. Быстро сделайте вихревой процесс и, в течение 1 минуты после перемешивания, медленно капните полученный раствор в камеру на образцы, чтобы покрыть поверхность образца, не допуская образования пузырьков воздуха. Перед добавлением в образец держите раствор и образцы на льду (или в ледяном тепловом блоке), чтобы избежать образования геля (высокой степени полимеризации).
  5. После того как образец будет полностью погружен в раствор, поместите поверх образца плоскую, прозрачную, покрытую пленкой защитную крышку в качестве крышки для камеры. Оставьте камеру на льду или в ледяном тепловом блоке еще на 1 минуту перед инкубацией в увлажняющем инкубаторе при температуре 37 °C в течение 30 минут.
  6. Выньте камеру гелеобразования на предметном стекле из инкубатора при температуре 37 °C. После снятия крышки следует наблюдать за непрозрачным гелем. Извлеките гель, разрезав лезвием бритвы, или, в качестве альтернативы, поместите предметное стекло в денатурирующий буфер при комнатной температуре на 15 минут. Гель сам отделится от предметного стекла.
  7. Инкубируйте выделенный гель в денатурирующем буфере в тепловых условиях для достижения дальнейшей денатурации и делипидации. Образцы клеток денатурировать при 95 °C в течение 1 ч. Для срезов мозга толщиной 150 мкм денатурацию следует провести при 70 °C в течение 3 ч, а затем при 95 °C в течение 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гель может стать фигурным при первой инкубации с денатурирующим буфером при комнатной температуре. Это нормальное явление и после высокотемпературной денатурации становится плоским. При работе с более толстыми образцами тканей требуется более длительное время денатурации.
  8. После термической обработки денатурированный образец 3 раза промыть PBS в течение 10 минут. К этому моменту гель должен был расшириться примерно в 1,5 раза по сравнению с первоначальным размером. Инкубируйте промытый гель со сверхчистой водой в большой емкости (не менее чем в 20 раз превышающей объем геля) для достижения более высокого коэффициента расширения. Меняйте воду каждые 1 час 3 раза и оставьте образец в темноте на ночь. Полученный гель готов к изображению.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент расширения во многом зависит от механических свойств исходного образца. Получено расширение в 4,2 раза для образцов клеток и расширение в 3,4 раза для образца ткани мозга.

5. Безмаркерная визуализация распределения эндогенных белков в расширенных образцах клеток и тканей

  1. Храните образцы расширенного геля в воде во время процесса визуализации. После расширения гель становится хрупким, поэтому с ним следует обращаться с осторожностью. Поместите расширенный гель на предметное стекло микроскопа (толщиной 1 мм) с микроскопической прокладкой с соответствующими размерами и глубиной отверстий, заполненное водой. Закройте распорку покровным стеклом (#1.5) и убедитесь, что она надежно закрыта, чтобы избежать перемещения образца.
  2. Поместите образец с расширенной клеткой или тканью на моторизованный предметный столик так, чтобы покровное стекло было обращено к объективу. Нажмите «Окуляр » в программе, чтобы изменить траекторию света на яркое поле, и отрегулируйте положение по оси Z с помощью ручного ручки.
  3. Добавьте погружное масло в верхнюю часть образца и отрегулируйте конденсор в правильное положение для освещения по Кёлеру, наблюдая за ним в светлом поле с 25-кратным увеличением от объектива. Ввод 791,3 нм в окно длины волны ОПО на лазерной панели для нацеливания на вибрацию белкаCH3 на частоте 2940 см−1.
  4. Переключите свет микроскопа с яркого поля (окуляра) в режим лазерного сканирования, нажав кнопку LSM , и откройте лазерный затвор SRS, нажав кнопку Shutter на панели управления лазером. Нажмите кнопку LIVE в программном обеспечении микроскопа, чтобы начать получение изображений в режиме реального времени.
  5. Найдите правильный фокус, изменив z при просмотре изображения SRS при коротком времени задержки пикселей (12,5 μс/пиксель) и низком разрешении изображения (256 x 256 пикселей). Как только идеальное Z-положение будет найдено, измените размер сканирования и время задержки пикселей, потянув за соответствующую полосу в программном обеспечении микроскопа.
  6. Получите изображение, нажав кнопку LSM , используя условие супердискретизации (1024 пикселя x 1024 пикселя) с более длительным временем задержки пикселей (80 μс/пиксель), которое соответствует постоянной времени синхронного усилителя. Получение объемных изображений путем сбора z-стека с шагом 1 мкм в направлении z. Обрабатывайте и анализируйте сохраненный файл OIR из программного обеспечения с помощью ImageJ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подробная настройка SRS недавно была опубликована в Mutlu et al.24. Здесь перестраиваемый пикосекундный лазер с частотой следования 80 МГц и полосой пропускания 2 пс для накачки (770-990 нм) и Стокса (1031,2 нм) был направлен в лазерный сканирующий конфокальный микроскоп (подробно см. таблицу материалов). Оптимизируйте временное и пространственное перекрытие двух лучей для сигналов с чистым D2O. Требуется некоторое усилие, чтобы найти правильное значение z для расширенного образца в светлом поле, потому что показатель преломления очень однороден по всему гелю.
  7. Определите разрешение VISTA, сделав SRS-изображение гранул полистирола (100 нм) с использованием объектива 25x и объектива 60x. Установите накачку лазера на 784,5 нм, что соответствует рамановскому сдвигу в 3050 см−1, характерному для ароматических растяжек C-H колебаний полистирола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используемая здесь длина волны лазера накачки аналогична той, которая используется в VISTA для белков.
  8. С объективом 60x экспериментальный полноволновой полумаксимум (FWHM, которая представляет собой ширину формы линии на половине амплитуды) изображения шарика составил 276,17 нм. Смоделируйте функцию объекта-бусины в виде полукруга.
    Примечание: Когда гауссова функция PSF имеет c (σ) = 269 нм/2,35, изображение извилистого шва будет иметь измеренную FWHM 276,17 нм. В результате разрешение системы SRS составляет 269 нм × 1,22 = 328 нм по критерию Рэлея. Поскольку VISTA имеет в среднем 4,2-кратное расширение образцов клеток, эффективное разрешение снижается до 328 нм/4,2 = 78 нм.

6. Корреляционная VISTA и флуоресцентная визуализация иммуномеченных и расширенных образцов тканей

  1. После денатурации предварительно инкубируйте внедренные в гидрогель образцы (например, корональный срез мозга 150 мкм) в 1% (v/v) Triton X-100 (PBST) в течение 15 минут. Переключите инкубационный буфер на PBST с первичным антителом в соотношении 1:100. Если для мультиплексной визуализации требуется несколько белковых мишеней, разбавьте соответствующие первичные антитела для разных мишеней до нужных концентраций в одном и том же коктейле и инкубируйте с образцами одновременно.
  2. Инкубируйте гели с разбавленными первичными антителами при 37 °C с легким встряхиванием при 80 об/мин в течение 16-18 ч, с последующим обширным 3-кратным промыванием PBST в течение 1-2 ч при 37 °C. Переворачивайте гель во время инкубации, чтобы предотвратить мечение неоднородных антител здесь и во всех последующих инкубациях.
  3. Образцы инкубируют со вторичными антителами соответствующих видовых мишеней в разведении 1:100 с ПБСТ при 37 °С в течение 12-16 ч, защищенных от света. Промыть меченые гидрогелевые образцы 3 раза PBST в течение 1-2 часов при 37 °C с легким встряхиванием.
  4. Разбавьте DAPI до 3 мкМ конечной концентрации в PBS. Добавьте к образцу гидрогель достаточный объем раствора DAPI так, чтобы гель был погружен в раствор. Выдерживать в течение 1-2 ч при комнатной температуре с легким встряхиванием при 80 об/мин. Промойте образец 3 раза с PBS.
  5. Расширьте количество образцов геля, меченных иммуноликой, путем инкубации с большим объемом дважды деионизированного H2O. Меняйте воду каждые 1 ч 3 раза и инкубируйте образцы в H2O в течение ночи, защищенной от света. Во время мечения гель должен расширяться в 1,5 раза по сравнению с PBS-буфером.
  6. Подготовьте образец изображения, как описано в шаге 5.1. Поместите образец изображения на лазерный сканирующий конфокальный микроскоп с объективом погружения в воду 25x (1,05 NA) для флуоресцентной визуализации.
  7. Выберите подходящий канал с соответствующим возбуждающим лазером (405 нм, 488 нм, 561 нм и 640 нм) и парой ФЭУ в соответствии с целевыми антителами в выпадающем меню программного обеспечения микроскопа. Нажмите кнопку LIVE для получения изображения в режиме реального времени.
  8. Отрегулируйте положение фокусировки с помощью ручного регулятора на основе сигнала флуоресценции в реальном времени. Оптимизируйте мощность лазера, время задержки пикселей и усиление ФЭУ в программном обеспечении микроскопа в соответствии с сигналом флуоресценции в реальном времени, чтобы избежать тусклого сигнала или перенасыщения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените внешний вид и особенности на основе сообщенных структур различных антител, чтобы устранить потенциальную перекрестную реактивность антител и избежать перекрестных помех между различными флуоресцентными каналами.
  9. Нажмите кнопку LSM , чтобы начать получение коррелятивных SRS и флуоресцентных изображений. Во-первых, соберите объемные флуоресцентные изображения на образцах, меченных иммунитетом. После завершения флуоресцентной визуализации переключите световой путь микроскопа в инфракрасное (ИК) прозрачное состояние.
  10. Измените канал обнаружения с флуоресцентной ФЭУ на SRS в программном обеспечении микроскопа. Откройте затвор для лазера SRS и выполните объемную визуализацию SRS в поле зрения того же образца с тем же диапазоном z. Нормальный диапазон составляет от 100 до 200 мкм и может доходить до 700 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Существует небольшая хроматическая аберрация, которая вызывает смещение z-положения между флуоресцентными изображениями и изображениями SRS из-за разницы длин волн в лазерах возбуждения. Необходимо ручное параллельное сравнение между изображениями SRS и флуоресцентным z-стеком. Ищите точные совпадающие характеристики как от SRS, так и от флуоресцентного канала, чтобы точно совпасть с z-положением.

7. Построение, обучение и валидация архитектуры U-Net

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется установка на Linux. Требуется видеокарта с оперативной памятью объемом >10 ГБ.

  1. Настройка среды
    1. Установите Anaconda или Miniconda на 3-5.3.0-linux-x86_64. Клонируйте или скачайте следующие файлы: https://github.com/Li-En-Good/VISTA. Создайте среду Conda для платформы с помощью следующей командной строки:
      conda env create -f environment.yml
  2. Обучение модели прогнозирования
    1. Сопряжение каталогов соответствующих изображений SRS с наземными изображениями в файле csv. Разместите каталоги изображений SRS в разделе path_signal и изображения наземных данных в path_target столбцах.
    2. Поместите файл csv в папку data/csvs. При необходимости измените конфигурацию в scripts/train_model_2d.sh. Активируйте окружение с помощью командной строки:
      conda activate fnet
    3. Инициируем обучение модели с помощью командной строки:
      ./scripts/train_model_2d.sh <имя файла csv> 0
      После этого начнется обучение. Потери для каждой итерации будут отображаться в командной строке и сохраняться вместе с моделью в папке save_models/<имя файла для файла csv>.
  3. Проверьте изображения в обучающем наборе и тестовом наборе с помощью командной строки:
    ./scripts/train_model_2d.sh <имя файла csv> 0
    Результаты прогноза будут сохранены в папке results/<имя файла csv>.

8. VISTA в сочетании с предсказаниями U-Net для белок-специфической мультиплексии в безметочных изображениях

  1. Измените файл csv в data/csvs/<имя файла файла csv>/test.csv. Замените каталоги path_signal и path_target каталогом новых изображений SRS.
  2. Удалите результаты прогноза из обучения, которые являются папкой results/<имя файла csv>. Запустите прогнозы с помощью командной строки:
    ./scripts/train_model_2d.sh <имя файла csv> 0
    Результаты прогноза будут сохранены в папке results/<имя файла csv>/test.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

После установления принципа работы метода визуализации и анализа была проведена регистрация изображений для оценки коэффициента расширения и обеспечения изотропного расширения во время обработки образца (рис. 1A, B). Как необработанные, так и...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Таким образом, мы представляем протокол для VISTA, который представляет собой безмаркерный метод визуализации богатых белками клеточных и субклеточных структур клеток и тканей. Нацеливаясь на эндогенныйCH3 из белков в клетках и тканях, встроенных в гидрогель, мето...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Выражаем благодарность Калифорнийскому технологическому центру биологической визуализации за поддержку программного обеспечения. L.W. выражает признательность за поддержку Национальным институтам здравоохранения (NIH Director's New Innovator Award, DP2 GM140919-01), Amgen (Amgen Early Innovation Award) и стартовым фондам Калифорнийского технологического института.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.0 M Tris pH 8Sigma-Aldrich648314
16% ParaformaldehydeElectron microscopy science15710diluted to 4% in PBS
25x water immersion objectiveOlympusXLPLN25XWMP2NA 1.05
5XFAD MiceMutant Mouse Resource and Research Centers and the Jackson LaboratoryB6SJL-Tg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286 V) 6799Vas/MmjaxAlzheimer brain
60x water immersion objectiveOlympusUPLSAPO60XWIRNA 1.2
AcrylamideSigma-AldrichA9099
ammonium persulfateSigma-AldrichA3678
anti-MAP2Cell Signaling Technology8707
anti-NeuNCell Signaling Technology24307
borosilicate coverslip #1.5Fisher Scientific1254581
C57BL/6J MiceJackson Laboratory (JAX)664Normal mice
D2OSigma-Aldrich151882for SRS calibration
DAPIThermo FisherD1306
DMEMGIBCO10566-016
FBSGIBCOA4766
glass slide 3" x 1" x 1 mmVWR16004-430
goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21449
goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21236
goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11034
goat anti-rat IgG, Alexa Fluor 568InvitrogenA-11077
Grace Bio-Labs Press-To-Seal silicone isolatorsSigma-AldrichGBL664108microscope spacer
Htt-97Q-GFP PlasmidGift from Prof. R. Kopito and Prof. F.-U.Hartl.
Laser scanning microscopeOlympusFV3000laser scanning confocal microscope
lipofectamine 3000Thermo FisherL3000001transfection agent
Lycopersicon Esculentum Lectin DyLight®594 (lectin)Vector LaboratoriesDL-1177-1
Microscope spacerGrace Bio-Labs621502
N,N′-methylenebisacrylamide (BIS)Sigma-AldrichM1533bought as 2% solution in water
Nuclease free waterThermo Fisher10977-015
Penicillin-StreptomycinGIBCO15140-122
poly-strene beadsSigma-Aldrich43302for resolution characterization
Sodium AcrylateSigma-Aldrich408220
sodium dodecyl sulfateSigma-Aldrich71725
soft-wool paint brush #3TANIS000333
SRS LaserA.P.EpicoEmerald2ps pulse width
tetramethylethylenediamineSigma-AldrichT9281
Tissue culture flask 25 cm2Corning430639
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween-20Sigma-AldrichP9416
tweezerFine Science Tool11295-51
VibrotomeLeicaVT1200Sthe vibratome

Ссылки

  1. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: The optical imaging frontier in biology. Nature Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
  2. Lavis, L. D., Bright Raines, R. T. ideas for chemical biology. ACS Chemical Biology. 3 (3), 142-155 (2008).
  3. Tsien, R. Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angewandte Chemie (International Edition in English). 48 (31), 5612-5626 (2009).
  4. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  5. Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. Fluorescence nanoscopy in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (11), 685-701 (2017).
  6. Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: Principles and uses in biological research. Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).
  7. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  8. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
  9. Demchenko, A. P. Photobleaching of organic fluorophores: Quantitative characterization, mechanisms, protection. Methods and Applications in Fluorescence. 8 (2), 022001(2020).
  10. Murray, E., et al. scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
  11. Kim, S. -Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), 6274-6283 (2015).
  12. Liebmann, T., et al. Three-dimensional study of Alzheimer's disease hallmarks using the IDISCO clearing method. Cell Report. 16 (4), 1138-1152 (2016).
  13. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: Beyond fluorescence microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 62 (1), 507-530 (2011).
  14. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  15. Cheng, J. -X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), 1054-1063 (2015).
  16. Ji, M., et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  17. Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (14), 6608-6617 (2019).
  18. Ji, M., et al. Label-free imaging of amyloid plaques in Alzheimer's disease with stimulated Raman scattering microscopy. Science Advances. 4 (11), 39(2018).
  19. Silva, W. R., Graefe, C. T., Frontiera, R. R. Toward label-free super-resolution microscopy. ACS Photonics. 3 (1), 79-86 (2016).
  20. Gong, L., Zheng, W., Ma, Y., Huang, Z. Higher-order coherent anti-stokes Raman scattering microscopy realizes label-free super-resolution vibrational imaging. Nature Photonics. 14 (2), 115-122 (2020).
  21. Watanabe, K., et al. Structured line illumination Raman microscopy. Nature Communication. 6 (1), 10095(2015).
  22. Qian, C., et al. Super-resolution label-free volumetric vibrational imaging. Nature Communications. 12 (1), 3648(2021).
  23. Lin, L. -E., Miao, K., Qian, C., Wei, L. High spatial-resolution imaging of label-free in vivo protein aggregates by VISTA. Analyst. 146 (13), 4135-4145 (2021).
  24. Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid storage dynamics in Caenorhabditis elegans using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (171), e61870(2021).
  25. Ounkomol, C., Seshamani, S., Maleckar, M. M., Collman, F., Johnson, G. R. Label-free prediction of three-dimensional fluorescence images from transmitted-light microscopy. Nature Methods. 15 (11), 917-920 (2018).
  26. Falk, T., et al. U-Net: Deep learning for cell counting, detection, and morphometry. Nature Methods. 16 (1), 67-70 (2019).
  27. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  28. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  29. Mlodzianoski, M. J., et al. Active PSF shaping and adaptive optics enable volumetric localization microscopy through brain sections. Nature Methods. 15 (8), 583-586 (2018).
  30. Querol-Vilaseca, M., et al. Nanoscale structure of amyloid-β plaques in Alzheimer's disease. Scientific Reports. 9 (1), 5181(2019).
  31. Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: Potential factors in amyloid plaque formation. Journal of Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).
  32. Bartels, T., De Schepper, S., Hong, S. Microglia modulate neurodegeneration in Alzheimer's and Parkinson's diseases. Science. 370, 66-69 (2020).
  33. Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
  34. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
  35. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  36. Zhuge, M., et al. Ultrasensitive vibrational imaging of retinoids by visible preresonance stimulated Raman scattering microscopy. Advanced Science. 8 (9), 2003136(2021).
  37. Miao, K., Wei, L. Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling. ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).
  38. Klimas, A., et al. Nanoscale imaging of biomolecules using molecule anchorable gel-enabled nanoscale in-situ fluorescence microscopy. Research Square. , (2021).
  39. Shi, L., et al. Super-resolution vibrational imaging using expansion stimulated Raman scattering microscopy. Advanced Science. , (2022).
  40. M'Saad, O., et al. All-optical visualization of specific molecules in the ultrastructural context of brain tissue. bioRxiv. , (2022).
  41. Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

VISTA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены