JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Protokol, numune genişletme hidrojel kimyasını etiketsiz kimyasala özgü uyarılmış Raman saçılma mikroskobu ile birleştirerek, biyolojik numunelerde etiketsiz süper çözünürlüklü hacimsel görüntülemenin nasıl elde edileceğini açıklar. Ek bir makine öğrenmesi görüntü segmentasyon algoritması ile, antikor etiketlemesi olmayan dokularda proteine özgü çok bileşenli görüntüler elde edildi.

Özet

Floresan mikroskobunun evrensel kullanımı, özellikle süper çözünürlüklü mikroskopi, modern biyoloji hakkında büyük ölçüde gelişmiş bilgiye sahiptir. Tersine, floresan tekniklerinde florofor etiketleme gerekliliği, foto ağartma ve floresan probların tek tip olmayan etiketlenmesi ve uzun süreli numune işleme gibi önemli zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bu protokolde, şişmiş dokunun titreşimsel görüntülenmesi ve analizi (VISTA) ile ilgili detaylı çalışma prosedürleri sunulmaktadır. VISTA, floroforlarla ilişkili engelleri aşar ve biyolojik numunelerde 78 nm'ye kadar uzaysal çözünürlükle etiketsiz süper çözünürlüklü hacimsel görüntüleme sağlar. Prosedür, hücrelerin ve dokuların hidrojel içine gömülmesi, hidrojel numune hibritinin izotropik olarak genişletilmesi ve uyarılmış Raman saçılma mikroskobu ile titreşimsel görüntüleme ile endojen protein dağılımlarının görüntülenmesiyle oluşturulur. Yöntem hem hücreler hem de fare beyin dokuları üzerinde gösterilmiştir. Görüntüleme özgüllüklerinin protein kökenini doğrulayan yüksek korelasyonlu VISTA ve immünofloresan görüntüler gözlendi. Bu tür bir korelasyondan yararlanarak, etiketsiz fare beyni görüntülerinden çekirdeklerin, kan damarlarının, nöronal hücrelerin ve dendritlerin çok bileşenli tahminini elde etmek için makine öğrenimi tabanlı bir görüntü segmentasyon algoritması eğitildi. Prosedür ayrıca, hücrelerdeki patolojik poli-glutamin (poliQ) agregatlarını ve yüksek verime sahip beyin dokularındaki amiloid-beta (Aβ) plaklarını araştırmak için uyarlandı ve bu da büyük ölçekli klinik örnekler için potansiyelini haklı çıkardı.

Giriş

Optik görüntüleme yöntemlerinin gelişimi, modern biyoloji anlayışında devrim yaratmıştır, çünkü hücre altı proteinlerden tüm organlara kadar farklı ölçeklerdeki hedeflerin benzeri görülmemiş uzamsal ve zamansal bilgilerini sağlarlar1. Bunlar arasında, floresan mikroskobu, yüksek sönme katsayılarına ve kuantum verimlerine2 sahip geniş bir organik boya paleti, kullanımı kolay genetik kodlanmış floresan proteinleri3 ve nanometre ölçekli yapıları görüntülemek için STED, PALM ve STORM gibi süper çözünürlüklü yöntemler ile en iyi bilinen olanıdır 4,5. Ek olarak, şişirilebilir polimer hidrojeller 6,7,8 içine gömülü numuneleri genişleten numune mühendisliği ve koruma kimyasındaki son gelişmeler, geleneksel floresan mikroskoplarda alt kırınım sınırlı çözünürlüğü mümkün kılar. Örneğin, tipik genleşme mikroskobu (ExM), dört kat izotropik numune genişletme7 ile görüntü çözünürlüğünü dört kat artırır.

Avantajlarına rağmen, süper çözünürlüklü floresan mikroskobu, florofor etiketlemesinden kaynaklanan sınırlamaları paylaşır. İlk olarak, foto-ağartma ve floroforların inaktivasyonu, tekrarlayan ve kantitatif floresan değerlendirmeleri için kapasiteyi tehlikeye atar. Foto ağartma, ışığın elektronları elektronik olarak uyarılmış durumlarapompalamaya devam ettiği kaçınılmaz bir olaydır 9. İkincisi, floroforları istenen hedeflere etiketlemek her zaman basit bir iş değildir. Örneğin, immün boyama, uzun ve zahmetli bir numune hazırlama süreci gerektirir ve görüntüleme verimini engeller10. Ayrıca, özellikle derin iç dokular olmak üzere, homojen olmayan antikor etiketlemesi nedeniyle artefaktlar da ortaya çıkarabilir11. Ayrıca, istenen proteinler için floroforları hedefleyen uygun etiketleme stratejileri az gelişmiş olabilir. Örneğin, Aβ plakları12 için etkili antikorlar bulmak için kapsamlı taramalar gerekliydi. Kongo kırmızısı gibi daha küçük organik boyalar genellikle sınırlı özgüllüğe sahiptir, sadece Aβ plağının çekirdeğini boyar. Bu nedenle, florofor etiketlemenin dezavantajlarını ortadan kaldıran ve hücrelerden dokulara ve hatta büyük ölçekli insan örneklerine kadar tamamlayıcı yüksek çözünürlüklü görüntüleme sağlayan etiketsiz bir süper çözünürlük modalitesinin geliştirilmesi son derece arzu edilir.

Raman mikroskobu, kimyasala özgü yapılar için etiketsiz kontrast sağlar ve uyarılmış titreşim geçişlerine bakarak aksi takdirde görünmez olan kimyasal bağların dağılımını haritalandırır13. Özellikle, etiketsiz veya küçük etiketli numuneler üzerinde uyarılmış Raman saçılımı (SRS) görüntülemenin, floresan mikroskobuna benzer hız ve çözünürlüğe sahip olduğu gösterilmiştir14,15. Örneğin, sağlıklı beyin bölgesi, insan ve fare dokularında tümör infiltrasyonu olan bölgeden kolayca ayırt edilmiştir16,17. Aβ plakları ayrıca, herhangi bir etiketleme yapılmadan taze donmuş bir beyin dilimi üzerinde proteinCH3 titreşimi (2940 cm-1) ve amid I (1660 cm-1) hedeflenerek net bir şekilde görüntülendi18. Bu nedenle Raman saçılması, floroforların sınırlamalarının üstesinden gelen sağlam, etiketsiz kontrast sunar. Daha sonra soru, biyolojik örneklerde nano ölçekli yapısal detayları ve işlevsel çıkarımları ortaya çıkarabilecek Raman saçılımı kullanılarak süper çözünürlük kapasitesinin nasıl elde edilebileceği haline geldi.

Zarif optik enstrümantasyonlarla Raman mikroskobu için süper çözünürlük elde etmek için kapsamlı çabalar sarf edilmiş olsa da, biyolojik numuneler üzerindeki çözünürlük artışı oldukça sınırlı olmuştur 19,20,21. Burada, son çalışmalara22,23 dayanarak, Şişmiş Dokuların Titreşimsel Görüntülemesi ve Analizi (VISTA) olarak adlandırılan, süper çözünürlüklü etiketsiz titreşimli görüntüleme için bir örnek genişletme stratejisini uyarılmış Raman saçılımı ile birleştiren bir protokol sunuyoruz. İlk olarak, hücreler ve dokular, optimize edilmiş bir protein-hidrojel hibridizasyon protokolü yoluyla hidrojel matrislerine gömüldü. Hidrojel doku hibritleri daha sonra delipidasyon için deterjan açısından zengin çözeltilerde inkübe edildi, ardından suda genleşme yapıldı. Genişletilmiş numuneler daha sonra, tutulan endojen proteinlerden CH3 titreşimlerini hedefleyerek düzenli bir SRS mikroskobu ile görüntülendi. VISTA, etiketsiz görüntüleme özelliği sayesinde, florofor etiketlemeden kaynaklanan foto ağartma ve homojen olmayan etiketlemeyi atlayarak, çok daha yüksek numune işleme verimi sağlar. Bu aynı zamanda bildirilen ilk 100 nm altı (78 nm'ye kadar) etiketsiz görüntülemedir. Tipik SRS kurulumu22,24'ün yanı sıra ek optik enstrümantasyon gerekmez, bu da onu kolayca uygulanabilir hale getirir. Korelasyonlu VISTA ve immünofloresan görüntülerle, tek kanallı görüntülerden proteine özgü multipleks görüntüler oluşturmak için yerleşik bir makine öğrenimi görüntü segmentasyon algoritması25,26 eğitildi. Yöntem, fare beyin dokularındaki Aβ plaklarını araştırmak için daha da uygulandı ve hücre çekirdeği ve kan damarları ile çevrili plak çekirdeği ve periferik filamentlerin ince görünümlerine dayalı olarak alt fenotipleme için uygun bütünsel bir görüntü sağladı.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu çalışmada gerçekleştirilen tüm hayvan prosedürleri, California Institute of Technology Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır ve protokol prosedürleri ilgili tüm etik düzenlemelere uygundur.

1. Fiksasyon ve numune genişletme için stok çözeltilerinin hazırlanması

  1. Önce 12 g akrilamid (% 30 w / v) katıyı 26 mL nükleaz içermeyen suda çözerek 40 mL fiksasyon çözeltisi hazırlayın. Daha sonra karışıma 10 mL %16 PFA stok çözeltisi ekleyin. Son olarak, 4 mL 10x fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.4) ekleyin. Hazırlanan çözelti 4 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.
    NOT: Akrilamid tehlikelidir, bu nedenle akrilamid katısının suda çözülmesi adımı bir davlumbazda yapılmalıdır.
  2. 70 mg sodyum akrilat (%7 a/h), 200 mg akrilamid (%20 a/h) ve 50 μL N, N'-metilenbisakrilamid (%0.1 a/h) 420 μL ultra saf suda çözerek jelleşme çözeltisi (stok X) hazırlayın. Sonunda 57 μL steril filtrelenmiş 10x PBS (pH 7.4) ekleyin ve bu solüsyonu -20 °C'de 1 haftaya kadar saklayın.
    NOT: Topaklar oluşturan sodyum akrilat katıdan kaçının; Kullanılan sodyum akrilatın dağıtıcı tozlar şeklinde olduğundan emin olun. Yapılan stok X renksiz bir sıvı olacaktır; Sıvı açık sarı görünüyorsa, yeni sodyum akrilat elde edin.
  3. 1 g amonyum persülfatı (APS, %10 a/a) 9 mL nükleaz içermeyen suda çözerek polimerizasyon başlatıcı çözeltisini hazırlayın. Benzer şekilde, 1 g tetrametiletilendiamin (TEMED, %10 a/a) 9 mL nükleaz içermeyen suda çözerek polimerizasyon hızlandırıcı çözelti hazırlayın. Elde edilen çözeltileri ayırın ve -20 °C'de saklayın.
  4. 2.88 g sodyum dodesil sülfat (SDS, 200 mM), 0.584 g sodyum klorür (200 mM) ve 2.5 mL 1M Tris-HCl tamponunu (50 mM, pH 8) nükleaz içermeyen suda çözerek 50 mL denatüre edici tampon hazırlayın.
    NOT: SDS konsantrasyonu doyma durumuna yakındır. Tamponda bir miktar kristalleşme normaldir. 37 °C'ye kadar hafifçe ısıtmak, çözeltiyi berrak ve kullanıma hazır hale getirebilir.

2. Memeli hücre örneklerinin hazırlanması

  1. 3.5 x 104 HeLa hücrelerini 24 oyuklu bir plakada 12 mm'lik bir borosilikat lamel (# 1.5) üzerine tohumlayın ve daha sonra hücreleri 400 μL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamında (DMEM) %10 fetal sığır serumu ve %1 penisilin-streptomisin antibiyotik (tam DMEM) ile 37 ° C'de% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosfer altında kültürleyin.
  2. Farklı mitotik aşamalarda hücreler elde etmek için, hücreleri %60 birleşmeye kadar tam DMEM'de inkübe edin. Daha sonra, hücre aşamalarını senkronize etmek için hücreleri 20 saat boyunca fetal sığır serumu olmadan DMEM ile tedavi edin. Senkronizasyondan sonra, hücrelerin DMEM'i tamamlaması için ortamı değiştirin ve mitozun çeşitli aşamalarını hedeflemek için 2-6 saat daha inkübe edin.
  3. HeLa hücrelerini lameller üzerinde steril PBS ile yıkayın ve daha sonraki işlemlerden önce 37 ° C'de 7-8 saat boyunca fiksasyon solüsyonu (PBS'de% 4 PFA% 30 akrilamid [AA]) ile inkübe edin.
    NOT: Yüksek konsantrasyonda akrilamid ile birlikte daha yüksek fiksasyon sıcaklığı, fiksasyon işlemleri sırasında proteinler arasındaki moleküller arası çapraz bağın söndürülmesine yardımcı olur ve proteinlerin ayrıntılı ultra yapılarını koruduğu bildirilir8.
  4. PolyQ agregatlarına sahip hücreler için, hücreleri %70-90 birleşmeye ulaşana kadar tam DMEM'de büyütün. Yeni tam DMEM'e geçtikten sonra, mHtt97Q-GFP'yi kodlayan 1 μg plazmiti transfeksiyon ajanı kullanarak hücrelere aktarın (ayrıntılar Malzeme Tablosunda). Üreticinin protokolüne göre transfeksiyon gerçekleştirin.
  5. 24-48 saat transfeksiyondan sonra, kültür ortamını çıkarın ve hücreli lamellere 800 μL fiksasyon solüsyonu (% 4 PFA,% 30 AA) ekleyin. Lamelleri 37 °C'de 6-8 saat inkübe edin. Lameli PBS 3x ile yıkayın ve elde edilen hücre numuneleri daha sonraki işlemler için hazırdır.

3. Fare beyin örneklerinin hazırlanması

  1. Ticari kaynaklardan C57BL/6J fareleri (6 ila 8 haftalık, erkek ve dişi, altı fare) ve Alzheimer fareleri (9 aylık, dişi, üç fare) satın alın (ayrıntılar Malzeme Tablosunda). Standart protokol27'ye göre karbondioksit narkozu yoluyla ötenazi yapın. Kısacası, fareleri bir odaya yerleştirin ve odayı, oda / dakika hacminin% 30 -% 70'i sırasına göre% 100 CO2 akışıyla doldurun ve klinik ölümden sonra akışı en az 1 dakika koruyun.
  2. İnsancıl ötenaziyi onayladıktan sonra, bir makas kullanarak farelerin başını hızla kesin. Kafatasını, orta hattan aşağı doğru deriden büyük bir kesi ile ortaya çıkarın. Kafatasını tamamen ortaya çıkarmak için cildi hayvanın burnuna doğru çekin.
  3. Kafatasını ince bir makasla orta hat boyunca kesin ve kafatasının iki yarısını yana doğru soyun. PBS ile beyni buz üzerinde bir Petri kabına çıkarmak için cımbız kullanın. Taze fare beynini buz gibi soğuk PBS ile yıkayın ve beyni 10 mL fiksasyon tamponuna (%4 PFA, %30 AA) aktarın.
  4. Fare beynini fiksasyon tamponunda 4 ° C'de 24-48 saat inkübe edin ve ardından gece boyunca 37 ° C'ye aktarın. Steril PBS ile yıkadıktan sonra, fare beynini bir vibratom kullanarak 150 μm'lik bölümler halinde kesin ve 4 °C'de PBS'de saklayın.

4. Hücre ve doku örneklerinin hidrojel gömülmesi, denatürasyonu ve genişletilmesi

  1. Numunelerin yukarıda belirtildiği gibi gereken süre boyunca sabitleme tamponunda inkübe edildiğinden emin olun. Stok X, serbest radikal başlatıcı ve hızlandırıcı stok çözeltilerini çözün ve tüm süreç boyunca buz üzerinde tutun.
    NOT: Yetersiz inkübasyon süresi, hidrojel hibrid üzerinde tutulan protein sayısının azalmasına ve bu nedenle sinyalde bir azalmaya neden olabilir.
  2. Lameli hücrelerle birlikte alın ve cımbız kullanarak bir cam slayt üzerine yerleştirin. Beyin dilimlerini (150 μm kalınlığında) toplayın ve düz olduklarından emin olarak yumuşak yün bir boya fırçası kullanarak başka bir cam kaydırağın üzerine yerleştirin. Numunelerle birlikte gelen fazla sıvıdan kurtulun.
  3. İki lamel (#1.5), aralarına su damlaları ekleyerek, bir jelleşme odası yapmak için numunenin her iki tarafına cam slayt üzerinde istifleyin. Cam slaytı, numune yukarı bakacak şekilde buz gibi soğuk bir ısı bloğunun üzerine yerleştirin ve 4 dakika boyunca 1 °C'ye soğutun.
  4. Stok X'e %10 (a/a) TEMED ve ardından %10 APS çözeltisi ekleyin. Hızlı bir şekilde girdap yapın ve karıştırdıktan sonra 1 dakika içinde, elde edilen çözeltiyi, hava kabarcıklarını önleyerek numunenin yüzeyini kaplamak için numunelerin üzerine yavaşça hazneye bırakın. Numuneye eklemeden önce jel oluşumunu (yüksek derecede polimerizasyon) önlemek için çözeltiyi ve numuneleri buz (veya buz gibi soğuk bir ısı bloğu) üzerinde tutun.
  5. Numune çözeltiye tamamen daldırıldıktan sonra, numune için bir kapak olarak numunenin üzerine düz, şeffaf, film kaplı bir lamel yerleştirin. Nemlendirme inkübatörünü 37 °C'de 30 dakika inkübe etmeden önce hazneyi 1 dakika daha buz veya buz gibi soğuk bir ısı bloğu üzerinde bırakın.
  6. 37 °C inkübatörden cam slayt üzerindeki jelleşme odasını çıkarın. Kapak çıkarıldıktan sonra şeffaf olmayan bir jel gözlenmelidir. Jiletle keserek jeli geri alın veya alternatif olarak cam slaytı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca denatüre edici tampona koyun. Jel kendini cam slayttan ayıracaktır.
  7. Daha fazla denatürasyon ve delipidasyon elde etmek için izole edilmiş jeli ısı koşulları altında denatüre edici tamponda inkübe edin. Hücre örnekleri için 95 °C'de 1 saat denatüre edin. 150 μm kalınlığındaki beyin dilimleri için 70 °C'de 3 saat, ardından 95 °C'de 1 saat denatüre edin.
    NOT: Jel, oda sıcaklığında denatüre edici tampon ile ilk kez inkübe edildiğinde kıvırcık hale gelebilir. Bu normaldir ve yüksek sıcaklıkta denatürasyondan sonra düz hale gelecektir. Daha kalın doku örnekleriyle çalışırken, daha uzun bir denatürasyon süresine ihtiyaç vardır.
  8. Isıl işlemden sonra denatüre edilmiş numuneyi 3x PBS ile 10 dakika yıkayın. Bu noktada, jel orijinal boyutun yaklaşık 1.5 katına kadar genişlemiş olmalıdır. Daha yüksek bir genleşme oranı elde etmek için yıkanmış jeli büyük bir kapta (jel hacminin en az 20 katı) ultra saf su ile inkübe edin. Suyu her 1 saatte bir 3 kez değiştirin ve numuneyi gece boyunca karanlıkta bırakın. Elde edilen jel görüntülenmeye hazırdır.
    NOT: Genleşme oranı büyük ölçüde orijinal numunenin mekanik özelliklerine bağlıdır. Hücre örnekleri için 4.2 kat genişleme ve beyin dokusu örneği için 3.4 kat genişleme elde edildi.

5. Genişlemiş hücre ve doku örneklerinde endojen protein dağılımının etiketsiz görüntülenmesi

  1. Görüntüleme işlemi sırasında genişletilmiş jel örneklerini suda tutun. Jel genleşmeden sonra kırılgandır, bu nedenle dikkatli kullanılmalıdır. Genişletilmiş numune taşıyan jeli, suyla doldurulmuş, uygun açıklık boyutlarına ve derinliklerine sahip bir mikroskop ara parçası ile bir mikroskop lamına (1 mm kalınlığında) yerleştirin. Ara parçayı bir lamel (#1.5) ile örtün ve numune hareketini önlemek için düzgün şekilde kapatıldığından emin olun.
  2. Numuneyi, genişletilmiş hücre veya doku ile birlikte, lamel objektife bakacak şekilde motorlu sahneye yerleştirin. Işık yolunu parlak alana değiştirmek ve manuel bir düğme kullanarak z konumunu ayarlamak için yazılımda Oküler'e tıklayın.
  3. Numunenin üstüne daldırma yağı ekleyin ve objektiften 25x büyütme ile parlak alan altında izlerken kondansatörü Köhler aydınlatması için doğru konuma ayarlayın. 2940 cm-1'de protein CH3 titreşimini hedeflemek için lazer panelindeki OPO dalga boyu penceresine 791,3 nm girin.
  4. LSM düğmesine tıklayarak mikroskobun ışığını parlak alandan (göz merceği) lazer tarama moduna geçirin ve lazer kontrol panelindeki Deklanşör düğmesine basarak SRS lazer deklanşörünü açın. Gerçek zamanlı görüntü alımını başlatmak için mikroskop yazılımındaki CANLI düğmesine basın.
  5. Kısa piksel bekleme süresi (12,5 μs/piksel) ve düşük görüntü çözünürlüğü (256 piksel x 256 piksel) altında SRS görüntüsüne bakarken z'yi değiştirerek doğru odağı bulun. İdeal z konumu bulunduğunda, mikroskop yazılımındaki ilgili çubuğu çekerek tarama boyutunu ve piksel bekleme süresini değiştirin.
  6. Kilitli amplifikatörün zaman sabitiyle eşleşen daha uzun bir piksel bekleme süresine (1024 μs/piksel) sahip süper örnekleme koşulunu (1024 piksel x 1024 piksel) kullanarak LSM düğmesine basarak görüntüyü elde edin. Z yönünde 1 μm'lik bir adım boyutuna sahip bir z-yığını toplayarak hacimsel görüntüler elde edin. Kaydedilen OIR dosyasını ImageJ kullanarak yazılımdan işleyin ve analiz edin.
    NOT: Detaylı SRS kurulumu yakın zamanda Mutlu ve ark.24'te bildirilmiştir. Burada, pompa (770-990 nm) ve stokes (1031.2 nm) için 80 MHz tekrarlama oranına ve 2 ps bant genişliğine sahip ayarlanabilir bir pikosaniye lazer, bir lazer taramalı konfokal mikroskoba yönlendirildi ( Malzeme Tablosunda ayrıntılı olarak açıklanmıştır). Saf D2O ile sinyaller için iki ışının zamansal ve uzamsal örtüşmesini optimize edin. Parlak alan altında genleşmiş numune için doğru z'yi bulmak biraz çaba gerektirir çünkü kırılma indisi jel boyunca çok homojendir.
  7. Hem 25x objektif hem de 60x objektif kullanarak polistiren boncukların (100 nm) SRS görüntüsünü alarak VISTA'nın çözünürlüğünü belirleyin. Pompa lazerini, aromatik C-H'nin karakteristiği olan 3050 cm-1'lik Raman kaymasına karşılık gelen 784,5 nm'ye ayarlayın, polistirenin titreşimlerini gerer.
    NOT: Burada kullanılan pompa lazer dalga boyu, proteinler için VISTA'da kullanılana benzer.
  8. 60x objektif ile, boncuk görüntüsünün deneysel tam dalga yarı maksimumu (genliğin yarısındaki çizgi şeklinin genişliği olan FWHM) 276.17 nm idi. Boncuk nesnesinin işlevini yarım daire olarak modelleyin.
    NOT: PSF Gauss fonksiyonu c (σ) = 269 nm/2.35 olduğunda, kıvrımlı boncuk görüntüsünün ölçülen FWHM'si 276.17 nm olacaktır. Sonuç olarak, SRS sisteminin çözünürlüğü Rayleigh Kriteri ile 269 nm × 1.22 = 328 nm'dir. VISTA, hücre örneklerinde ortalama 4.2 kat genişlemeye sahip olduğundan, etkin çözünürlük 328 nm/4.2 = 78 nm'ye düşmektedir.

6. İmmüno-etiketli ve genişletilmiş doku örneklerinin korelasyon VISTA ve floresan görüntülemesi

  1. Denatürasyondan sonra, hidrojel gömülü numuneleri (örn., 150 μm beyin koronal bölümü) 15 dakika boyunca% 1 (h / h) Triton X-100 (PBST) içinde ön inkübe edin. İnkübasyon tamponunu 1:100 seyreltmede birincil antikor ile PBST'ye geçirin. Multipleks görüntüleme için birden fazla protein hedefine ihtiyaç duyulursa, farklı hedefler için ilgili birincil antikorları aynı kokteylde uygun konsantrasyonlara seyreltin ve örneklerle aynı anda inkübe edin.
  2. Jelleri seyreltilmiş birincil antikorlarla 37 ° C'de 80 rpm'de 16-18 saat boyunca hafifçe çalkalayın, ardından 37 ° C'de 1-2 saat boyunca PBST ile 3x kapsamlı yıkama yapın. Burada ve sonraki tüm inkübasyonlarda homojen olmayan antikor etiketlemesini önlemek için inkübasyon sırasında jeli ters çevirin.
  3. Numuneleri, ışıktan korunarak 37 ° C'de 12-16 saat boyunca PBST ile 1:100 seyreltmede karşılık gelen tür hedeflerinin ikincil antikorları ile inkübe edin. Etiketli hidrojel numunelerini 3x PBST ile 37 °C'de 1-2 saat hafifçe çalkalayarak yıkayın.
  4. DAPI'yi PBS'de 3 μM nihai konsantrasyona seyreltin. Jelin çözeltiye daldırılması için numune hidrojeline yeterli miktarda DAPI çözeltisi ekleyin. 80 rpm'de hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında 1-2 saat inkübe edin. Numuneyi 3x PBS ile yıkayın.
  5. İmmüno-etiketli jel örneklerini büyük miktarda çift deiyonize H2O ile inkübe ederek genişletin. Suyu her 1 saat 3 kez değiştirin ve örnekleri gece boyunca ışıktan koruyarak H2O'da inkübe edin. Etiketleme sırasında jel, PBS tamponuna kıyasla 1,5 kat genleşmelidir.
  6. Görüntüleme örneğini adım 5.1'de açıklandığı gibi hazırlayın. Görüntüleme örneğini, floresan görüntüleme için 25x, 1.05 NA, suya daldırma objektifi ile lazer taramalı konfokal mikroskobu yerleştirin.
  7. Mikroskop yazılımındaki açılır menüde hedeflenen antikorlara göre ilgili uyarma lazeri (405 nm, 488 nm, 561 nm ve 640 nm) ve PMT çifti ile uygun kanalı seçin. Gerçek zamanlı görüntü alımı için CANLI düğmesine basın.
  8. Gerçek zamanlı floresan sinyaline dayalı olarak manuel bir düğme ile odak konumunu ayarlayın. Loş bir sinyali veya aşırı doygunluğu önlemek için mikroskop yazılımındaki lazer gücünü, piksel bekleme süresini ve PMT kazancını gerçek zamanlı floresan sinyaline göre optimize edin.
    NOT: Potansiyel antikor çapraz reaktivitelerini ortadan kaldırmak ve farklı floresan kanalları arasındaki karışmayı önlemek için farklı antikorların bildirilen yapılarına dayalı olarak görünümü ve özellikleri değerlendirin.
  9. Bağıntılı SRS ve flüoresan görüntüleri almaya başlamak için LSM düğmesine basın. İlk olarak, immün etiketli numuneler üzerinde hacimsel floresan görüntüleri toplayın. Floresan görüntüleme bittiğinde, mikroskop ışık yolunu kızılötesi (IR) şeffaf duruma getirin.
  10. Mikroskop yazılımında algılama kanalını floresan PMT'den SRS'ye değiştirin. SRS lazer için deklanşörü açın ve aynı z aralığına sahip aynı numunenin görüş alanında SRS hacimsel görüntüleme gerçekleştirin. Normal aralık 100-200 μm arasındadır ve 700 μm'ye kadar çıkabilir.
    NOT: Uyarma lazerlerindeki dalga boyu farkı nedeniyle floresan görüntüler ile SRS görüntüleri arasında z-konumunda bir kaymaya neden olan hafif renk sapması vardır. SRS ve floresan z-yığını görüntüleri arasında manuel yan yana karşılaştırma gereklidir. Z konumunu tam olarak eşleştirmek için hem SRS'den hem de floresan kanalından tam eşleşen özellikleri arayın.

7. U-Net mimarisinin oluşturulması, eğitimi ve doğrulanması

NOT: Linux'ta kurulum önerilir. >10 GB RAM'e sahip bir grafik kartı gereklidir.

  1. Ortamın kurulması
    1. Anaconda veya Miniconda'yı bir 3-5.3.0-linux-x86_64 yükleyin. Aşağıdaki dosyaları klonlayın veya indirin: https://github.com/Li-En-Good/VISTA. Aşağıdaki komut satırını kullanarak platform için bir Conda ortamı oluşturun:
      conda env create -f environment.yml
  2. Tahmin modelini eğitme
    1. Karşılık gelen SRS görüntülerinin dizinlerini bir csv dosyasındaki temel doğruluk görüntüleriyle eşleştirin. SRS görüntülerinin dizinlerini path_signal altına yerleştirin ve gerçek görüntüleri path_target sütunların altına yerleştirin.
    2. Csv dosyasını data/csvs klasörüne koyun. Gerekirse betiklerde/train_model_2d.sh yapılandırmada değiştirin. Komut satırını kullanarak ortamı etkinleştirin:
      Conda FNET'i Etkinleştir
    3. Komut satırını kullanarak model eğitimini başlatın:
      ./scripts/train_model_2d.sh 0
      Daha sonra eğitim başlayacaktır. Her yineleme için kayıplar komut satırında gösterilir ve modelle birlikte csv dosyası için save_models/ klasörüne kaydedilir.
  3. Komut satırını kullanarak eğitim kümesindeki ve test kümesindeki görüntüleri doğrulayın:
    ./scripts/train_model_2d.sh 0
    Tahmin sonuçları, csv dosyasının results/ klasörüne kaydedilir.

8. Etiketsiz görüntülerde proteine özgü çoklayıcılık için U-Net tahminleriyle birleştirilmiş VISTA

  1. csv dosyasını csv dosyasının data/csvs//test.csv içinde değiştirin. Hem path_signal hem de path_target dizinlerini yeni SRS görüntülerinin diziniyle değiştirin.
  2. csv dosyasının results/ olan tahmin sonuçlarını eğitimden kaldırın. Komut satırını kullanarak tahminleri çalıştırın:
    ./scripts/train_model_2d.sh 0
    Tahmin sonuçları, csv dosyasının/test dosyasının results//test kaydedilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Görüntüleme ve analiz yönteminin çalışma prensibi oluşturulduktan sonra, numune işleme sırasında genleşme oranının değerlendirilmesi ve izotropik genleşmenin sağlanması için görüntü kaydı yapılmıştır (Şekil 1A,B). Hem işlenmemiş hem de VISTA numuneleri, endojen proteinlerin CH3'ünden kaynaklanan 2940 cm-1'deki bağ titreşimi hedeflenirken görüntülendi. İşlem görmemiş örneklerde, ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Özetle, hücre ve dokuların protein açısından zengin hücresel ve hücre altı yapılarını görüntülemek için etiketsiz bir modalite olan VISTA protokolünü sunuyoruz. Hidrojel gömülü hücre ve dokulardaki proteinlerden endojen CH3'ü hedef alan yöntem, biyolojik numunelerde 78 nm'ye kadar etkili bir görüntüleme çözünürlüğü elde eder ve Aβ plaklarındaki Huntingtin agregatları ve fibrillerindeki küçük ekstrüzyonu çözer. Bu teknik, etiketsiz gö...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.

Teşekkürler

Yazılım desteği için Caltech Biyolojik Görüntüleme Tesisine teşekkür ederiz. L.W., Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH Director's New Innovator Award, DP2 GM140919-01), Amgen (Amgen Erken İnovasyon Ödülü) ve California Institute of Technology'nin başlangıç fonlarının desteğini kabul eder.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.0 M Tris pH 8Sigma-Aldrich648314
16% ParaformaldehydeElectron microscopy science15710diluted to 4% in PBS
25x water immersion objectiveOlympusXLPLN25XWMP2NA 1.05
5XFAD MiceMutant Mouse Resource and Research Centers and the Jackson LaboratoryB6SJL-Tg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286 V) 6799Vas/MmjaxAlzheimer brain
60x water immersion objectiveOlympusUPLSAPO60XWIRNA 1.2
AcrylamideSigma-AldrichA9099
ammonium persulfateSigma-AldrichA3678
anti-MAP2Cell Signaling Technology8707
anti-NeuNCell Signaling Technology24307
borosilicate coverslip #1.5Fisher Scientific1254581
C57BL/6J MiceJackson Laboratory (JAX)664Normal mice
D2OSigma-Aldrich151882for SRS calibration
DAPIThermo FisherD1306
DMEMGIBCO10566-016
FBSGIBCOA4766
glass slide 3" x 1" x 1 mmVWR16004-430
goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21449
goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21236
goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488InvitrogenA-11034
goat anti-rat IgG, Alexa Fluor 568InvitrogenA-11077
Grace Bio-Labs Press-To-Seal silicone isolatorsSigma-AldrichGBL664108microscope spacer
Htt-97Q-GFP PlasmidGift from Prof. R. Kopito and Prof. F.-U.Hartl.
Laser scanning microscopeOlympusFV3000laser scanning confocal microscope
lipofectamine 3000Thermo FisherL3000001transfection agent
Lycopersicon Esculentum Lectin DyLight®594 (lectin)Vector LaboratoriesDL-1177-1
Microscope spacerGrace Bio-Labs621502
N,N′-methylenebisacrylamide (BIS)Sigma-AldrichM1533bought as 2% solution in water
Nuclease free waterThermo Fisher10977-015
Penicillin-StreptomycinGIBCO15140-122
poly-strene beadsSigma-Aldrich43302for resolution characterization
Sodium AcrylateSigma-Aldrich408220
sodium dodecyl sulfateSigma-Aldrich71725
soft-wool paint brush #3TANIS000333
SRS LaserA.P.EpicoEmerald2ps pulse width
tetramethylethylenediamineSigma-AldrichT9281
Tissue culture flask 25 cm2Corning430639
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween-20Sigma-AldrichP9416
tweezerFine Science Tool11295-51
VibrotomeLeicaVT1200Sthe vibratome

Referanslar

  1. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: The optical imaging frontier in biology. Nature Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
  2. Lavis, L. D., Bright Raines, R. T. ideas for chemical biology. ACS Chemical Biology. 3 (3), 142-155 (2008).
  3. Tsien, R. Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angewandte Chemie (International Edition in English). 48 (31), 5612-5626 (2009).
  4. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. Super-resolution fluorescence microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  5. Sahl, S. J., Hell, S. W., Jakobs, S. Fluorescence nanoscopy in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (11), 685-701 (2017).
  6. Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. Expansion microscopy: Principles and uses in biological research. Nature Methods. 16 (1), 33-41 (2019).
  7. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  8. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nature Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
  9. Demchenko, A. P. Photobleaching of organic fluorophores: Quantitative characterization, mechanisms, protection. Methods and Applications in Fluorescence. 8 (2), 022001(2020).
  10. Murray, E., et al. scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
  11. Kim, S. -Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), 6274-6283 (2015).
  12. Liebmann, T., et al. Three-dimensional study of Alzheimer's disease hallmarks using the IDISCO clearing method. Cell Report. 16 (4), 1138-1152 (2016).
  13. Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: Beyond fluorescence microscopy. Annual Review of Physical Chemistry. 62 (1), 507-530 (2011).
  14. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  15. Cheng, J. -X., Xie, X. S. Vibrational spectroscopic imaging of living systems: An emerging platform for biology and medicine. Science. 350 (6264), 1054-1063 (2015).
  16. Ji, M., et al. Rapid, label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  17. Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (14), 6608-6617 (2019).
  18. Ji, M., et al. Label-free imaging of amyloid plaques in Alzheimer's disease with stimulated Raman scattering microscopy. Science Advances. 4 (11), 39(2018).
  19. Silva, W. R., Graefe, C. T., Frontiera, R. R. Toward label-free super-resolution microscopy. ACS Photonics. 3 (1), 79-86 (2016).
  20. Gong, L., Zheng, W., Ma, Y., Huang, Z. Higher-order coherent anti-stokes Raman scattering microscopy realizes label-free super-resolution vibrational imaging. Nature Photonics. 14 (2), 115-122 (2020).
  21. Watanabe, K., et al. Structured line illumination Raman microscopy. Nature Communication. 6 (1), 10095(2015).
  22. Qian, C., et al. Super-resolution label-free volumetric vibrational imaging. Nature Communications. 12 (1), 3648(2021).
  23. Lin, L. -E., Miao, K., Qian, C., Wei, L. High spatial-resolution imaging of label-free in vivo protein aggregates by VISTA. Analyst. 146 (13), 4135-4145 (2021).
  24. Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid storage dynamics in Caenorhabditis elegans using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (171), e61870(2021).
  25. Ounkomol, C., Seshamani, S., Maleckar, M. M., Collman, F., Johnson, G. R. Label-free prediction of three-dimensional fluorescence images from transmitted-light microscopy. Nature Methods. 15 (11), 917-920 (2018).
  26. Falk, T., et al. U-Net: Deep learning for cell counting, detection, and morphometry. Nature Methods. 16 (1), 67-70 (2019).
  27. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  28. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
  29. Mlodzianoski, M. J., et al. Active PSF shaping and adaptive optics enable volumetric localization microscopy through brain sections. Nature Methods. 15 (8), 583-586 (2018).
  30. Querol-Vilaseca, M., et al. Nanoscale structure of amyloid-β plaques in Alzheimer's disease. Scientific Reports. 9 (1), 5181(2019).
  31. Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: Potential factors in amyloid plaque formation. Journal of Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).
  32. Bartels, T., De Schepper, S., Hong, S. Microglia modulate neurodegeneration in Alzheimer's and Parkinson's diseases. Science. 370, 66-69 (2020).
  33. Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
  34. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34 (9), 987-992 (2016).
  35. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159 (4), 896-910 (2014).
  36. Zhuge, M., et al. Ultrasensitive vibrational imaging of retinoids by visible preresonance stimulated Raman scattering microscopy. Advanced Science. 8 (9), 2003136(2021).
  37. Miao, K., Wei, L. Live-cell imaging and quantification of PolyQ aggregates by stimulated Raman scattering of selective deuterium labeling. ACS Central Science. 6 (4), 478-486 (2020).
  38. Klimas, A., et al. Nanoscale imaging of biomolecules using molecule anchorable gel-enabled nanoscale in-situ fluorescence microscopy. Research Square. , (2021).
  39. Shi, L., et al. Super-resolution vibrational imaging using expansion stimulated Raman scattering microscopy. Advanced Science. , (2022).
  40. M'Saad, O., et al. All-optical visualization of specific molecules in the ultrastructural context of brain tissue. bioRxiv. , (2022).
  41. Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Etiketsiz S per z n rl kl G r nt lemeTitre imsel G r nt lemei mi DokuFloresan MikroskobuS per z n rl kl MikroskopiVISTAHidrojel G mmeUyar lm Raman Sa lma MikroskobuEndojen Protein Da l mlarG r nt SegmentasyonuMakine renimiN ronal H crelerAmiloid beta PlaklarPoli glutamin AgregatlarHacimsel G r nt leme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır