Imágenes de superresolución sin etiquetas habilitadas por imágenes vibracionales de tejido hinchado y análisis

Resumen

Al combinar la química de hidrogel de expansión de muestras con microscopía de dispersión Raman estimulada química específica sin marcadores, el protocolo describe cómo lograr imágenes volumétricas de superresolución sin etiquetas en muestras biológicas. Con un algoritmo adicional de segmentación de imágenes de aprendizaje automático, se obtuvieron imágenes multicomponentes específicas de proteínas en tejidos sin marcaje de anticuerpos.

Resumen

La utilización universal de la microscopía de fluorescencia, especialmente la microscopía de superresolución, ha hecho avanzar enormemente el conocimiento sobre la biología moderna. Por el contrario, el requisito de etiquetado de fluoróforos en técnicas fluorescentes plantea desafíos significativos, como el fotoblanqueo y el etiquetado no uniforme de las sondas fluorescentes y el procesamiento prolongado de las muestras. En este protocolo, se presentan los procedimientos de trabajo detallados de la imagen vibracional de tejido inflamado y el análisis (VISTA). VISTA evita los obstáculos asociados con los fluoróforos y logra imágenes volumétricas de superresolución sin etiquetas en muestras biológicas con una resolución espacial de hasta 78 nm. El procedimiento se establece mediante la inclusión de células y tejidos en hidrogel, la expansión isotrópica del híbrido de muestra de hidrogel y la visualización de las distribuciones de proteínas endógenas mediante imágenes vibracionales con microscopía de dispersión Raman estimulada. El método se demuestra tanto en células como en tejidos cerebrales de ratón. Se observaron imágenes de VISTA e inmunofluorescencia altamente correlativas, lo que validó el origen proteico de las especificidades de las imágenes. Aprovechando dicha correlación, se entrenó un algoritmo de segmentación de imágenes basado en el aprendizaje automático para lograr la predicción de múltiples componentes de núcleos, vasos sanguíneos, células neuronales y dendritas a partir de imágenes de cerebro de ratón sin etiquetas. El procedimiento se adaptó aún más para investigar los agregados patológicos de poliglutamina (polyQ) en las células y las placas de beta amiloide (Aβ) en los tejidos cerebrales con alto rendimiento, lo que justifica su potencial para muestras clínicas a gran escala.

Introducción

El desarrollo de los métodos de imagen óptica ha revolucionado la comprensión de la biología moderna porque proporcionan información espacial y temporal sin precedentes de objetivos a diferentes escalas, desde proteínas subcelulares hasta órganos^completos. Entre ellos, la microscopía de fluorescencia es la más consolidada, con una amplia paleta de colorantes orgánicos con altos coeficientes de extinción y rendimientos cuánticos², proteínas fluorescentes codificadas genéticamente fáciles de usar³ y métodos de superresolución como STED, Palm y STORM para obtener imágenes de estructuras a escala nanométrica ^4,5. Además, los avances recientes en ingeniería de muestras y química de conservación, que amplían las muestras incrustadas en hidrogeles poliméricos hinchables ^6,7,8, permiten una resolución limitada por subdifracción en microscopios de fluorescencia convencionales. Por ejemplo, la microscopía de expansión típica (ExM) mejora efectivamente la resolución de la imagen cuatro veces con una expansión de muestra isotrópica cuádruple⁷.

A pesar de sus ventajas, la microscopía de fluorescencia de superresolución comparte limitaciones que se originan en el marcaje con fluoróforos. En primer lugar, el fotoblanqueo y la inactivación de los fluoróforos comprometen la capacidad de realizar evaluaciones de fluorescencia repetitivas y cuantitativas. El fotoblanqueo es un evento inevitable cuando la luz sigue bombeando electrones a estados excitados electrónicamente^. En segundo lugar, etiquetar los fluoróforos con los objetivos deseados no siempre es una tarea sencilla. Por ejemplo, la inmunotinción exige un proceso de preparación de muestras largo y laborioso y dificulta el rendimiento de las imágenes¹⁰. También podría introducir artefactos debido al marcaje no homogéneo de anticuerpos, especialmente en el interior de los tejidos¹¹. Además, es posible que no se desarrollen lo suficiente las estrategias de etiquetado adecuadas que se dirijan a los fluoróforos para las proteínas deseadas. Por ejemplo, se requirieron exámenes exhaustivos para encontrar anticuerpos efectivos para las placas Aβ¹². Los tintes orgánicos más pequeños, como el rojo Congo, a menudo tienen una especificidad limitada, solo tiñen el núcleo de la placa Aβ. Por lo tanto, es muy deseable desarrollar una modalidad de superresolución sin etiquetas que eluda los inconvenientes del etiquetado con fluoróforos y proporcione imágenes complementarias de alta resolución desde las células hasta los tejidos, e incluso hasta las muestras humanas a gran escala.

La microscopía Raman proporciona contraste sin etiquetas para estructuras químicas específicas y traza la distribución de enlaces químicos que de otro modo serían invisibles mediante la observación de las transiciones vibratorias excitadas¹³. En particular, se ha demostrado que la obtención de imágenes de dispersión Raman estimulada (SRS) en muestras sin marcaje o con marcado diminuto tiene una velocidad y resolución similares a las de la microscopía de fluorescencia^14,15. Por ejemplo, la región del cerebro sano se ha diferenciado fácilmente de la región infiltrada por tumores en tejidos humanos y de ratón^16,17. Las placas de Aβ también se obtuvieron imágenes claras dirigiéndose a la proteína CH₃ vibración (2940 ^cm-1) y amida I (1660 ^cm-1) en un trozo de cerebro fresco congelado sin ningún etiquetado¹⁸. Por lo tanto, la dispersión Raman ofrece un contraste robusto sin etiquetas que supera las limitaciones de los fluoróforos. La pregunta entonces se convirtió en cómo se puede lograr la capacidad de superresolución utilizando la dispersión Raman, que podría revelar detalles estructurales a nanoescala e implicaciones funcionales en muestras biológicas.

A pesar de que se han realizado grandes esfuerzos para lograr una superresolución para la microscopía Raman con instrumentaciones ópticas elegantes, la mejora de la resolución en muestras biológicas ha sido bastante limitada 19,20,21. Aquí, basándonos en los trabajos recientes^22,23, presentamos un protocolo que combina una estrategia de expansión de muestras con dispersión Raman estimulada para la obtención de imágenes vibratorias sin etiquetas de superresolución, denominada Vibrational Imaging of Swelled Tissues and Analysis (VISTA). En primer lugar, las células y los tejidos se incrustaron en matrices de hidrogel mediante un protocolo optimizado de hibridación proteína-hidrogel. A continuación, los híbridos de tejido de hidrogel se incubaron en soluciones ricas en detergente para la deslipidación, seguida de una expansión en agua. A continuación, se obtuvieron imágenes de las muestras expandidas mediante un microscopio SRS regular dirigiéndose a las vibraciones de CH₃ de las proteínas endógenas retenidas. VISTA, gracias a su función de procesamiento de imágenes sin etiquetas, evita el fotoblanqueo y el etiquetado no homogéneo que surge del etiquetado de fluoróforos, con un rendimiento de procesamiento de muestras mucho mayor. Esta es también la primera imagen sin etiquetas por debajo de 100 nm (hasta 78 nm) reportada. No se requiere instrumentación óptica adicional además de la configuración típica de SRS^22,24, por lo que es fácilmente aplicable. Con imágenes correlativas de VISTA e inmunofluorescencia, se entrenó un algoritmo de segmentación de imágenes de aprendizaje automático^{establecido 25,26} para generar imágenes multiplexadas específicas de proteínas a partir de imágenes de un solo canal. El método se aplicó además para investigar las placas Aβ en los tejidos cerebrales de los ratones, proporcionando una imagen holística adecuada para el subfenotipado basada en las vistas finas del núcleo de la placa y los filamentos periféricos rodeados de núcleos celulares y vasos sanguíneos.

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Protocolo

Todos los procedimientos con animales realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Instituto de Tecnología de California, y los procedimientos del protocolo cumplieron con todas las regulaciones éticas relevantes.

1. Preparación de soluciones madre para la fijación y expansión de la muestra

1. Prepare 40 mL de solución de fijación disolviendo primero 12 g de acrilamida (30% p/v) sólido en 26 mL de agua libre de nucleasas. A continuación, añada 10 ml de solución madre de PFA al 16% a la mezcla. Por último, añadir 4 mL de solución salina tamponada con fosfato 10x (PBS, pH 7,4). La solución preparada puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
   NOTA: La acrilamida es peligrosa, por lo que el paso de disolver el sólido de acrilamida en agua debe realizarse en una campana extractora.
2. Prepare la solución de gelificación (stock X) disolviendo 70 mg de acrilato de sodio (7% p/v), 200 mg de acrilamida (20% p/v) y 50 μL de N, N'-metilenebisacrilamida (0,1% p/v) en 420 μL de agua ultrapura. Añada 57 μL de PBS 10x filtrado estérilmente (pH 7,4) al final y almacene esta solución a -20 °C durante un máximo de 1 semana.
   NOTA: Evite el acrilato de sodio sólido que forma grumos; Asegúrese de que el acrilato de sodio utilizado esté en forma de polvos dispersivos. La culata X fabricada será un líquido incoloro; Si el líquido se ve amarillo claro, obtenga acrilato de sodio nuevo.
3. Prepare la solución iniciadora de polimerización disolviendo 1 g de persulfato de amonio (APS, 10% p/p) en 9 ml de agua sin nucleasas. Del mismo modo, prepare la solución del acelerador de polimerización disolviendo 1 g de tetrametiletilendiamina (TEMED, 10% p/p) en 9 mL de agua libre de nucleasa. Alicuone las soluciones resultantes y almacene a -20 °C.
4. Prepare 50 mL de tampón desnaturalizante disolviendo 2,88 g de dodecil sulfato de sodio (SDS, 200 mM), 0,584 g de cloruro de sodio (200 mM) y 2,5 mL de tampón Tris-HCl 1M (50 mM, pH 8) en agua sin nucleasas.
   NOTA: La concentración de SDS está cerca de su condición de saturación. Es normal cierta cristalización en el tampón. Un ligero calentamiento hasta 37 °C puede hacer que la solución sea clara y esté lista para usar.

2. Preparación de muestras de células de mamíferos

1. Siembre 3.5 x 10⁴ células HeLa en un cubreobjetos de borosilicato de 12 mm (#1.5) en una placa de 24 pocillos y luego cultive las células en 400 μL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con 10% de suero fetal bovino y 1% de antibióticos penicilina-estreptomicina (DMEM completo) bajo una atmósfera humidificada con 5% de CO₂ a 37 °C.
2. Para obtener células en diferentes etapas mitóticas, incube las células en DMEM completo hasta un 60% de confluencia. A continuación, tratar las células con DMEM sin suero fetal bovino durante 20 h para sincronizar los estadios celulares. Después de la sincronización, cambie el medio para que las células completen DMEM e incuben durante otras 2-6 horas para dirigirse a las diversas etapas de la mitosis.
3. Lave las células HeLa en cubreobjetos con PBS estéril e incube con solución de fijación (4% PFA, 30% acrilamida [AA] en PBS) a 37 °C durante 7-8 h antes de continuar con el procesamiento.
   NOTA: Una temperatura de fijación más alta junto con una alta concentración de acrilamida ayuda a apagar la reticulación intermolecular entre las proteínas durante los procesos de fijación y se ha informado que preserva las ultraestructuras detalladas de las proteínas⁸.
4. En el caso de las células con agregados de polyQ, haga crecer las células en DMEM completo hasta que alcancen una confluencia del 70 % al 90 %. Después de cambiar a un nuevo DMEM completo, transfecte 1 μg de plásmido que codifica mHtt97Q-GFP en las células utilizando un agente de transfección (detalles en la Tabla de materiales). Realice la transfección de acuerdo con el protocolo del fabricante.
5. Después de 24-48 h de transfección, retirar el medio de cultivo y añadir 800 μL de solución de fijación (4% PFA, 30% AA) a los cubreobjetos con células. Incubar los cubreobjetos a 37 °C durante 6-8 h. Lave el cubreobjetos con PBS 3x y las muestras de células resultantes estarán listas para su posterior procesamiento.

3. Preparación de muestras de cerebro de ratón

1. Compre ratones C57BL/6J (de 6 a 8 semanas de edad, machos y hembras, seis ratones) y ratones de Alzheimer (9 meses de edad, hembras, tres ratones) de fuentes comerciales (detalles en la Tabla de materiales). Realizar la eutanasia mediante narcosis por anhídrido carbónico según el protocolo estándar²⁷. En resumen, coloque ratones en una cámara y llene la cámara con un flujo de 100% de CO₂ del orden de 30%-70% del volumen de la cámara/min y mantenga el flujo durante al menos 1 min después de la muerte clínica.
2. Después de confirmar la eutanasia humanitaria, decapita rápidamente a los ratones con una tijera. Exponga el cráneo con una incisión grande a través de la piel a lo largo de la línea media. Tira de la piel hacia la nariz del animal para exponer completamente el cráneo.
3. Corta el cráneo a lo largo de la línea media con unas tijeras finas y despega las dos mitades del cráneo hacia un lado. Use pinzas para sacar el cerebro en una placa de Petri en hielo con PBS. Lave el cerebro fresco del ratón con PBS helado y transfiera el cerebro a 10 ml de tampón de fijación (4% PFA, 30% AA).
4. Incubar el cerebro de ratón en un tampón de fijación a 4 °C durante 24-48 h y luego transferirlo a 37 °C durante la noche. Después de lavarlo con PBS estéril, corte el cerebro del ratón en secciones de 150 μm con un vibratomo y guárdelo en PBS a 4 °C.

4. Incrustación de hidrogel, desnaturalización y expansión de muestras de células y tejidos

1. Asegúrese de que las muestras se incubaron en el tampón de fijación durante el tiempo requerido, como se indicó anteriormente. Descongele las soluciones de stock X, iniciador de radicales libres y acelerador y manténgalas en hielo durante todo el proceso.
   NOTA: Un tiempo de incubación insuficiente podría causar una reducción del número de proteínas retenidas en el híbrido de hidrogel y, por lo tanto, causar una disminución de la señal.
2. Recoja el cubreobjetos con celdas y colóquelo en un portaobjetos de vidrio con pinzas. Recoge los trozos de cerebro (de 150 μm de grosor) y colócalos en otro portaobjetos de vidrio con un pincel de lana suave, asegurándote de que queden planos. Deshazte del exceso de líquido que viene con las muestras.
3. Apile dos cubreobjetos (# 1.5), agregando gotas de agua entre ellos, a ambos lados de la muestra en el portaobjetos de vidrio para hacer una cámara de gelificación. Coloque el portaobjetos de vidrio con la muestra hacia arriba sobre un bloque de calor helado y enfríelo a 4 °C durante 1 min.
4. Agregue un 10% (p/p) de TEMED al stock X y luego un 10% de la solución APS. Realice un vórtice rápido y, dentro de 1 minuto después de mezclar, deje caer lentamente la solución resultante en la cámara sobre las muestras para cubrir la superficie de la muestra, evitando burbujas de aire. Mantenga la solución y las muestras en hielo (o en un bloque de calor helado) para evitar la formación de gel (alto grado de polimerización) antes de agregarlas a la muestra.
5. Una vez que la muestra esté completamente sumergida en la solución, coloque un cubreobjetos plano, transparente y cubierto con película encima de la muestra como tapa para la cámara. Deje la cámara en hielo o en un bloque de calor helado durante 1 minuto más antes de incubarla en una incubadora humidificadora a 37 °C durante 30 minutos.
6. Saque la cámara de gelificación en el portaobjetos de vidrio de la incubadora a 37 °C. Se debe observar un gel no transparente después de quitar la tapa. Recupere el gel cortando con una cuchilla de afeitar o, alternativamente, coloque el portaobjetos de vidrio en un tampón desnaturalizante a temperatura ambiente durante 15 minutos. El gel se separará del portaobjetos de vidrio.
7. Incubar el gel aislado en un tampón desnaturalizante en condiciones de calor para lograr una mayor desnaturalización y delipidación. En el caso de las muestras de células, desnaturalizar a 95 °C durante 1 h. Para cortes de cerebro de 150 μm de grosor, desnaturalizar a 70 °C durante 3 h, seguido de 95 °C durante 1 h.
   NOTA: El gel podría volverse rizado cuando se incuba por primera vez con tampón desnaturalizante a temperatura ambiente. Es normal y se volverá plano después de la desnaturalización a alta temperatura. Cuando se trabaja con muestras de tejido más gruesas, se necesita un tiempo de desnaturalización más largo.
8. Después del tratamiento térmico, lavar la muestra desnaturalizada 3 veces con PBS durante 10 min. En este punto, el gel debería haberse expandido a aproximadamente 1,5 veces el tamaño original. Incube el gel lavado con agua ultrapura en un recipiente grande (al menos 20 veces el volumen del gel) para lograr una mayor relación de expansión. Cambie el agua cada 1 h 3 veces y deje la muestra a oscuras durante la noche. El gel resultante está listo para la imagen.
   NOTA: La relación de expansión depende en gran medida de las propiedades mecánicas de la muestra original. Se obtuvo una expansión de 4,2 veces para las muestras de células y de 3,4 veces para la muestra de tejido cerebral.

5. Imágenes sin etiquetas de la distribución de proteínas endógenas en muestras expandidas de células y tejidos

1. Mantenga las muestras de gel expandido en agua durante el proceso de obtención de imágenes. El gel es frágil después de la expansión, por lo que debe manipularse con precaución. Coloque el gel expandido portador de muestras en un portaobjetos de microscopio (1 mm de grosor) con un espaciador de microscopio con tamaños de abertura y profundidades adecuados, lleno de agua. Cubra el espaciador con un cubreobjetos (#1.5) y asegúrese de que esté correctamente sellado para evitar el movimiento de la muestra.
2. Coloque la muestra con la célula expandida o el tejido en la platina motorizada con el cubreobjetos orientado hacia el objetivo. Haga clic en Ocular en el software para cambiar la trayectoria de la luz a campo claro y ajuste la posición z con una perilla manual.
3. Agregue aceite de inmersión en la parte superior de la muestra y ajuste el condensador a la posición correcta para la iluminación Köhler mientras observa en campo claro con un aumento de 25x desde el objetivo. Ingrese 791,3 nm en la ventana de longitud de onda OPO en el panel láser para dirigirse a la vibración de la proteína CH₃ a 2940 ^cm-1.
4. Cambie la luz del microscopio de campo brillante (ocular) al modo de escaneo láser haciendo clic en el botón LSM y abra el obturador láser SRS presionando el botón Obturador en el panel de control láser. Presione el botón LIVE en el software del microscopio para iniciar la adquisición de imágenes en tiempo real.
5. Encuentre el enfoque adecuado cambiando la z mientras mira la imagen SRS con un tiempo de permanencia de píxeles corto (12,5 μs/píxel) y una resolución de imagen baja (256 píxeles x 256 píxeles). Una vez que se encuentra la posición z ideal, cambie el tamaño de escaneo y el tiempo de permanencia de los píxeles tirando de la barra respectiva en el software del microscopio.
6. Adquiera la imagen pulsando el botón LSM utilizando la condición de supermuestreo (1024 píxeles x 1024 píxeles) con un tiempo de permanencia de píxeles más largo (80 μs/píxel) que coincida con la constante de tiempo del amplificador de bloqueo. Adquiera imágenes volumétricas mediante la recopilación de una pila z con un tamaño de paso de 1 μm en la dirección z. Procese y analice el archivo OIR guardado desde el software utilizando ImageJ.
   NOTA: La configuración detallada del SRS ha sido reportada recientemente en Mutlu et ^al.24. Aquí, un láser de picosegundos sintonizable con una tasa de repetición de 80 MHz y un ancho de banda de 2 ps para bomba (770-990 nm) y stokes (1031,2 nm) se dirigió a un microscopio confocal de barrido láser (detallado en la Tabla de Materiales). Optimice la superposición temporal y espacial de los dos haces para señales con D₂O puro. Se necesita un poco de esfuerzo para encontrar la z correcta para la muestra expandida en campo claro porque el índice de refracción es muy homogéneo en todo el gel.
7. Determine la resolución de VISTA tomando una imagen SRS de perlas de poliestireno (100 nm) utilizando un objetivo de 25x y un objetivo de 60x. Ajuste el láser de la bomba a 784,5 nm, lo que corresponde a un desplazamiento Raman de 3050 ^cm-1, característico de las vibraciones aromáticas C-H estira las vibraciones del poliestireno.
   NOTA: La longitud de onda del láser de bomba utilizada aquí es similar a la utilizada en VISTA para las proteínas.
8. Con el objetivo de 60x, el medio máximo experimental de onda completa (FWHM, que es el ancho de la forma de la línea a la mitad de la amplitud) de la imagen de la cuenta fue de 276,17 nm. Modele la función del objeto de cuenta como un semicírculo.
   NOTA: Cuando la función gaussiana PSF tiene un c (σ) = 269 nm/2,35, la imagen de perlas contorneadas tendría un FWHM medido de 276,17 nm. Como resultado, la resolución del sistema SRS es de 269 nm × 1,22 = 328 nm según el criterio de Rayleigh. Como VISTA tiene un promedio de 4,2 veces la expansión de las muestras de células, la resolución efectiva se reduce a 328 nm / 4,2 = 78 nm.

6. Imágenes correlativas VISTA y fluorescentes de muestras de tejido inmunomarcadas y expandidas

1. Después de la desnaturalización, preincube las muestras incluidas en hidrogel (por ejemplo, una sección coronal cerebral de 150 μm) en Triton X-100 (PBST) al 1% (v/v) durante 15 minutos. Cambie el tampón de incubación a PBST con anticuerpo primario en una dilución de 1:100. Si se necesitan múltiples objetivos proteicos para la obtención de imágenes múltiples, diluya los anticuerpos primarios respectivos para diferentes objetivos a concentraciones adecuadas en el mismo cóctel e incube con las muestras simultáneamente.
2. Incubar los geles con anticuerpos primarios diluidos a 37 °C con una agitación suave a 80 rpm durante 16-18 h, seguido de un lavado exhaustivo 3 veces con PBST durante 1-2 h a 37 °C. Dé la vuelta al gel durante la incubación para evitar el marcaje no homogéneo de anticuerpos aquí y en todas las incubaciones posteriores.
3. Incubar las muestras con anticuerpos secundarios de las especies objetivo correspondientes a diluciones 1:100 con PBST a 37 °C durante 12-16 h, protegidas de la luz. Lave las muestras de hidrogel marcadas 3 veces con PBST durante 1-2 h a 37 °C agitando suavemente.
4. Diluir DAPI a una concentración final de 3 μM en PBS. Añada un volumen suficiente de solución de DAPI al hidrogel de muestra para que el gel quede sumergido en la solución. Incubar durante 1-2 h a temperatura ambiente con una suave agitación a 80 rpm. Lave la muestra 3 veces con PBS.
5. Amplíe las muestras de gel inmunomarcadas incubando con un gran volumen de H₂O doblemente desionizado. Cambie el agua cada 1 h 3 veces e incube las muestras en H₂O durante la noche, protegidas de la luz. Durante el etiquetado, el gel debe expandirse 1,5 veces en comparación con el tampón PBS.
6. Prepare la muestra de imagen como se describe en el paso 5.1. Coloque la muestra de imagen en el microscopio confocal de barrido láser con el objetivo de inmersión en agua de 25x, 1,05 NA, para imágenes fluorescentes.
7. Seleccione el canal adecuado con el láser de excitación respectivo (405 nm, 488 nm, 561 nm y 640 nm) y el par PMT de acuerdo con los anticuerpos dirigidos en el menú desplegable del software del microscopio. Presione el botón LIVE para la adquisición de imágenes en tiempo real.
8. Ajuste la posición de enfoque mediante una perilla manual basada en la señal de fluorescencia en tiempo real. Optimice la potencia del láser, el tiempo de permanencia de los píxeles y la ganancia de PMT en el software del microscopio de acuerdo con la señal de fluorescencia en tiempo real para evitar una señal tenue o sobresaturada.
   NOTA: Evalúe la apariencia y las características en función de las estructuras reportadas de diferentes anticuerpos para eliminar las posibles reactividades cruzadas de anticuerpos y evitar la diafonía entre diferentes canales de fluorescencia.
9. Presione el botón LSM para comenzar a adquirir imágenes SRS y fluorescentes correlativas. En primer lugar, recopile imágenes de fluorescencia volumétrica en muestras inmunomarcadas. Una vez finalizadas las imágenes de fluorescencia, cambie la trayectoria de la luz del microscopio a la condición transparente infrarroja (IR).
10. Cambie el canal de detección de fluorescencia PMT a SRS en el software del microscopio. Abra el obturador del láser SRS y realice imágenes volumétricas SRS en el campo de visión de la misma muestra con el mismo rango de z. El rango normal está entre 100-200 μm y puede llegar hasta 700 μm.
    NOTA: Hay una ligera aberración cromática que causa un cambio en la posición z entre las imágenes fluorescentes y las imágenes SRS debido a la diferencia de longitud de onda en los láseres de excitación. Es necesaria una comparación manual en paralelo entre las imágenes SRS y las imágenes de fluorescencia de la pila z. Busque las características de coincidencia exactas tanto del SRS como del canal de fluorescencia para que coincidan con la posición z con precisión.

7. Construcción, formación y validación de la arquitectura U-Net

NOTA: Se recomienda la instalación en Linux. Se requiere una tarjeta gráfica con >10 GB de RAM.

1. Configuración del entorno
   1. Instale Anaconda o Miniconda en un 3-5.3.0-linux-x86_64. Clona o descarga los siguientes archivos: https://github.com/Li-En-Good/VISTA. Cree un entorno de Conda para la plataforma mediante la siguiente línea de comandos:
      conda env create -f environment.yml
2. Entrenamiento del modelo de predicción
   1. Empareje los directorios de las imágenes SRS correspondientes con imágenes de realidad real en un archivo csv. Coloque los directorios de imágenes SRS debajo de path_signal y las imágenes de realidad del terreno debajo de path_target columnas.
   2. Coloque el archivo csv en la carpeta data/csvs. Modifique la configuración en scripts/train_model_2d.sh si es necesario. Active el entorno mediante la línea de comandos:
      Conda Activate FNET
   3. Inicie el entrenamiento del modelo mediante la línea de comandos:
      ./scripts/train_model_2d.sh 0
      A continuación, comenzará el entrenamiento. Las pérdidas de cada iteración se mostrarán en la línea de comandos y se guardarán con el modelo en la carpeta save_models/nombre del archivo < para el archivo csv>.
3. Valide las imágenes del conjunto de entrenamiento y del conjunto de pruebas mediante la línea de comandos:
   ./scripts/train_model_2d.sh 0
   Los resultados de la predicción se guardarán en la carpeta results/.

8. VISTA combinado con predicciones de U-Net para la multiplexidad específica de proteínas en imágenes sin etiquetas

1. Modifique el archivo csv en data/csvs//test.csv. Reemplace los directorios de path_signal y path_target por el directorio de las nuevas imágenes SRS.
2. Quite los resultados de la predicción del entrenamiento, que es la carpeta results/. Ejecute predicciones mediante la línea de comandos:
   ./scripts/train_model_2d.sh 0
   Los resultados de la predicción se guardarán en la carpeta results//test.

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Resultados

Después de establecer el principio de funcionamiento del método de imagen y análisis, se realizó el registro de imágenes para evaluar la relación de expansión y garantizar la expansión isotrópica durante el procesamiento de la muestra (Figura 1A, B). Se tomaron imágenes tanto de muestras no tratadas como de VISTA, dirigiéndose a la vibración del enlace a 2940 ^cm-1, que se origina en CH₃ de proteínas endóge...

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Discusión

En resumen, presentamos el protocolo para VISTA, que es una modalidad libre de etiquetas para obtener imágenes de estructuras celulares y subcelulares ricas en proteínas de células y tejidos. Al dirigirse al CH₃ endógeno de las proteínas en células y tejidos incrustados en hidrogel, el método logra una resolución de imagen efectiva de hasta 78 nm en muestras biológicas y resuelve la extrusión menor en agregados de huntingtina y fibrillas en placas de Aβ. Esta técni...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 M Tris pH 8	Sigma-Aldrich	648314
16% Paraformaldehyde	Electron microscopy science	15710	diluted to 4% in PBS
25x water immersion objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	NA 1.05
5XFAD Mice	Mutant Mouse Resource and Research Centers and the Jackson Laboratory	B6SJL-Tg (APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286 V) 6799Vas/Mmjax	Alzheimer brain
60x water immersion objective	Olympus	UPLSAPO60XWIR	NA 1.2
Acrylamide	Sigma-Aldrich	A9099
ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
anti-MAP2	Cell Signaling Technology	8707
anti-NeuN	Cell Signaling Technology	24307
borosilicate coverslip #1.5	Fisher Scientific	1254581
C57BL/6J Mice	Jackson Laboratory (JAX)	664	Normal mice
D2O	Sigma-Aldrich	151882	for SRS calibration
DAPI	Thermo Fisher	D1306
DMEM	GIBCO	10566-016
FBS	GIBCO	A4766
glass slide 3" x 1" x 1 mm	VWR	16004-430
goat anti-chicken IgY, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21449
goat anti-mouse IgG, Alexa Fluor 647	Invitrogen	A-21236
goat anti-rabbit IgG, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11034
goat anti-rat IgG, Alexa Fluor 568	Invitrogen	A-11077
Grace Bio-Labs Press-To-Seal silicone isolators	Sigma-Aldrich	GBL664108	microscope spacer
Htt-97Q-GFP Plasmid	Gift from Prof. R. Kopito and Prof. F.-U.Hartl.
Laser scanning microscope	Olympus	FV3000	laser scanning confocal microscope
lipofectamine 3000	Thermo Fisher	L3000001	transfection agent
Lycopersicon Esculentum Lectin DyLight®594 (lectin)	Vector Laboratories	DL-1177-1
Microscope spacer	Grace Bio-Labs	621502
N,N′-methylenebisacrylamide (BIS)	Sigma-Aldrich	M1533	bought as 2% solution in water
Nuclease free water	Thermo Fisher	10977-015
Penicillin-Streptomycin	GIBCO	15140-122
poly-strene beads	Sigma-Aldrich	43302	for resolution characterization
Sodium Acrylate	Sigma-Aldrich	408220
sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	71725
soft-wool paint brush #3	TANIS	000333
SRS Laser	A.P.E	picoEmerald	2ps pulse width
tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
Tissue culture flask 25 cm2	Corning	430639
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Tween-20	Sigma-Aldrich	P9416
tweezer	Fine Science Tool	11295-51
Vibrotome	Leica	VT1200S	the vibratome