أدوات الموائع الدقيقة للتحقيق في التفاعلات الفطرية الميكروبية على المستوى الخلوي

Summary

نظرا لعتامة التربة ، لا يمكن بسهولة تصور التفاعلات بين الميكروبات المكونة لها بدقة خلوية. هنا ، يتم تقديم أداتين للسوائل الدقيقة ، والتي توفر فرصا جديدة للتحقيق في التفاعلات الفطرية الميكروبية. الأجهزة متعددة الاستخدامات وسهلة الاستخدام ، مما يتيح التحكم الزماني المكاني العالي والتصوير عالي الدقة على المستوى الخلوي.

Abstract

الفطريات الخيطية هي سكان ناجحون في التربة وتلعب دورا رئيسيا في النظم الإيكولوجية للتربة ، مثل تحلل المواد العضوية وغير العضوية ، وكذلك تنظيم مستويات المغذيات. هناك يجدون أيضا العديد من الفرص للتفاعل مع مجموعة متنوعة من الميكروبات الأخرى مثل البكتيريا أو الفطريات الأخرى. ومع ذلك ، فإن دراسة التفاعلات الفطرية على المستوى الخلوي يمكن أن تكون صعبة بسبب طبيعة التربة الشبيهة بالصندوق الأسود. ويجري تطوير أدوات جديدة للموائع الدقيقة لدراسة التفاعلات الفطرية؛ يتم تسليط الضوء على منصتين مصممتين لدراسة التفاعلات البكتيرية الفطرية والفطرية والفطرية. داخل هذه القنوات الدقيقة ، يمكن مراقبة التفاعلات الفطرية الميكروبية في بيئات فيزيائية كيميائية خاضعة للرقابة بدقة زمنية ومكانية أعلى مما كان ممكنا في السابق. وقد أسفر تطبيق هذه الأدوات عن العديد من الرؤى البيولوجية الجديدة، مثل ملاحظة الارتباط القطبي البكتيري بالهيفاي أو الكشف عن العداوات الفطرية الفطرية غير المميزة. ومن السمات الرئيسية لهذه المنهجيات سهولة استخدام هذه الأداة من قبل غير الخبراء، مما ينتج عنه تكنولوجيات قابلة للترجمة بدرجة عالية لاستخدامها في مختبرات علم الأحياء الدقيقة.

Introduction

التربة هي بيئة متنوعة بشكل استثنائي تحتوي على وفرة من الكائنات الحية الدقيقة التي لها دور أساسي في دورات الكربون والفوسفور ^1,2. الفطريات الخيطية هي عنصر رئيسي في العديد من النظم الإيكولوجية كمتحللة للمواد العضوية وغير العضوية ويمكن أن تعزز تغذية النباتات من خلال تشكيل علاقات تكافلية ^3,4. داخل التربة ، تتفاعل الفطريات ديناميكيا مع العديد من الميكروبات مثل الفطريات الأخرى⁵ والبكتيريا⁶ والفيروسات⁷ والديدان الخيطية⁸. هذه التفاعلات لها عواقب وخيمة على صحة التربة والنبات. ومع ذلك، وبسبب الافتقار إلى النظم التجريبية المناسبة القادرة على تصوير الكائنات الحية الدقيقة المتفاعلة بدقة عالية، لا يزال العديد منها غير محدد.

وللتحقيقات المتعلقة بالتفاعلات البكتيرية الفطرية والتفاعلات الفطرية والفطرية تطبيقات قيمة في طائفة من المجالات، بما في ذلك مضادات الميكروبات في الطب وعوامل المكافحة البيولوجية في الزراعة. على سبيل المثال ، ينتج الفطر Coprinopsis cinerea الببتيد copsin، الذي ثبت أنه يظهر نشاطا مضادا للبكتيريا ضد العامل الممرض البشري Listeria monocytogenes⁹. وبالمثل ، يستخدم المركب المشتق من الفطريات ، griseofulvin ، على نطاق واسع كعلاج للعدوى الفطرية البشرية ، بالإضافة إلى أنه قادر على تثبيط نمو الفطريات المسببة للأمراض النباتية Alternaria solani^10,11. كما ثبت أن العديد من سلالات بكتيريا Bacillus subtilis التي تعيش في التربة هي عوامل فعالة للمكافحة الحيوية للنبات الفطري الممرض Rhizoctonia solani^12,13. ومع ذلك، ونظرا للقيود المرتبطة بالمنهجيات التقليدية، فإن مؤسسات التمويل الدولية ومؤسسات التمويل الأجنبي غير مفهومة بشكل جيد على مستوى الخلايا المفردة.

عادة ما تستكشف الدراسات التقليدية BFIs و FFIs على النطاق الكلي باستخدام ألواح أجار مع نوعين أو أكثر في المواجهة. يتم تقييم تفاعلها عن طريق قياس معدلات النمو وإنتاج الأيض للأنواع المواجهة¹⁴،^15،16 ؛ ومع ذلك ، يتم حل هذه المنهجية فقط على مستوى المستعمرة. لدراسة التفاعلات على المستوى الخلوي ، يمكن زراعة اللقاحات البكتيرية والفطرية على شرائح المجهر الزجاجية المغلفة بالأجار والتي يتم تصويرها بعد ذلك تحت المجهر¹⁷. ومع ذلك ، قد يكون من الصعب اتباع hypha واحد باستخدام شرائح المجهر بسبب عدم وجود حبس ، مما يعني أنه من الصعب الحصول على صور الفاصل الزمني. علاوة على ذلك ، فإن فرصة حصر الكائنات الحية الدقيقة الأخرى مكانيا داخل مناطق محددة من الميسيليوم الفطري أو إنشاء بيئات كيميائية محددة يمكن إزعاجها ، على سبيل المثال ، غير ممكنة في مثل هذه الإعدادات. تضيف طبيعة "الصندوق الأسود" للتربة أيضا إلى تعقيد دراسة التفاعلات الفطرية الميكروبية على مستوى الخلايا المفردة¹⁸. من خلال مراقبة الأنواع المتفاعلة بعيدا عن التنوع المذهل لميكروبيوم التربة ، يمكن تقييم الطريقة الدقيقة التي يتفاعل بها الأعضاء الأفراد. وبالتالي ، هناك حاجة مستمرة إلى منصات متعددة الاستخدامات تمكن من التصوير عالي الدقة وخلية واحدة ل BFIs و FFIs.

توفر تقنيات الموائع الدقيقة ، ما يسمى بأنظمة المختبر على رقاقة ، منصة مثالية لدراسة BFIs و FFIs على مستوى الخلايا المفردة. تم اعتماد مجال الموائع الدقيقة ، الناشئة عن التقنيات المطورة للتحليل الكيميائي والإلكترونيات الدقيقة ، من قبل العلوم البيولوجية¹⁹. تنظم تقنيات الموائع الدقيقة كميات صغيرة من السوائل داخل شبكة مخصصة من القنوات المصغرة ، لها بعد واحد على الأقل على مقياس الميكرومتر ، ويتوسع استخدامها في الأبحاث البيولوجية²⁰. على وجه الخصوص ، تم تطوير أجهزة الموائع الدقيقة لدراسة نمو الفطريات الخيطية^21،22،²³،²⁴،²⁵،26،27^،28،^29،30. إحدى فوائد استخدام هذه التكنولوجيا هي أن حبس hyphae وتوزيع العناصر الغذائية داخل القنوات الدقيقة يشبه إلى حد كبير بنية بيئة التربة أكثر من طرق الأجار التقليدية³¹. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام منصات الموائع الدقيقة للتحقيق في التفاعلات بين العدلات البشرية ومسببات الأمراض الفطرية³² ، والبكتيريا وجذور النباتات 33 ، وكذلك الفطريات والديدان الخيطية^34,35.

واحدة من المزايا العديدة لاستخدام الموائع الدقيقة لدراسة التفاعلات الميكروبية تشمل التحكم المحدد في بيئة القنوات الدقيقة. على سبيل المثال ، يمكن استغلال أنظمة التدفق الرقائقي لتوليد تدرجات تركيز محددة ، وهو أمر مفيد بشكل خاص عند فحص التاكسي الكيميائي البكتيري³⁶. ميزة أخرى هي أن الطبيعة الشفافة ل poly (dimethylsiloxane) (PDMS) ، وهو بوليمر مطاطي غير مكلف ومتوافق حيويا يستخدم عادة في تصنيع أجهزة الموائع الدقيقة ، يسهل التصوير عالي الدقة للخلايا المفردة باستخدام المجهر الساطع والفلوري³⁷. وبالمثل ، فإن حبس الميكروبات داخل القنوات الدقيقة يعني أنه يمكن إجراء تجارب الفاصل الزمني التي تتعقب الخلايا المفردة ، مما يسمح بتسجيل الاستجابات الخلوية الفردية وتحديدها كميا³⁷. وأخيرا، بما أنه يمكن تصميم أجهزة الموائع الدقيقة لتكون سهلة الاستخدام، يمكن استخدامها بسهولة من قبل غير الخبراء³⁸.

ومن المهم تعزيز المعرفة بالتفاعلات بين الكائنات الحية الدقيقة التي تعيش في التربة لتحسين ممارسات الإدارة المستدامة للنظم الإيكولوجية التي تحافظ على التنوع البيولوجي وللتخفيف من أثر تغير المناخ على البيئات الأرضية³⁹. وبالتالي ، فإن تطوير أدوات جديدة للموائع الدقيقة أمر أساسي لتوسيع فهم الفطريات وتفاعلاتها على المستوى الخلوي. وسيركز البروتوكول هنا على جهازين من أجهزة الموائع الدقيقة المنتجة لدراسة BFIs⁴⁰ و FFIs⁴¹ كما هو موضح في الشكل 1.

الشكل 1: التمثيل البصري والتخطيطي لأجهزة التفاعل البكتيري الفطري (BFI) والتفاعل الفطري الفطري (FFI). (أ) صورة لجهاز BFI. يتم وضع قابس mycelial عند مدخل أحد طرفي القنوات الدقيقة للسماح بنمو hyphal في الجهاز. المدخل البكتيري في الطرف المعاكس. شريط المقياس = 5 مم (B) نظرة عامة تخطيطية على جهاز BFI ، تصور موضع المداخل البكتيرية واتجاه نمو الواصلة من خلال القنوات الدقيقة التفاعلية. يبلغ عمق القنوات 10 ميكرومتر وعرضها 100 ميكرومتر وطولها 7 مم ، مع 28 قناة مراقبة في المجموع. (ج) فحص المواجهة على صفيحة أجار بين Coprinopsis cinerea و Bacillus subtilis NCIB 3610 ، شريط المقياس = 20 مم (يسار). صور مجهرية تظهر التفاعل بين C. cinerea و B. subtilis NCIB 3610 داخل القناة الدقيقة (الوسطى واليمنى) ، أي التعلق القطبي للبكتيريا ب hyphae الفطرية. شريط المقياس = 25 ميكرومتر (وسط) و 10 ميكرومتر (يمين). (د) صورة لجهاز FFI مرتبط بطبق بتري ذو قاع زجاجي ، ملقح مزدوج بسدادات mycelial. شريط المقياس = 1 سم (E) نظرة عامة تخطيطية لجهاز FFI. يتم إدخال اثنين من سدادات التطعيم الفطرية في المداخل في أي من طرفي الجهاز ، مما يسمح بالاستكشاف الواصلي للقنوات الدقيقة. ترتبط قنوات التحكم بمدخل فطري واحد فقط ولها قناة مسدودة ، مما يمنع التفاعلات بين فطريات الاختبار. تربط قنوات التفاعل كلا من المداخل الفطرية وتسمح بالتفاعلات الواصلة بين مواضيع الاختبار داخل القناة الدقيقة. تتكون كل قناة تفاعل من 18 قسما على شكل ماس ، يبلغ طولها الإجمالي 8.8 مم (490 × 430 ميكرومتر لكل ماسة) ، وعمقها 10 ميكرومتر ، ولها منطقة ربط بين كل ماسة تبلغ 20 ميكرومتر. يتم تكرار أنواع القنوات ، أشرطة المقياس = 1 مم. (F) منطقة التفاعل بين جبهتين واصليتين تقتربان ، تنمو من طرفي نقيض من قناة التفاعل المترابطة. صورة مجهرية لتباين الطور ، شريط مقياس = 250 ميكرومتر. تم تعديل اللوحات الواردة في هذا الشكل من Stanley et al., 2014 (A-C)⁴⁰ and Gimeno et al., 2021 (D-F)⁴¹. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Protocol

ملاحظة: يرد ملخص للإجراءات المبينة في هذا البروتوكول بصورة مرئية في الشكل 2.

الشكل 2: تمثيل تخطيطي للمنهجية المقدمة يتألف من خمسة أقسام رئيسية مفصلة في هذا البروتوكول. يتم إنشاء تصميمات الأجهزة باستخدام برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) وقالب رئيسي يتم تصنيعه باستخدام الطباعة الحجرية الضوئية (1). يستخدم هذا لصب بولي (ثنائي ميثيل سيلوكسان) (PDMS) ، والذي يتم تقطيعه بعد ذلك إلى ألواح وربطه بأطباق بتري ذات القاع الزجاجي لتشكيل أجهزة الموائع الدقيقة (2). يتم استزراع الميكروبات التي سيتم تضمينها في الدراسة (3) واستخدامها لتلقيح الأجهزة (4). تتم دراسة التفاعلات باستخدام الفحص المجهري وتحديد كميتها باستخدام تقنيات تحليل الصور (5). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

1. تصنيع العفن الرئيسي

1. إنتاج قناع الضوء
   1. إنشاء تصاميم أجهزة الموائع الدقيقة باستخدام برنامج التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD). يتم إعطاء أبعاد الأجهزة المعروضة في الشكل 1 ويتم سرد المزيد من التفاصيل حول ميزات التصميم المحددة بشكل شامل في المنشورات المعنية^40,41.
   2. قم بتصدير ملف تصميم CAD باستخدام تنسيق مناسب (على سبيل المثال، .dwg .dxf). اطبع قناع الطباعة الحجرية الضوئية للفيلم عن طريق إرسال ملف تصميم CAD المصدر إلى مزود تجاري للطباعة.
2. الطباعة الحجرية الضوئية
   ملاحظة: يجب إجراء الخطوات التالية في بيئة خالية من الغبار ويتم التحكم فيها بالضوء، مثل غطاء محرك السيارة الرقائقي أو مرفق الغرفة النظيفة. يتم إعطاء الشروط التجريبية المقدمة هنا كدليل ويجب تحسينها داخليا. يوصي المؤلفون بالبحث عن تدريب محدد واستشارة البروتوكولات المعمول بها⁴².
   1. تحضير رقاقة السيليكون 100 ملم عن طريق الخبز في فرن على حرارة 200 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. قم بتغطية رقاقة السيليكون بمقاومة للضوء SU-8 2010 ، بهدف تحقيق سمك مستهدف يبلغ 10 ميكرومتر ، باستخدام الشروط التالية: 500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوان (تسارع 100 دورة في الدقيقة / ثانية) و 3000 دورة في الدقيقة لمدة 45 ثانية (تسارع 300 دورة في الدقيقة / ثانية).
      تحذير: مقاومة الضوء SU-8 خطرة ، احذر عند التعامل معها ومنع الاستنشاق والاتصال بالجلد. إنه قابل للاشتعال ، يحتمل أن يكون مسرطنا وساما للبيئة.
   2. تخبز رقاقة السيليكون المطلية على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 2.5 دقيقة (خبز ناعم). قم بتعريض المقاومة للضوء للأشعة فوق البنفسجية (UV) ، باستخدام قناع الطباعة الحجرية الضوئية للفيلم وجرعة طاقة تبلغ 140 mJ / cm² عند الطول الموجي 365 nm باستخدام محاذاة قناع.
   3. تخبز رقاقة السيليكون المطلية على حرارة 95 درجة مئوية لمدة 3.5 دقيقة (خبز ما بعد التعرض). اغمر رقاقة السيليكون وحركها في حل المطور لمدة 3 دقائق للكشف عن الهياكل الدقيقة عن طريق إزالة المقاومة الضوئية غير المكشوفة.
      تنبيه: يمكن أن يكون حل المطور قابلا للاشتعال ، واتخاذ الاحتياطات المناسبة عند التعامل معه وتخزينه.
   4. اشطفيه بمحلول مطور جديد لمدة 10 ثوان. شطف مع الكحول الأيزوبروبيل لمدة 10 ثانية وتجفيف الهواء. استخدم الهواء المضغوط المصفى لضمان جفاف الهياكل تماما. قم بقياس ارتفاع هياكل SU-8 ، على سبيل المثال ، باستخدام مقياس التنميط.
   5. قم بتسييل كل قالب رئيسي ب 50 ميكرولتر من الكلوروتريميثيل سيلان عن طريق تطبيق ضغط فراغ يبلغ 50 مللي بار لمدة 2 ساعة. لاحظ المؤلفون أن إعادة صقل القالب الرئيسي لم يكن ضروريا.
      تحذير: كلوروتريميثيل سيلان مادة خطرة. ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) والتعامل معها بعناية. تجنب ملامسة الجلد والعينين ومنع الاستنشاق. يحفظ بعيدا عن مصادر الاشتعال ويستخدم في منطقة جيدة التهوية.

2. تصنيع الجهاز

ملاحظة: يجب إجراء الخطوات التالية في بيئة خالية من الغبار، مثل غطاء التدفق الرقائقي.

1. تحضير ألواح البولي (ثنائي ميثيل سيلوكسان) (PDMS)
   1. تحضير ما يقرب من 40 غرام من PDMS عن طريق خلط القاعدة جيدا وعامل المعالجة بنسبة 10: 1 باستخدام ملعقة في كوب بلاستيكي نظيف. قم بفك الخليط لإزالة جميع فقاعات الهواء عن طريق وضع الكوب البلاستيكي الذي يحتوي على PDMS في غرفة فراغ (ضغط الفراغ = 50 مللي بار) لمدة 1 ساعة.
   2. قم بتأمين القالب الرئيسي في حامل بلاستيكي باستخدام شريط شفاف. نظف باستخدام الهواء المصفى المضغوط لإزالة أي جزيئات غبار.
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن تشكيل رقائق الألومنيوم حول طبق بتري زجاجي ، ثم استخدامها لإيواء القالب الرئيسي واحتواء PDMS⁴³.
   3. صب خليط PDMS على وسط القالب الرئيسي ، مما يضمن أنه على سطح مستو ، واتركه يستقر.
      ملاحظة: يجب سكب خليط PDMS قدر الإمكان على سطح القالب الرئيسي والحفاظ على تدفق مستمر لتقليل إدخال فقاعات الهواء. يمكن إزالة فقاعات الهواء عن طريق توجيه الهواء المضغوط فوق الفقاعة أو عن طريق إخراجها باستخدام إبرة دقيقة.
   4. قم بتغطية القالب الرئيسي بشكل فضفاض بغطاء بلاستيكي لمنع جزيئات الغبار من الاستقرار على سطح PDMS. انقل القالب الرئيسي إلى فرن وقم بمعالجته بين عشية وضحاها عند 70 درجة مئوية.
   5. أخرج القالب الرئيسي من الفرن واتركه ليبرد. قشر PDMS المعالج بعيدا عن القالب الرئيسي والإطار البلاستيكي ، مع الحرص على تجنب إتلاف القالب الرئيسي / PDMS.
   6. ضع شريطا شفافا فوق القنوات الدقيقة المنقوشة في PDMS للحفاظ على سطح خال من الغبار. تأكد من إزالة الشريط قبل الترابط.
   7. قم بقص PDMS إلى ألواح (أي إذا تم تضمين أجهزة متعددة في التصميم على القالب الرئيسي ، فيمكن تصنيع العديد منها من صب واحد) كما هو محدد في التصميم باستخدام مقصلة مثبتة أو شفرة حلاقة. عند قطع الفتحة الجانبية للوح BFI PDMS ، تأكد من أن القنوات الدقيقة مفتوحة بالكامل (الشكل 1A). بالنسبة للوح FFI PDMS ، تأكد من قص كل زاوية لتمكينها من التناسب مع طبق بتري ذي القاع الزجاجي الموضح في الشكل 1D.
   8. ثقب ثقوب مدخل / مخرج المطلوبة وفقا لتصميم الجهاز. استخدم قاطعا دقيقا لثقب ثقوب المدخل التي تبلغ 3.18 مم و 4.75 مم لأجهزة BFI و FFI النموذجية ، على التوالي.
2. ربط ألواح PDMS لإنشاء أجهزة
   ملاحظة: تستخدم خطوات الغسيل التالية (2.2.1-2.2.2) منظفا بالموجات فوق الصوتية مملوءا بالماء النقي (ddH₂O) عند 37 كيلو هرتز. غسل ألواح PDMS يساعد على تعزيز الترابط الناجح⁴⁴ وتقليل خطر التلوث. للتعامل مع ألواح PDMS ، استخدم ملقط نظيف وارفعه باستخدام فتحات المدخل لتجنب تلف القنوات الدقيقة أو سطح الجهاز.
   1. غمر ألواح PDMS في 0.5 M NaOH وسونيكات لمدة 5 دقائق. شطف مع DDH₂O. معقمة نقل ألواح PDMS إلى محلول الإيثانول 70٪ وسونيكات لمدة 5 دقائق. شطف مع DDH معقمة₂0.
   2. اغمر ألواح PDMS في DDH₂O المعقمة وسونيكات لمدة 5 دقائق. قم بإزالة ألواح PDMS من ddH₂O المعقمة ، وجففها باستخدام الهواء المضغوط المصفى ، وضعها في طبق بتري مربع معقم.
   3. ضع طبق بتري المربع الذي يحتوي على ألواح PDMS في فرن على درجة حرارة 70 درجة مئوية لمدة 1 ساعة حتى يجف. أخرجه من الفرن واتركه ليبرد في بيئة خالية من الغبار. قم بإزالة أي غبار من سطح ألواح PDMS باستخدام شريط و / أو هواء مضغوط مفلتر.
   4. قم بتنشيط أسطح ألواح PDMS وأطباق Petri ذات القاع الزجاجي ليتم ربطها باستخدام منظف البلازما مع الإعدادات التالية: ضغط الفراغ 0.75 مللي بار ، الطاقة 50٪ ، وقت الطلاء 1 دقيقة. ضع الأسطح المراد تنشيطها (ثم ربطها) متجهة لأعلى في منظف البلازما.
   5. قم بإزالة ألواح PDMS وأطباق بتري ذات القاع الزجاجي من منظف البلازما واربطها عن طريق وضع الأسطح المنشطة بلطف في اتصال مطابق مع بعضها البعض. اربط ألواح BFI و FFI PDMS بأطباق Petri ذات القاع الزجاجي التي يبلغ قطرها 35 مم و 50 مم (سمك الزجاج 0.17 مم) ، على التوالي.
      ملاحظة: احرص على عدم ممارسة الكثير من الضغط عند الترابط ، لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى انهيار القنوات الدقيقة.
   6. تحقق من الترابط الناجح ببساطة عن طريق محاولة سحب لوح PDMS من طبق بتري ذو القاع الزجاجي باستخدام ملاقط. تصور الأجهزة بالعين أو باستخدام الفحص المجهري العام لضمان عدم انهيار مداخل التلقيح أو القنوات الدقيقة.
      ملاحظة: بالنسبة للظروف المشبعة (أي الظروف المشبعة بالماء و/أو الغنية بالمغذيات)، تشمل الخطوة 2-2-7 من البروتوكول. إذا كانت الظروف غير المشبعة بالماء مطلوبة، فانتقل إلى الخطوة 2.2.8. يمكن ملء الأجهزة بالماء أو الوسائط.
   7. املأ الأجهزة مباشرة بعد الترابط عن طريق سحب 100 ميكرولتر من المحلول المطلوب لجهاز BFI (المدخل البكتيري والفتحة الجانبية) أو 30 ميكرولتر من الوسائط في كل مدخل (إجمالي 60 ميكرولتر) لجهاز FFI. إذا كانت فقاعات الهواء موجودة ، فسوف تتبدد هذه الفقاعات بعد حوالي 10 دقائق من الملء لأن PDMS يمكن اختراقه.
   8. أضف ddH₂O المعقم (~ 100-200 ميكرولتر) في طبق بتري للحفاظ على الرطوبة.

3. الثقافة الميكروبية

ملاحظة: توفر الخطوات التالية إجراء ميكروبيولوجيا عاما للزراعة الفطرية والبكتيرية ويجب تنفيذه في ظل ظروف معقمة (أي باستخدام كابينة اللهب أو خزانة السلامة الميكروبيولوجية) المناسبة لمستوى الاحتواء المطلوب للميكروبات المطلوبة. يتم إعطاء أمثلة محددة في نهاية كل قسم لنوع من الاهتمام.

1. الثقافة الفطرية
   1. إعداد وسط الثقافة المطلوبة مع تكملة مع agar. أوتوكلاف الوسط عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. اترك الوسط ليبرد إلى 50 درجة مئوية واسكبه في أطباق بتري قطرها 9 سم ، مع الحفاظ على ظروف معقمة.
   2. استخدم حفار الفلين لإزالة قابس قطره 4 مم من الأجار يحتوي على الميسيليوم من مستعمرة مخزون الثلاجة من السلالة الفطرية المطلوبة لتنشيط العزلة. يتم إجراء ذلك لضمان نمو موحد وقوي للفطريات قبل تلقيح الجهاز.
      ملاحظة: يمكن أيضا تنشيط الميكروبات من مخزون الجلسرين ، أي العزلات الفطرية المخزنة على سدادات أجار في محلول الجلسرين بنسبة 50٪ عند -70 درجة مئوية⁴¹.
   3. ضع جانب القابس مع الميسيليوم على اتصال مع سطح الأجار في وسط طبق بتري غير الملقح. استبدل الغطاء الموجود أعلى طبق بتري وأغلقه قبل الحضانة في درجة الحرارة المناسبة للسلالة المطلوبة للفترة الزمنية المطلوبة ، عادة ، حوالي 3 إلى 4 أيام.
      ملاحظة: مثال على ظروف الثقافة ل Trichoderma rossicum: أجار مستخلص الشعير ، المحتضن عند 25 درجة مئوية في الظلام لمدة 48 ساعة.
2. الثقافة البكتيرية
   1. قم بإخراج العزل البكتيري المطلوب من مخزون المصدر (على سبيل المثال ، مخزون الجلسرين أو مستعمرة واحدة من صفيحة أجار) على صفيحة أجار لتحقيق مستعمرات بكتيرية واحدة وضمان عدم وجود تلوث⁴⁵. ختم لوحة مع الفيلم.
   2. احتضان في درجة حرارة ومدة محددة لعزل الاهتمام حتى يتم ملاحظة المستعمرات الفردية.
   3. تحضير مرق الثقافة المطلوب. على سبيل المثال ، أضف 10 جم من التربتون و 10 جم من كلوريد الصوديوم و 5 جم من مستخلص الخميرة لكل 1 لتر من ddH₂O لإعداد وسط LB لثقافة B. subtilis. أوتوكلاف الوسط عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
   4. اترك الوسط ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة. أضف الوسط إلى قارورة ثقافة معقمة داخل بيئة معقمة.
   5. المس مستعمرة بكتيرية واحدة من صفيحة الأجار باستخدام حلقة تلقيح معقمة. انقل الحلقة الملقحة إلى وسط الثقافة المعقمة عن طريق لمس السائل لفترة وجيزة مع الحلقة.
   6. أغلق القارورة باستخدام غطاء معقم أو رقائق معدنية ، وضعها داخل حاضنة تهتز طوال الليل باستخدام الإعدادات المناسبة للأنواع المختارة.
      ملاحظة: مثال على ظروف الاستزراع ل B. subtilis: i) زراعة السائل - النمو الهوائي عند 37 درجة مئوية عند 200 دورة في الدقيقة في LB المتوسطة و ii) زراعة اللوحة - درجة حرارة الغرفة على لوحة LB agar. ارجع إلى أوراق FFI / BFI^40,41 لمزيد من التفاصيل حول زراعة سلالات فطرية مختلفة.

4. تطعيم الجهاز

ملاحظة: يجب أن تتم الخطوات التالية داخل غطاء التدفق الرقائقي باستخدام معدات معقمة.

1. التلقيح الفطري
   1. استخدم حفار الفلين المعقم (ø = 4 مم) لإزالة قابس أجار من المستعمرة على أطراف ثقافة عمرها 3 أيام (الخطوة 3.1). تأكد من أن جبهة الواصلة المتنامية لا تزال سليمة.
   2. أدخل القابس في المدخل الفطري ، الميسيليوم جانبا لأسفل ، مع اتجاه نمو جبهة الواصلة الموجهة نحو فتحات القنوات الدقيقة لتشجيع تسلل الواصلة للقنوات.
   3. كرر الخطوات 4.1.1-4.1.2 للأنواع الفطرية الثانية (إذا كنت تستخدم جهاز FFI) ، مع إدخال القابس في المدخل المقابل. في حالة استخدام جهاز BFI، قم بحذف هذه الخطوة وتابع إلى الخطوة 4.1.4.
   4. أغلق طبق بتري بغشاء شفاف واحتضنه على حرارة 25-28 درجة مئوية في الظلام حتى يبدأ التصوير. تحديد وقت حضانة ما قبل التصوير اعتمادا على الحدث البيولوجي المقصود الذي يجب ملاحظته ، على سبيل المثال ، المواجهات الفطرية الفطرية ، ومعدل نمو الأنواع المضمنة داخل الجهاز.
2. التلقيح البكتيري
   1. تمييع البكتيريا من ثقافة بين عشية وضحاها (الخطوة 3.2) بنسبة 1:25 باستخدام نفس وسط الثقافة كما هو مفصل في الخطوة 3.2.3. ثقافة لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية.
   2. اغسل البكتيريا عن طريق تكوير الثقافة باستخدام جهاز طرد مركزي عند 2000 × g لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الخلايا في الحجم المطلوب بنسبة 0.9٪ مع محلول كلوريد الصوديوم / V.
   3. جهاز طرد مركزي مرة أخرى للحصول على بيليه. تخلص من المادة الفائقة وأعد تعليق الخلايا في وسط سائل (على سبيل المثال ، C. cinerea الحد الأدنى من الوسط إلى OD₆₀₀ من 1). تحسين قيمة OD₆₀₀ للسلالة البكتيرية المعنية.
   4. قم بإزالة جهاز BFI من الحاضنة وافتحه في بيئة معقمة. ماصة 10 ميكرولتر من التعليق في مدخل البكتيريا.
      ملاحظة: تحسين توقيت التلقيح الدقيق للتفاعلات البكتيرية الفطرية المعنية. على سبيل المثال ، أدخل البكتيريا في جهاز BFI 18 h بعد التلقيح الفطري إذا كنت تستخدم C. cinerea.
   5. أغلق طبق بتري بفيلم شفاف واحتضنه عند 25 درجة مئوية في الظلام حتى يبدأ التصوير. قم بتخزين الجهاز في وضع مستقيم.

5. المجهر وتحليل الصور

1. مجهريه
   ملاحظة: يجب على الباحث اختيار طريقة التصوير المناسبة التي تتوافق مع طبيعة التجربة المراد إجراؤها ، على سبيل المثال ، التألق المقلوب واسع المجال أو المجهر البؤري. تم تقديم نظرة عامة هنا ، حيث ستعتمد التفاصيل المحددة على سمات الفحص المجهري المختار.
   1. قم بتشغيل كمبيوتر المجهر والجسم الرئيسي للمجهر (إن وجد) والكاميرا والحاضنة التي يتم التحكم في درجة حرارتها ومصدر (مصادر) الضوء. تأكد من أن المجهر قد تم إعداده بشكل صحيح ، على سبيل المثال ، تم تطبيق إضاءة Köhler بشكل صحيح حتى لإضاءة العينة. ابدأ حزمة برامج التصوير.
      ملاحظة: عند استخدام حاضنة يتم التحكم في درجة حرارتها، من المهم السماح لدرجة حرارة المجهر بالتوازن لعدة ساعات قبل بدء التجربة.
   2. قم بتركيب جهاز الموائع الدقيقة في إدراج المرحلة. تأكد من أن الجهاز مؤمن بشكل جيد ، أي بشريط لاصق ، لمنع إزاحة الجهاز أثناء حركة المرحلة النشطة.
   3. احصل على صور للأجهزة الملقحة، على سبيل المثال، إما تجارب أحادية النقطة أو بفاصل زمني. يتم توفير مواصفات التصوير الشاملة ذات الصلة بالتجارب التي أجريت مع أجهزة BFI و FFI في المنشورات المذكورة أعلاه^40,41.
      ملاحظة: تم الحصول على صور Brightfield باستخدام الفحص المجهري لتباين الطور لتصور انتشار الواصلة من خلال قنوات النمو باستخدام برنامج التركيز البؤري التلقائي وإما التكبير بمعدل 10 أضعاف أو 0.30 NA (فتحة العدسة العددية) أو التكبير 20x أو العدسات الموضوعية 0.45 NA. تم تحقيق إثارة بروتينات المراسل الفلورسنت باستخدام محرك ضوء الصمام الثنائي الباعث للضوء عالي الطاقة مع أطوال موجية خاصة بالفلوروفور.
   4. تصدير الصور إلى تنسيق مناسب لمعالجة الصور اللاحقة. على سبيل المثال ، .tiff.
2. تحليل الصور
   ملاحظة: يوصي المؤلفون فيجي⁴⁶ كأداة لتحليل الصور ، ولكن تتوفر حزم برامج أخرى. فيما يلي أمثلة على تحليلات الصور التي أجريت باستخدام فيجي من منشورات أجهزة BFI و FFI المقدمة. هذه الخطوات خاصة بجهاز Mac وقد تختلف قليلا عند استخدام جهاز كمبيوتر.
   1. قياسات معدل نمو الواصلة
      ملاحظة: تم استخدام هذه الطريقة في مخطوطة BFI⁴⁰ لقياس معدلات نمو hyphae الفردية.
      1. قم بتنزيل فيجي وتثبيتها وتشغيلها. قم باستيراد تسلسل الصورة من تجربة بفاصل زمني عن طريق تحديد ملف > استيراد > تسلسل صورة. حدد موقع المجلد حيث يتم تخزين البيانات وحدد فتح. في النافذة خيارات التسلسل ، حدد تفضيلات، ثم موافق.
      2. حدد أيقونة الخط المستقيم من شريط الأدوات الرئيسي. ضع بداية الخط المستقيم عند طرف طرف الواصلة المتنامي بالنقر فوق المؤشر ثم سحبه بشكل متزامن إلى نقطة أخرى داخل النافذة. سيظهر خط أصفر مع ثلاثة مربعات تشير إلى بداية الخط ومنتصفه ونهايته.
      3. انتقل إلى الإطار التالي في تسلسل الصورة بالضغط مع الاستمرار على Ctrl >. ضع نهاية الخط المستقيم عند طرف الضجيج المتنامي عن طريق تحديد المربع المربع وسحبه إلى الموضع الصحيح.
      4. اضغط مع الاستمرار على Ctrl وM لقياس طول الخط بالبكسل. ستظهر نافذة النتائج مع البيانات المقاسة. حدد البيانات المعروضة في نافذة النتائج كما يلي: انقر فوق نافذة النتائج، ثم حدد النتائج > تعيين القياسات.
      5. انتقل إلى الإطار التالي في تسلسل الصورة بالضغط مع الاستمرار على Ctrl ثم >. ضع بداية الخط المستقيم عند طرف الضجيج المتنامي عن طريق تحديد المربع المربع وسحبه إلى الموضع الصحيح.
      6. اضغط مع الاستمرار على Ctrl ثم M لقياس طول الخط بالبكسل. ستظهر نافذة النتائج مع البيانات المقاسة.
      7. كرر الخطوات 5.2.1.5-5.2.1.6 حتى الانتهاء من قياس نمو hypha بالبكسل.
      8. حدد كافة البيانات في نافذة النتائج . انسخ والصق في برنامج آخر ، على سبيل المثال ، جدول بيانات ، لمعالجة البيانات. ارسم نمو الواصلة (بالبكسل أو الميكرومتر) كدالة للوقت واحسب متوسط معدلات النمو. قم بإجراء ما لا يقل عن ثلاثة نسخ بيولوجية لكل تجربة.
   2. قياسات شدة التألق
      ملاحظة: تم استخدام هذه الطريقة في منشور FFI⁴¹ لتقييم التغير في شدة التألق في hyphae من Fusarium graminearum 8/1-wt-GFP عند الاتصال ب Clonostachys rosea 016 كدالة للوقت.
      1. قم بتنزيل فيجي وتثبيتها وتشغيلها. قم باستيراد تسلسل الصور من تجربة الفاصل الزمني عن طريق تحديد ملف > استيراد > تسلسل صور. حدد موقع المجلد حيث يتم تخزين البيانات وحدد فتح. في نافذة خيارات التسلسل، حدد تفضيلات ثم موافق.
      2. حدد منطقة اهتمام (ROI) لقياس شدة التألق المطلقة للضجيج باستخدام الأداة المستطيلة، الموجودة في شريط الأدوات الرئيسي. يمكن تعريف حجم المربع بالضبط كما يلي: تحرير > تحديد > تحديد ؛ يمكن أيضا حفظ عائد الاستثمار للرجوع إليه في المستقبل في مدير عائد الاستثمار عن طريق تحديد تحرير > > إضافة إلى المدير.
      3. قم بقياس كثافة التألق المطلقة (متوسط القيمة الرمادية) ضمن عائد الاستثمار المحدد لكل صورة في تسلسل الصورة أو المكدس بأكمله كما يلي: مكدسات > الصور > قياس المكدس. سيتم فتح نافذة النتائج تلقائيا بمجرد معالجة جميع الصور الموجودة في المكدس.
         ملاحظة: يمكن تعريف البيانات المعروضة في نافذة النتائج على النحو التالي: انقر فوق نافذة النتائج ثم حدد النتائج > تعيين القياسات. تأكد من تحديد متوسط قيمة رمادية.
      4. حدد كافة البيانات في نافذة النتائج . انسخ والصق في برنامج آخر ، على سبيل المثال ، جدول بيانات ، لرسم كثافة التألق المطلقة لعائد الاستثمار المحدد كدالة للوقت.
      5. كرر الخطوات 5-2-2-2-5-2-2-4 لجمع قياسات كثافة التألق المطلقة لكل عائد على الاستثمار، أي على ضجيج الاهتمام، بجوار ضجيج الاهتمام أو داخل قناة التحكم المقابلة.
      6. احسب شدة التألق النسبية المناسبة في الوحدات التعسفية (AU)، على سبيل المثال، عن طريق قسمة شدة التألق المطلقة لعائد الاستثمار [hypha of interest] على كثافة التألق المطلقة لعائد الاستثمار [قناة التحكم]. راجع منشور FFI⁴¹ للحصول على مزيد من التفاصيل المحددة.
      7. قم بإجراء ما لا يقل عن ثلاث نسخ بيولوجية لكل تجربة ورسم كثافة التألق النسبية كدالة للوقت.

النتائج

يتم عرض النتائج التمثيلية من أجهزة BFI⁴⁰ و FFI⁴¹ النموذجية. يمكن بسهولة الحصول على قياسات معدل نمو Hyphal باستخدام هذه الأجهزة مع تقنيات الفحص المجهري الأساسية. يوضح الشكل 3A-B التفاعلات البكتيرية الفطرية بين C. cinerea hyphae و B. subtilis ...

Discussion

تقدم هذه المقالة بروتوكولا لدراسة التفاعلات الفطرية الميكروبية باستخدام الموائع الدقيقة للقناة. يهدف المؤلفون إلى إظهار تنوع هذه الأجهزة وتشجيع التكيف لتناسب اهتمامات الباحث. باستخدام أجهزة BFI و FFI النموذجية ، يمكن دراسة التفاعلات الفطرية الميكروبية بمزيد من التفصيل مما كان يمكن الوصول...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Difco Laboratories	214010	Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes
Aluminum foil	Fisher Scientific Ltd	11759408
AutoCAD 2021	Autodesk, USA
Autoclave (VX-75)	Systec
Centrifuge (5810R)	Eppendorf
Chlorotrimethysilane	Merck Life Sciences	386529	CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area.
Cork borer	SLS	COR1000
Developer solution (mr-Dev 600)	Microresist Technologies		CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable
Erlenmeyer flasks	VWR	214-1108	e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs
Ethanol (70% v/v)	Fisher Scientific Ltd	E/0650DF/15	Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade)
Fiji	ImageJ		Exemplar software package for imaging processing
Filtered, compressed air			Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used.
Flat-headed wafer tweezers	SLS	INS5026
Forceps	Fisher Scientific Ltd	10008051	Bent, sharp
Glass bottom petri dish	World Precision Instruments	FD35-100	35 mm
Glass bottom petri dish	World Precision Instruments	FD5040-100	50 mm
Glass crystallisation dishes	VWR	216-1865	Used for washing of PDMS slabs
Glass crystallisation dishes	VWR	216-1866	Used in the development of master moulds
Glass media bottles	Fisher Scientific Ltd	15456113	e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs
Glass syringe (Hamilton)	Fisher Scientific Ltd	10625251	Used for dispensing chlorotrimethylsilane
Hot plate (HP 160 III BM)	SAWATEC
Inoculation loop	VWR	COPA175CS01
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907
Laminar flow hood	Air Science (PCR)		Exemplar laminar flow hood used for device fabrication
LB medium	Fisher Scientific Ltd	BP9723-500	Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture
Light emitting diode light engine (LedHUB)	Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH		Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence)
MA6 Ultraviolet mask aligner	Suss Microtec
Malt extract	VWR	84618	Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar)
Mask Writer	Applied Materials	4700DP	Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography
Master mould plastic mount			3D-printed bespoke holder manufactured in-house
Microbiological safety cabinet  (BioMat2)	Contained Air Solutions		Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation
Milli-Q purified water			Available as standard in biology labs.
NaOH	Fisher Scientific Ltd	BP359-500
NIS-Elements Advanced Research imaging software	Nikon		Exemplar software package for image acquisition
NIS-Elements Free Viewer	Nikon		Exemplar software package for viewing acquired images
Oven (Binder BD115)	Fisher Scientific Ltd	15602126	Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS)
Oven (CLO-2AH-S)	KOYO		Used for preparing silicon wafers
Parafilm	Bemis	HS234526B	transparent film
Petri dishes, square sterile	Fisher Scientific Ltd	11708573	120.5 mm
Petri dishes, sterile	Fisher Scientific Ltd	15370366	90 mm
Photolithography mask	Micro Lithography Services Ltd. UK
Plasma cleaner (Zepto)	Diener Electronic	100012601
Plastic cup	Semadeni	8323
Plastic spatula	Semadeni	3340
Portable precision balance (OHAUS Scout)	Fisher Scientific Ltd	15519631	Used for weighing PDMS, media components etc.
Precision cutter	Syneo	HS1251135P1183	Cutting edge diameter: 3.18 mm
Precision cutter	Syneo	HS1871730P1183S	Cutting edge diameter: 4.75 mm
Profilometer	Bruker		Dektak XT-stylus
Razor blades	Häberle Labortechnik	9156110
Refridgerator	Haden		4-6 °C
Retiga R1 CCD camera	Qimaging		Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Scotch magic tape	Office Depot	3969954	19 mm invisible tape; clear tape
Shaking incubator (Cole-Parmer SI500)	Fisher Scientific Ltd	10257954
Silicon wafer	Inseto		100 mm
Soda lime glass plate	Inseto		125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Spincoater	SAWATEC	SM-180-BM
SU-8 2010 photoresist	MicroChem		CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment.
Sylgard 184 elastomer kit	VWR	634165S	Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices
Temperature controlled incubator	Okolab		Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Ti2-E inverted epifluorescence microscope	Nikon	MEA54000	Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Ultrasonic cleaner S-Line	Fisher Scientific Ltd	FB15050
Vacuum desiccator	Fisher Scientific Ltd	10528861	Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators
x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens	Nikon	MRH20105	Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions
x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens	Nikon	MRH48230	Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions