Herramientas microfluídicas para sondear las interacciones fúngico-microbianas a nivel celular

Resumen

Debido a la opacidad del suelo, las interacciones entre sus microbios constituyentes no se pueden visualizar fácilmente con resolución celular. Aquí, se presentan dos herramientas microfluídicas, que ofrecen nuevas oportunidades para investigar las interacciones fúngico-microbianas. Los dispositivos son versátiles y fáciles de usar, lo que permite un alto control espaciotemporal e imágenes de alta resolución a nivel celular.

Resumen

Los hongos filamentosos son habitantes exitosos del suelo y desempeñan un papel importante en los ecosistemas del suelo, como en la descomposición de la materia orgánica e inorgánica, así como en la regulación de los niveles de nutrientes. Allí también encuentran numerosas oportunidades para interactuar con una variedad de otros microbios como bacterias u otros hongos. Sin embargo, estudiar las interacciones fúngicas a nivel celular puede ser un desafío debido a la naturaleza similar a una caja negra del suelo. Se están desarrollando nuevas herramientas microfluídicas para el estudio de las interacciones fúngicas; se destacan dos plataformas diseñadas para estudiar las interacciones bacteriano-fúngico y fúngico-fúngico. Dentro de estos microcanales, las interacciones fúngico-microbianas se pueden monitorear en entornos físico-químicos controlados a una resolución temporal y espacial más alta de lo que era posible anteriormente. La aplicación de estas herramientas ha producido numerosos conocimientos biológicos novedosos, como la observación de la unión polar bacteriana a las hifas o la revelación de antagonismos fúngicos-fúngicos no caracterizados. Una característica clave de estas metodologías se refiere a la facilidad de uso de esta herramienta por parte de no expertos, que produce tecnologías altamente traducibles para su uso en laboratorios de microbiología.

Introducción

El suelo es un entorno excepcionalmente diverso que contiene una gran cantidad de microorganismos que son fundamentales para los ciclos de carbono y fósforo ^1,2. Los hongos filamentosos son un componente importante de numerosos ecosistemas como descomponedores de materia orgánica e inorgánica y pueden mejorar la nutrición de las plantas a través de la formación de relaciones simbióticas ^3,4. Dentro del suelo, los hongos interactúan dinámicamente con multitud de microbios como otros hongos⁵, bacterias⁶, vi....

Protocolo

NOTA: Un resumen de los procedimientos descritos en este protocolo se muestra visualmente en la Figura 2.

Figura 2: Representación esquemática de la metodología presentada que consta de cinco secciones principales detalladas en este protocolo. Los diseños de dispositivos se crean utilizando software de diseño asistido por computadora (CAD) y un molde maestro fabricado con fotolitografía (1). Esto se u....

Resultados

Se presentan resultados representativos de los dispositivos ejemplares BFI⁴⁰ y FFI⁴¹. Las mediciones de la tasa de crecimiento hifal se pueden obtener fácilmente utilizando estos dispositivos en combinación con técnicas básicas de microscopía. La Figura 3A-B ilustra las interacciones bacteriano-fúngicas entre C. cinerea hyphae y B. subtilis NCIB 3610. La presencia de B. subtilis.......

Discusión

Este artículo presenta un protocolo para el estudio de las interacciones fúngico-microbianas utilizando microfluídica de canal. Los autores tienen como objetivo demostrar la versatilidad de estos dispositivos y fomentar la adaptación para adaptarse a los intereses del investigador. Utilizando los dispositivos ejemplares BFI y FFI, las interacciones fúngico-microbianas se pueden estudiar con más detalle de lo que se podía acceder anteriormente. Al eliminar la complejidad de fondo y la heterogeneidad del suelo, mode.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Difco Laboratories	214010	Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes
Aluminum foil	Fisher Scientific Ltd	11759408
AutoCAD 2021	Autodesk, USA
Autoclave (VX-75)	Systec
Centrifuge (5810R)	Eppendorf
Chlorotrimethysilane	Merck Life Sciences	386529	CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area.
Cork borer	SLS	COR1000
Developer solution (mr-Dev 600)	Microresist Technologies		CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable
Erlenmeyer flasks	VWR	214-1108	e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs
Ethanol (70% v/v)	Fisher Scientific Ltd	E/0650DF/15	Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade)
Fiji	ImageJ		Exemplar software package for imaging processing
Filtered, compressed air			Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used.
Flat-headed wafer tweezers	SLS	INS5026
Forceps	Fisher Scientific Ltd	10008051	Bent, sharp
Glass bottom petri dish	World Precision Instruments	FD35-100	35 mm
Glass bottom petri dish	World Precision Instruments	FD5040-100	50 mm
Glass crystallisation dishes	VWR	216-1865	Used for washing of PDMS slabs
Glass crystallisation dishes	VWR	216-1866	Used in the development of master moulds
Glass media bottles	Fisher Scientific Ltd	15456113	e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs
Glass syringe (Hamilton)	Fisher Scientific Ltd	10625251	Used for dispensing chlorotrimethylsilane
Hot plate (HP 160 III BM)	SAWATEC
Inoculation loop	VWR	COPA175CS01
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907
Laminar flow hood	Air Science (PCR)		Exemplar laminar flow hood used for device fabrication
LB medium	Fisher Scientific Ltd	BP9723-500	Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture
Light emitting diode light engine (LedHUB)	Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH		Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence)
MA6 Ultraviolet mask aligner	Suss Microtec
Malt extract	VWR	84618	Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar)
Mask Writer	Applied Materials	4700DP	Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography
Master mould plastic mount			3D-printed bespoke holder manufactured in-house
Microbiological safety cabinet  (BioMat2)	Contained Air Solutions		Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation
Milli-Q purified water			Available as standard in biology labs.
NaOH	Fisher Scientific Ltd	BP359-500
NIS-Elements Advanced Research imaging software	Nikon		Exemplar software package for image acquisition
NIS-Elements Free Viewer	Nikon		Exemplar software package for viewing acquired images
Oven (Binder BD115)	Fisher Scientific Ltd	15602126	Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS)
Oven (CLO-2AH-S)	KOYO		Used for preparing silicon wafers
Parafilm	Bemis	HS234526B	transparent film
Petri dishes, square sterile	Fisher Scientific Ltd	11708573	120.5 mm
Petri dishes, sterile	Fisher Scientific Ltd	15370366	90 mm
Photolithography mask	Micro Lithography Services Ltd. UK
Plasma cleaner (Zepto)	Diener Electronic	100012601
Plastic cup	Semadeni	8323
Plastic spatula	Semadeni	3340
Portable precision balance (OHAUS Scout)	Fisher Scientific Ltd	15519631	Used for weighing PDMS, media components etc.
Precision cutter	Syneo	HS1251135P1183	Cutting edge diameter: 3.18 mm
Precision cutter	Syneo	HS1871730P1183S	Cutting edge diameter: 4.75 mm
Profilometer	Bruker		Dektak XT-stylus
Razor blades	Häberle Labortechnik	9156110
Refridgerator	Haden		4-6 °C
Retiga R1 CCD camera	Qimaging		Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Scotch magic tape	Office Depot	3969954	19 mm invisible tape; clear tape
Shaking incubator (Cole-Parmer SI500)	Fisher Scientific Ltd	10257954
Silicon wafer	Inseto		100 mm
Soda lime glass plate	Inseto		125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Spincoater	SAWATEC	SM-180-BM
SU-8 2010 photoresist	MicroChem		CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment.
Sylgard 184 elastomer kit	VWR	634165S	Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices
Temperature controlled incubator	Okolab		Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Ti2-E inverted epifluorescence microscope	Nikon	MEA54000	Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Ultrasonic cleaner S-Line	Fisher Scientific Ltd	FB15050
Vacuum desiccator	Fisher Scientific Ltd	10528861	Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators
x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens	Nikon	MRH20105	Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions
x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens	Nikon	MRH48230	Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions