세포 수준에서 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 미세 유체 도구

요약

토양의 불투명도로 인해 구성 미생물 간의 상호 작용은 세포 분해능으로 쉽게 시각화 될 수 없습니다. 여기에서는 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 새로운 기회를 제공하는 두 가지 미세 유체 도구가 제시됩니다. 이 장치는 다재다능하고 사용하기 쉬우므로 세포 수준에서 높은 시공간 제어 및 고해상도 이미징이 가능합니다.

초록

필라멘트 균류는 토양의 성공적인 거주자이며 유기 및 무기 물질의 분해뿐만 아니라 영양소 수준의 조절과 같은 토양 생태계에서 중요한 역할을합니다. 거기에서 그들은 또한 박테리아 나 다른 곰팡이와 같은 다양한 다른 미생물과 상호 작용할 수있는 수많은 기회를 발견합니다. 그러나 세포 수준에서 곰팡이 상호 작용을 연구하는 것은 토양의 블랙 박스와 같은 특성 때문에 어려울 수 있습니다. 곰팡이 상호 작용의 연구를 위해 새로운 미세 유체 도구가 개발되고 있습니다. 박테리아 - 곰팡이 및 곰팡이 - 곰팡이 상호 작용을 연구하기 위해 고안된 두 가지 플랫폼이 강조됩니다. 이러한 마이크로채널 내에서, 진균-미생물 상호작용은 이전에 가능했던 것보다 더 높은 시간적 및 공간적 분해능으로 제어된 물리-화학적 환경에서 모니터링될 수 있다. 이러한 도구의 적용은 균사에 대한 박테리아 극성 부착의 관찰 또는 특징이없는 곰팡이 - 곰팡이 적대감을 드러내는 것과 같은 수많은 새로운 생물학적 통찰력을 산출했습니다. 이러한 방법론의 주요 특징은 비 전문가가이 도구의 사용 편의성과 관련하여 미생물학 실험실에서 사용할 수있는 번역 가능성이 높은 기술을 제공합니다.

서문

토양은 탄소와 인 순환 ^1,2에 도움이되는 풍부한 미생물을 포함하는 매우 다양한 환경입니다. 필라멘트 균류는 유기 및 무기 물질의 분해제로서 수많은 생태계의 주요 구성 요소이며 공생 관계^{형성 3,4}을 통해 식물의 영양을 향상시킬 수 있습니다. 토양 내에서 곰팡이는 다른 곰팡이⁵, 박테리아⁶, 바이러스⁷ 및 선충류⁸과 같은 수많은 미생물과 동적으로 상호 작용합니다. 이러한 상호 작용은 토양과 식물 건강에 중요한 영향을 미칩니다. 그러나 고해상도로 상호 작용하는 미생물을 이미징 할 수있는 적절한 실험 시스템이 없기 때문에 많은 사람들이 정의되지 않은 채로 남아 있습니다.

박테리아 - 곰팡이 상호 작용 (BFI) 및 곰팡이 - 곰팡이 상호 작용 (FFIs)에 관한 조사는 의학의 항균제 및 농업의 생물학적 조절제를 포함하여 다양한 분야에서 가치있는 응용 프로그램을 가지고 있....

프로토콜

참고: 이 프로토콜에 설명된 절차에 대한 요약은 그림 2에 시각적으로 묘사되어 있습니다.

그림 2: 이 프로토콜에 자세히 설명된 다섯 개의 주요 섹션으로 구성된 제시된 방법론의 개략적인 표현. 장치 설계는 CAD(컴퓨터 지원 설계) 소프트웨어와 포토리소그래피(1)를 사용하여 제조된 마스터 몰드를 사용하여 만들어집니다. 이것은 폴리 (디메틸 실록산) (PDMS)를 주조하는 데 사용되며, 이는 슬래브로 다이싱되고 유리 바닥 페트리 접시에 결합되어 미세 유체 장치 (2)를 형성합니다. 연구에 포함될 미생물은 배양(3)되고 장치(4)를 접종하는데 사용된다. 상호 작용은 현미경을 사용하여 연구되고 이미지 분석 기술을 사용하여 정량화됩니다 (5).

결과

대표적인 결과는 예시 BFI⁴⁰ 및 FFI⁴¹ 디바이스로부터 제시된다. 히팔 성장률 측정은 기본적인 현미경 기술과 함께 이러한 장치를 사용하여 쉽게 얻을 수 있습니다. 도 3A-B는 C. cinerea hyphae와 B. subtilis NCIB 3610 사이의 박테리아-진균 상호작용을 도시한다. B. subtilis의 존재는 공동 접종 후 약 5 시간 ?.......

토론

이 기사는 채널 미세 유체학을 사용하는 곰팡이 - 미생물 상호 작용의 연구를위한 프로토콜을 제시합니다. 저자는 이러한 장치의 다양성을 입증하고 연구자의 이익에 맞게 적응을 장려하는 것을 목표로합니다. 예시적인 BFI 및 FFI 장치를 사용하여, 진균-미생물 상호작용은 이전에 접근가능한 것보다 더 상세하게 연구될 수 있다. 토양의 배경 복잡성과 이질성을 제거하고, 균사의 성장을 단일 단층?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Difco Laboratories	214010	Used to solidify culture medium for bacterial and fungal cultivation within Petri dishes
Aluminum foil	Fisher Scientific Ltd	11759408
AutoCAD 2021	Autodesk, USA
Autoclave (VX-75)	Systec
Centrifuge (5810R)	Eppendorf
Chlorotrimethysilane	Merck Life Sciences	386529	CAUTION: Chlorotrimethylsilane is a hazardous substance. Wear appropriate PPE and handle with care. Avoid contact with skin and eyes and prevent inhalation. Keep away from sources of ignition and use in a well-ventilated area.
Cork borer	SLS	COR1000
Developer solution (mr-Dev 600)	Microresist Technologies		CAUTION: mr-Dev 600 developer solution is flammable
Erlenmeyer flasks	VWR	214-1108	e.g. 200 mL; choose size to suit your exact needs
Ethanol (70% v/v)	Fisher Scientific Ltd	E/0650DF/15	Diluted from 99.8% (Analytical Reagent Grade)
Fiji	ImageJ		Exemplar software package for imaging processing
Filtered, compressed air			Available as standard in most labs. Altervatively, an oil-free compressor with air regulator can be used.
Flat-headed wafer tweezers	SLS	INS5026
Forceps	Fisher Scientific Ltd	10008051	Bent, sharp
Glass bottom petri dish	World Precision Instruments	FD35-100	35 mm
Glass bottom petri dish	World Precision Instruments	FD5040-100	50 mm
Glass crystallisation dishes	VWR	216-1865	Used for washing of PDMS slabs
Glass crystallisation dishes	VWR	216-1866	Used in the development of master moulds
Glass media bottles	Fisher Scientific Ltd	15456113	e.g. 250 mL; choose size to suit your exact needs
Glass syringe (Hamilton)	Fisher Scientific Ltd	10625251	Used for dispensing chlorotrimethylsilane
Hot plate (HP 160 III BM)	SAWATEC
Inoculation loop	VWR	COPA175CS01
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich	W292907
Laminar flow hood	Air Science (PCR)		Exemplar laminar flow hood used for device fabrication
LB medium	Fisher Scientific Ltd	BP9723-500	Exemplar nutrient broth for bacterial overnight culture
Light emitting diode light engine (LedHUB)	Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH		Exemplar light source that can be used for imaging fungal-microbial interactions (fluorescence)
MA6 Ultraviolet mask aligner	Suss Microtec
Malt extract	VWR	84618	Used to make exemplar fungal culture medium (Malt extract agar)
Mask Writer	Applied Materials	4700DP	Example of a mask writer which can be used to print photo-mask for photolithography
Master mould plastic mount			3D-printed bespoke holder manufactured in-house
Microbiological safety cabinet  (BioMat2)	Contained Air Solutions		Exemplar MSC used for microbial culture and device inoculation
Milli-Q purified water			Available as standard in biology labs.
NaOH	Fisher Scientific Ltd	BP359-500
NIS-Elements Advanced Research imaging software	Nikon		Exemplar software package for image acquisition
NIS-Elements Free Viewer	Nikon		Exemplar software package for viewing acquired images
Oven (Binder BD115)	Fisher Scientific Ltd	15602126	Used for curing poly(dimethylsiloxane)(PDMS)
Oven (CLO-2AH-S)	KOYO		Used for preparing silicon wafers
Parafilm	Bemis	HS234526B	transparent film
Petri dishes, square sterile	Fisher Scientific Ltd	11708573	120.5 mm
Petri dishes, sterile	Fisher Scientific Ltd	15370366	90 mm
Photolithography mask	Micro Lithography Services Ltd. UK
Plasma cleaner (Zepto)	Diener Electronic	100012601
Plastic cup	Semadeni	8323
Plastic spatula	Semadeni	3340
Portable precision balance (OHAUS Scout)	Fisher Scientific Ltd	15519631	Used for weighing PDMS, media components etc.
Precision cutter	Syneo	HS1251135P1183	Cutting edge diameter: 3.18 mm
Precision cutter	Syneo	HS1871730P1183S	Cutting edge diameter: 4.75 mm
Profilometer	Bruker		Dektak XT-stylus
Razor blades	Häberle Labortechnik	9156110
Refridgerator	Haden		4-6 °C
Retiga R1 CCD camera	Qimaging		Exemplar camera that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Scotch magic tape	Office Depot	3969954	19 mm invisible tape; clear tape
Shaking incubator (Cole-Parmer SI500)	Fisher Scientific Ltd	10257954
Silicon wafer	Inseto		100 mm
Soda lime glass plate	Inseto		125 mm x 125 mm x 2 mm. Used to hold photolithography mask in mask aligner
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Spincoater	SAWATEC	SM-180-BM
SU-8 2010 photoresist	MicroChem		CAUTION: SU-8 photoresist is hazardous, take care when handling and prevent inhalation and contact with skin. Flammable, potentially carcinogenic and toxic to the environment.
Sylgard 184 elastomer kit	VWR	634165S	Used for the preparation of poly(dimethylsiloxane)(PDMS) devices
Temperature controlled incubator	Okolab		Exemplar incubator that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Ti2-E inverted epifluorescence microscope	Nikon	MEA54000	Exemplar microscope that can be used for imaging fungal-microbial interactions
Ultrasonic cleaner S-Line	Fisher Scientific Ltd	FB15050
Vacuum desiccator	Fisher Scientific Ltd	10528861	Silianisation and PDMS degassing should be conducted in separate desiccators
x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL objective lens	Nikon	MRH20105	Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions
x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL objective lens	Nikon	MRH48230	Exemplar objective lens that can be used for imaging fungal-microbial interactions