تسهيل الثقافة العضوية الدماغية من خلال إضاءة الضوء الناعم الجانبي

Summary

توفر المواد العضوية الدماغية فرصا غير مسبوقة لدراسة تطور الأعضاء وأمراض الأمراض البشرية. على الرغم من تحقيق نجاح كبير مع أنظمة الزراعة العضوية الدماغية ، إلا أنه لا تزال هناك صعوبات تشغيلية في تطبيق هذه التكنولوجيا. يصف هذا البروتوكول إجراء عضوي دماغي يسهل التغيير المتوسط والنقل العضوي.

Abstract

في الوقت الحاضر ، لا تزال تكنولوجيا الزراعة العضوية الدماغية معقدة للعمل ويصعب تطبيقها على نطاق واسع. من الضروري إيجاد حل بسيط وعملي. لذلك ، يقترح بروتوكول عضوي دماغي أكثر جدوى في هذه الدراسة. لحل الإزعاج الذي لا مفر منه في التغيير المتوسط ونقل العضوية في المرحلة المبكرة ، يعمل البحث الحالي على تحسين تقنية التشغيل من خلال تطبيق المبدأ الهندسي. تم اعتماد مصباح ضوئي ناعم لإلقاء الضوء أفقيا على عينات الجسم الجنيني (EB) ، مما يسمح برؤية EBs بالعين المجردة من خلال تأثير الانعكاس المنتشر المحسن. باستخدام مبدأ التدفق الثانوي الناتج عن الدوران ، تتجمع المواد العضوية نحو مركز البئر ، مما يسهل تشغيل التغيير المتوسط أو النقل العضوي. بالمقارنة مع الخلية المشتتة ، يستقر الجسم الجنيني بشكل أسرع في الماصة. باستخدام هذه الظاهرة ، يمكن إزالة معظم الخلايا الحرة وشظايا الخلايا الميتة بشكل فعال بطريقة بسيطة ، مما يمنع EBs من تكبد أضرار من الطرد المركزي. تسهل هذه الدراسة تشغيل الثقافة العضوية الدماغية وتساعد على تعزيز تطبيق المواد العضوية في الدماغ.

Introduction

بالمقارنة مع أنظمة الاستزراع ثنائية الأبعاد (2D) ، تتمتع أنظمة الاستزراع ثلاثية الأبعاد (3D) بالعديد من المزايا ، بما في ذلك التكرار الحقيقي والاستنساخ الفعال للهياكل المعقدة لبعض الأعضاء¹. لذلك ، تعد المواد العضوية الدماغية واحدة من الطرق المساعدة المهمة لمجالات البحث في نمو الدماغ البشري والمرض² ، وفحص الأدوية ، والعلاج الخلوي.

زراعة المواد العضوية الدماغية عن طريق طريقة التعليق الدوار تفضي إلى تطورها ونضجها³. على الرغم من أن أنظمة الزراعة العضوية الدماغية حققت نجاحا كبيرا ، إلا أنها لا تزال تواجه تحديات حرجة تحد من تطبيقها. على سبيل المثال ، تنطوي الزراعة اليدوية على خطوات معالجة معقدة وتضع عقبات أمام تحقيق تطبيقات واسعة النطاق. بالإضافة إلى ذلك ، في كل مرحلة من مراحل النمو في ثقافة المواد العضوية الدماغية ، هناك حاجة إلى تغييرات في وسائل الإعلام المختلفة والسيتوكينات⁴. ومع ذلك ، في المرحلة المبكرة ، يكون للعضويات أو EBs أحجام صغيرة (حوالي 200 ميكرومتر إلى 300 ميكرومتر) ولا يمكن الوصول إليها بصريا تقريبا بدون جهاز مناسب. حتما ، يتم مسح كمية معينة من العينات العضوية الثمينة بعيدا عند تغيير الوسط. تم استكشاف العديد من التقنيات للتغلب على هذا في أنواع أخرى من الثقافات العضوية ، وتشمل بعض الأمثلة غمر رقائق العضوية بأكملها في وسط ثقافة لمدة 3 أيام دون تدخل⁵ ؛ إضافة وسط جديد من خلال الغطاء بعد امتصاص الوسط القديم باستخدام ورق ماص⁵ ؛ أو تطبيق خطوط أنابيب الموائع الدقيقة المعقدة لتبادل السوائل⁶،^7،8. عقبة أخرى تواجه في المرحلة المبكرة من زراعة المواد العضوية هي صعوبة تحقيق ملاحظات مباشرة بالعين المجردة ، والتي يمكن أن تسبب عمليات سيئة تؤدي إلى تلف عضوي وفقدانه أثناء خطوات نقل المواد العضوية. لذلك ، من الضروري إنشاء بروتوكول أكثر جدوى يسهل التغيير المتوسط ونقل المواد العضوية لتوليد المواد العضوية.

يتم اقتراح عملية محسنة مقابلة تستند إلى المبادئ الهندسية للتغلب على هذه المشاكل ، مما يسهل بشكل كبير ومريح العديد من الإجراءات العضوية. في الطبيعة ، عندما تشرق الشمس في منزل من خلال فجوة نافذة ، يمكن للعين المجردة رؤية الغبار يرقص في شعاع الضوء. بسبب الانعكاس المنتشر لأشعة الشمس على الغبار ، يتم انكسار بعض الضوء في مقلة العين لإنتاج صورة مرئية. مستوحاة من مبدأ هذه الظاهرة ^9,10 ، صنعت هذه الدراسة مصباحا ضوئيا ناعما وأضاءت EBs أفقيا. وقد وجد أن EBs يمكن أن تكون واضحة بصريا دون التأثير على نطاق المشاهدة. يتم توليد تدفق ثانوي يشير إلى المركز في السائل عن طريق تدوير لوحة الثقافة بسبب تيارات الدوامة¹¹. تتراكم EBs المنتشرة أصلا في وسط اللوحة. بناء على ذلك ، وظاهرة أن سرعة الترسيب للعضويات أسرع من سرعة الخلايا ، يتم اقتراح طريقة تشغيل سهلة للتغيير المتوسط ونقل المواد العضوية دون الطرد المركزي. يمكن فصل المواد العضوية في وسط المزرعة بشكل فعال عن الخلايا الحرة وشظايا الخلايا الميتة من خلال عملية النقل هذه.

هنا ، يتم اقتراح بروتوكول سهل التشغيل لتوليد عضويات دماغية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. تم تحسين تقنية التشغيل من خلال تطبيق المبدأ الهندسي ، مما يجعل العمليات في ثقافة 3D بسيطة ومجدية مثل تلك الموجودة في ثقافة 2D. طريقة تبادل السوائل المحسنة وعملية نقل العضوية مفيدة أيضا لأنواع أخرى من ثقافة العضوية وتصميم آلات الزراعة التلقائية.

Protocol

وقد أجري البروتوكول عقب إعلان هلسنكي. تم منح الموافقة من قبل لجنة الأخلاقيات للمستشفى الثالث التابع لجامعة قوانغتشو الطبية (المراجعة الطبية والأخلاقية [2021] رقم 022). قبل التجربة، تم إعداد كل وسيط وفقا لصيغة يورغن أ. كنوبليش¹² (الجداول التكميلية 1-4)، أو تم استخدام مجموعة المواد العضوية الدماغية المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد). تم إنشاء iPSCs المستخدمة في هذه الدراسة سابقا من قبل مختبرنا وحصلت على إعفاء مستنير. تم إنشاء SCA3-iPSCs من أنثى تبلغ من العمر 31 عاما من مريض الرنح الشوكي من النوع 3 (SCA3) تم تصنيفه وراثيا على أنه يحتوي على تكرار 26/78 CAG في جين ATXN3¹³ (الشكل التكميلي 1A). تم اختيار iPSCs البشرية العادية المذكورة في مقالة سابقة على أنها NC-iPSCs 14 ، وتم تحديد جين ATXN3 على أنه يحتوي على تكرار CAG 14/¹⁴ (الشكل التكميلي 1B).

1. تحضير الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs)

1. جمع 3 مل من الدم المحيطي عن طريق الوخز بالإبر الوريدية بموافقة مستنيرة من المتطوعين والمرضى.
2. عزل خلايا الدم الطرفية أحادية النواة وفقا لطريقة Ficoll-Paque¹⁵.
3. إنشاء iPSCs وفقا لبروتوكول مجموعة إعادة برمجة Sendai (انظر جدول المواد).
   1. قم بزراعة iPSCs بوسط mTeSR1 في أطباق بتري 35 مم مغطاة ب Matrigel (مصفوفة غشاء سفلي ، انظر جدول المواد). تغيير الوسط كل يوم. يجب ألا تتجاوز كثافة نمو iPSC 75٪.
   2. هضم الخلايا باستخدام محلول تفكك PSC (انظر جدول المواد) وزراعتها الفرعية بنسبة 1: 5 كل 3-5 أيام.
      تنبيه: يتم استخدام فيروس سينداي هنا. ويجب تشغيله في خزانة السلامة الأحيائية، ويجب اتخاذ تدابير الحماية الذاتية. يجب أن يكون من الواضح ما إذا كان يمكن استخدامه بشكل قانوني في البلد المحلي. ويجب اتباع قوانين ولوائح السلامة الأحيائية المحلية بدقة عند استخدامها.

2. إعداد EB (أيام 0-1)

1. قم بإزالة وسط mTeSR1 من iPSCs باستخدام ماصة واغسله 2x مع 1 مل من 1x PBS.
2. قم بإزالة PBS باستخدام ماصة ، وأضف 300 ميكرولتر من محلول انفصال الخلايا (انظر جدول المواد) لهضم iPSCs إلى خلايا مفردة لمدة 3-4 دقائق عند 37 درجة مئوية.
3. أعد تعليق الخلايا في 2 مل من وسط تكوين EB (الجدول التكميلي 1) ثم قم بالطرد المركزي للعينة لمدة 5 دقائق عند 300 × g (درجة حرارة الغرفة).
4. عالج اللوحة المتخصصة المكونة من 24 بئرا مسبقا بمحلول شطف مضاد للالتصاق (500 ميكرولتر / بئر) لمدة 5 دقائق (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: يعد محلول الشطف المضاد للالتصاق ضروريا لتكوين EB والكروي الأمثل.
5. أعد تعليق الخلايا في وسط تكوين EB الذي يحتوي على Y-27632 (التركيز النهائي ، 10 ميكرومتر ، انظر جدول المواد) ، بكثافة خلية تبلغ 1.5 × 10⁶ خلايا / مل.
6. قم بإزالة محلول الشطف المضاد للالتصاق ، وشطف كل بئر باستخدام 2 مل من وسط تشكيل EB.
7. أضف الخلايا إلى الألواح المتخصصة المكونة من 24 بئرا بكثافة 3 × 10⁶ خلايا/بئر (الشكل 1A، إلى اليسار).
   ملاحظة: عادة ، يمكن إعداد 300 EBs في كل بئر. يمكن لهذه الطريقة إعداد كميات كبيرة من EBs من نفس الحجم.
8. جهاز طرد مركزي اللوحة عند 100 × g لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بتوزيع الخلايا بشكل موحد في كل غرفة في أسفل اللوحة (الشكل 1A ، على اليمين).
   ملاحظة: إذا لم يكن هناك جهاز طرد مركزي مناسب ، فيمكن أيضا وضع اللوحة مباشرة في الحاضنة للثقافة الثابتة ، ولكن وقت تكوين كرة EB سيكون بعد عدة ساعات من ذلك تحت الطرد المركزي العادي.
9. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ لمدة 24 ساعة. إذا لم يتم استخدام الطرد المركزي في الخطوة السابقة ، فقم بالحضانة لمدة 36 ساعة. حافظ على ثبات العينة ، ولا تخرجها من الحاضنة خلال هذه الفترة.

3. إعداد مصباح الضوء الناعم (اليوم 1)

1. استخدم لوح أكريليك شفاف بسماكة 0.3-0.5 سم بحجم ورق A5. الصق منصات بيضاء على الجزء الأمامي والخلفي من لوحة الاكريليك.
   1. قم بتثبيت صف من مصابيح LED البيضاء على حافة اللوحة بحيث يمكن للأضواء الدخول من جانب لوحة الأكريليك ثم إطلاقها بالتوازي (الشكل التكميلي 2A-F ، الشكل 1B).
      ملاحظة: نظرا لأن أقطار EBs في المرحلة المبكرة تبلغ حوالي 200 ميكرومتر إلى 300 ميكرومتر ، فمن الصعب ملاحظتها بوضوح بالعين المجردة تحت مصباح الفلورسنت للمقاعد النظيفة. في المقابل ، بسبب تعزيز الانعكاس المنتشر ، يمكننا اكتشاف EBs بوضوح باستخدام ضوء ناعم مضاء أفقيا (الشكل 1B ، C). يوصى باستخدام لوحة من 6 آبار لثقافات EB في التجارب اللاحقة. ومع ذلك ، لإظهار التأثير البصري للضوء الناعم بشكل أفضل ، يتم استخدام الأطباق في بعض الأحيان لالتقاط الصور ومقاطع الفيديو في هذه الدراسة بدلا من الأطباق ، لذا يرجى عدم إساءة الفهم. يمكن أيضا استخدام مصباح الإضاءة الناعم المضاء أفقيا للوحة المكونة من 6 آبار.

4. تحويل EB والاستبدال المتوسط (الأيام 2-5)

1. قم بإعداد لوحة جديدة منخفضة الالتصاق من 6 آبار ، وأضف 2 مل من وسط تكوين EB إلى كل بئر.
2. قم بإزالة EBs مع الوسط باستخدام طرف ماصة عريض التجويف سعة 1000 ميكرولتر (انظر جدول المواد) وانقلها إلى لوحة الالتصاق المنخفضة ذات 6 آبار (~ 100 EBs / well).
   ملاحظة: تعتمد عملية التشغيل على مصباح ضوء ناعم (مذكور في الخطوة 3.) لتسهيل مراقبة EBs. أوقف تشغيل مصادر الإضاءة الداخلية الأخرى للحصول على التأثير البصري للضوء الناعم بشكل أفضل.
3. استبدله بنفس الحجم من وسيط تشكيل EB الطازج كل يوم. استخدم التدفق الثانوي لجمع EBs إلى المركز وتغيير الوسط.
   1. استنشاق الوسط القديم عن طريق السحب إلى حافة البئر ببطء. لا تمتص من الصعب جدا. خلاف ذلك ، ستتم إزالة EBs معا. ثم أضف وسيطا جديدا لإعادة تعليق EBs.
      ملاحظة: التدفق الثانوي الأساسي (الشكل 1D). حفز تدفق دوامة عن طريق تدوير الطبق على طول مدار دائري. بسبب تدفق الدوامة ، يتم تحفيز تدفق ثانوي موجه نحو المركز. تتلاقى EBs أو المواد العضوية مع مركز البئر بسبب التدفق الثانوي المتولد من خلال الدوران ، وبعد ذلك يمكن تنفيذ التغيير المتوسط أو النقل الجنيني بسهولة.

5. التحقق من تعدد القدرات عن طريق وضع العلامات مع علامة تعدد القدرات OCT4 (اليوم 4)

ملاحظة: عندما يكون قطر EBs أكبر من 300 ميكرومتر ، خذ العديد من EBs لتلطيخ التألق المناعي لعلامة OCT4 للكشف عن تعدد قدراتها.

1. إصلاح EBs في 4٪ paraformaldehyde في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، تليها الغسيل في 1x PBS 3x لمدة 10 دقائق في كل مرة.
2. انقل EBs إلى PBS في درجة حرارة الغرفة التي تحتوي على 0.3٪ Triton X-100 و 3٪ BSA لمدة 2 ساعة ، تليها الغسيل في PBS 3x لمدة 10 دقائق في كل مرة.
   ملاحظة: بعد معالجتها ب Triton X-100 ، تطفو EBs على سطح السائل ويمكن امتصاصها بسهولة مع السائل أثناء التنظيف. يوصى بالتشغيل تحت المجهر المجسم.
3. قم بتخفيف الجسم المضاد الأولي OCT4 (انظر جدول المواد) مع 1 مل من 1x PBS يحتوي على 1٪ BSA بنسبة 1:200 وأضف إلى EBs للحضانة عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها ، ثم اغسلها في PBS 3x لمدة 10 دقائق في كل مرة.
4. قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي المعني (انظر جدول المواد) باستخدام 1x PBS في 1:500 وأضف 1 مل إلى EBs.
5. بعد الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة ، اغسل الخلايا في 1x PBS 3x لمدة 10 دقائق في كل مرة.
6. قم بإزالة PBS ، وأضف 2 مل من محلول PBS 1x الذي يحتوي على 1 ميكروغرام / مل DAPI ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق ، ثم اغسله في PBS 3x لمدة 10 دقائق في كل مرة.
7. حرك EB الذي يحتوي على كمية صغيرة من السائل على الشريحة ، وأغلق الشريحة بغطاء زجاجي مطلي بالفازلين المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) على الحافة ، ثم راقب الصورة واجمعها تحت المجهر البؤري الفلوري.
   ملاحظة: يمثل تعبير OCT4 تعدد القدرات EB¹². عندما يكون التعبير عن OCT4 أقل من 90٪ ، يجب التخلص من EBs ، ويجب إعداد EBs مرة أخرى.

6. الحث العصبي (أيام 5-7)

1. قم بإعداد صفيحة جديدة من 6 آبار ذات التصاق منخفض ، وأضف 3 مل من وسط الحث العصبي (الجدول التكميلي 2) إلى كل بئر.
2. قم بتشغيل الضوء الناعم الجانبي (المذكور في الخطوة 3.) وأوقف تشغيل مصادر الإضاءة الداخلية الأخرى.
3. انقل EBs إلى لوحة 6 آبار مع إضافة وسط تحريض عصبي (~ 100 EBs / well). أضف أقل قدر ممكن من الوسط الأصلي إلى البئر الجديد.
   ملاحظة: إدخال مهارات بسيطة من نقل العضوية. وبطبيعة الحال، في ظل الجاذبية وبكثافة أعلى نسبيا من المتوسط، ستغرق EBs المعاد تعليقها تدريجيا من خلال تطبيق العملية الموضحة في الشكل 1E. وبالتالي ، يمكن نقل EBs بسهولة. وبما أن الخلايا الحرة وشظايا الخلايا الميتة تغرق ببطء أكبر، مقارنة بالخلايا EBs، فإن معظم الخلايا الحرة وشظايا الخلايا الميتة يمكن بالتالي إزالتها من خلال طريقة الترسيب هذه (الشكل 1F).
4. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO₂ لمدة 24 ساعة.
   ملاحظة: تحت المجهر ، كان قطر EBs حوالي 500 ميكرومتر ، وكانت الحافة شفافة ، مما يشير إلى تشكل طبقة ظهارية عصبية.
5. انتقل إلى الخطوة التالية.

7. التضمين في مصفوفة الغشاء السفلي (الأيام 7-10)

1. ضع مصفوفة الغشاء في ثلاجة 4 درجات مئوية لمدة 60 دقيقة مقدما حتى تذوب. احسب مقدار المصفوفة المطلوبة مقدما. تم تضمين ما يقرب من 100 EBs في 1.5 مل من مصفوفة الغشاء.
2. قم بتشغيل الضوء الناعم الجانبي وأطفئ مصدر الضوء الموجود أعلى وحدة التحكم.
3. حافظ على مصفوفة الغشاء على الجليد لمنع التصلب.
4. انقل كمية صغيرة من EBs إلى طبق 60 مم يحتوي على وسط تمدد طازج (الجدول التكميلي 3) في كل مرة. قلل من عدد EBs لتسهيل إزالة EB واحد.
5. ثم ، استخدم لوحة التصاق منخفضة جديدة من 6 آبار. امتص EB واحد (يحتوي على وسط 10 ميكرولتر تقريبا) مع طرف ماصة عريض التجويف 200 ميكرولتر (انظر جدول المواد) في كل مرة ، ثم أضفه إلى أسفل اللوحة المكونة من 6 آبار لصنع قطرات. استخدم خمس قطرات لكل بئر.
   ملاحظة: المفتاح هو ضبط نطاق مسدس الماصة إلى 50 ميكرولتر وامتصاص EB ، ثم الرجوع إلى تشغيل الشكل 1E. عندما يستقر EB على تجويف طرف الماصة ، يلمس الطرف بسرعة قاع البئر من اللوحة ويدفع ما يقرب من 10 ميكرولتر من السائل لتشكيل قطرة.
6. أضف 15 ميكرولتر من مصفوفة الغشاء إلى كل قطرة تحتوي على EB واخلطها بسرعة. قم بتضمين كرة EB في وسط القطرة.
   ملاحظة: يجب عدم شفط EBs بطرف ماصة قياسي، مما يؤدي إلى تلف EB. يجب استخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر عريض التجويف بدلا من ذلك.
7. ضع الصفيحة المكونة من 6 آبار في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، وقم بتصلب قطرات مصفوفة الغشاء التي تحتوي على EBs.
8. أضف 3 مل من وسيط التمدد إلى كل بئر وقم بتفجير EBs المضمنة في المصفوفة بلطف لتعليقها.
9. احتضان في 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO₂ لمدة 3 أيام.
   ملاحظة: إذا لوحظ ظهور التبرعم على سطح EB ، فهذا يعني أن ظهارة عصبية موسعة قد تشكلت¹⁶.

8. النضج العضوي (أيام 10-40)

1. قم بإزالة الوسط الأصلي برفق ، وأضف 3 مل من وسط النضج (الجدول التكميلي 4) إلى كل بئر.
2. ضع الصفيحة العضوية على شاكر أفقي في حاضنة 37 درجة مئوية.
3. استمر في تدوير الثقافة أفقيا. اضبط الخلاط على السرعة المناسبة.
   ملاحظة: عند زراعة المواد العضوية الدماغية على صفيحة من 6 آبار ، تكون قوة الطرد المركزي النسبية (RCF) البالغة 0.11808 × g أكثر ملاءمة ، وفقا للشركة المصنعة للشاكر الأفقي (انظر جدول المواد). وفقا للتحويل بين قوة الطرد المركزي النسبية وسرعة الدوران ^17,18 ، RCF =^{1.118 × 10−5} × R × دورة في الدقيقة ² ، حيث RCF = قوة الطرد المركزي النسبية (g) ، دورة في الدقيقة = دورات في الدقيقة (ص / دقيقة) ، و R = نصف قطر الدوران (سم) ، المعروف أيضا باسم رمي الاهتزاز. قد تكون معلمات رمي الاهتزاز للهزازات المختلفة مختلفة. لذلك ، يمكن تقدير أن سرعة الدوران هي دورة في الدقيقة = 299 × (RCF / R) ^1/2.
4. تغيير وسط النضج الطازج كل 2-3 أيام.
5. بعد 20-30 يوما ، قم تدريجيا بزراعة المواد العضوية الدماغية حتى النضج.
   ملاحظة: خلال هذه الفترة، يمكن استخدام المواد العضوية للتجارب والكشف، مثل الكشف عن العلامات العصبية وتسلسل النسخ¹⁹،^20،21.

9. الأقسام المجمدة والتألق المناعي للعضويات الدماغية

1. إصلاح المواد العضوية في 4٪ بارافورمالدهيد في 4 درجة مئوية لمدة 16 ساعة ثم غسلها 3x مع 1x PBS لمدة 10 دقائق في كل مرة.
2. قم بإزالة PBS ، واغمر المواد العضوية في 30٪ من السكروز عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
3. قم بتضمين المواد العضوية في 10٪ / 7.5٪ جيلاتين / سكروز عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ثم نقلها بسرعة إلى قالب التضمين.
4. أضف الثلج الجاف إلى الإيثانول بنسبة 100٪ لإعداد ملاط الثلج الجاف / الإيثانول ، وضع العينات العضوية فيه للتجميد السريع.
5. قم بتخزين العينات المجمدة في ثلاجة -80 درجة مئوية. عند الحاجة ، قم بعمل أقسام مجمدة بسماكة 20 ميكرومتر.
6. راجع الخطوات من 5.3.إلى 5.5. للتألق المناعي. استخدم الجسم المضاد PAX6 لتسمية الخلايا السلفية القمية ، والجسم المضاد TUJ1 (انظر جدول المواد) لتسمية الخلايا العصبية²²،^{23،24 ،} و DAPI لتلطيخ الحمض النووي النووي.

النتائج

وقد حفزت هذه الدراسة iPSCs (الشكل 2B) على الدخول في عضويات دماغية (الشكل 2C). عبرت EBs المزروعة في المرحلة المبكرة عن علامة OCT4 (الشكل 2A) ، والتي تشير إلى تعدد القدرات الجيد. في المرحلة اللاحقة ، تطورت EBs إلى عضويات دماغية ناضجة (الشكل 2D

Discussion

تفتح المواد العضوية الدماغية آفاقا جديدة للبحوث الطبية. العديد من التطبيقات المفيدة لهذه التكنولوجيا بدأت للتو في استكشافها²⁸. وجد هذا البحث أن نتائج تسلسل النسخ للعضويات الدماغية المريضة وراثيا والمواد العضوية الدماغية الطبيعية يمكن أن تعكس الاختلافات بين المرض والصحة. عل?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Filter	NEST Biotechnology, China	331001
1000 μL wide-bore pipette tip	Thermo Fisher Scientific, USA	9405163
200 μL wide-bore pipette tip	Thermo Fisher Scientific, USA	9405020
2-Mercaptoethanol	Merck, Germany	8057400005
4% Paraformaldehyde	Servicebio, China	G1101
6-well low adhesion plate	NEST Biotechnology, China	703011	It is used for EBs suspension cultures
Aaccute cell detachment solution	STEMCELL Technologies, Canada	07920	It is used to digest iPSC into single cells.
AggreWell800 24-well	STEMCELL Technologies, Canada	34811	Microporous culture plate for EBs preparation.
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies, Canada	07010	Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion
B27-vit. A supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	12587010
bFGF	Peprotech, USA	GMP100-18B
BSA	Beyotime Biotechnology, China	ST025
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5810 R	It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates.
Cover glass	Shitai Laboratory Equipment, China	10212020C
DAPI	Beyotime Biotechnology, China	C1002	Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm.
DMEM-F12	Thermo Fisher Scientific, USA	11330032
ES-quality FBS	Thermo Fisher Scientific, USA	10270106
Ficoll Paque	General Electric Company, USA	17-5442-02	Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method.
Gelatin	Sangon Bioteach, China	A609764
Glutamax supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	35050061
Glutamax supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	17504044
Goat anti-Chicken IgY  secondary antibody	Abcam, UK	ab150171	Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Mouse IgG secondary antibody	Abcam, UK	ab150120	Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody	Abcam, UK	ab150077	Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution.
Heparin	Merck, Germany	H3149
Horizontal shaker	Servicebio, China	DS-H200	Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland).
Insulin	Merck, Germany	I9278-5ML
KOSR	Thermo Fisher Scientific, USA	10828028
Matrigel	Corning, USA	354277	Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature.
MEM-NEAA	Thermo Fisher Scientific, USA	11140050
mTeSR1	STEMCELL Technologies, Canada	85850	iPSC culture medium
N2 supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	17502048
Neurobasal	Thermo Fisher Scientific, USA	21103049
OCT4 primary antibody	Abcam, UK	ab19857	Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution.
Pathological frozen slicer	Leica, Germany	Leica CM1860
PAX6 primary antibody	Abcam, UK	ab78545	Host: Mouse. Use at 1:100 dilution.
PBS	STEMCELL Technologies, Canada	37350
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, USA	15140122
PSC dissociation solution	Beijing Saibei Biotechnology, China	CA3001500	Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage.
Sendai Reprogramming Kit	Thermo Fisher Scientific, USA	A16518	Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit.
Slide Glass	Shitai Laboratory Equipment, China	188105W
Soft light lamp	NUT	NUT	A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation.
STEMdiff Cerebral Organoid Kit	STEMCELL Technologies, Canada	8570	Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium.
STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit	STEMCELL Technologies, Canada	8571	Maturation Medium
Sucrose	Sangon Bioteach, China	A502792
Triton X-100	Merck, Germany	X100
TUJ1 primary antibody	Abcam, UK	ab41489	Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution.
Vaseline	Sangon Bioteach, China	A510146
Y-27632	STEMCELL Technologies, Canada	72302	Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS.
Weblink
Raw sequencing data	Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences	GSA-Human: HRA002430	https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/