הקלה על תרבית אורגנואידית מוחית באמצעות תאורת אור רך לרוחב

Summary

אורגנואידים מוחיים מספקים הזדמנויות חסרות תקדים לחקר התפתחות איברים ופתולוגיה של מחלות אנושיות. למרות שהצלחה רבה הושגה עם מערכות תרבית אורגנואידיות מוחיות, עדיין ישנם קשיים תפעוליים ביישום טכנולוגיה זו. הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך אורגנואידי מוחי המאפשר שינוי בינוני והעברת אורגנואידים.

Abstract

נכון לעכשיו, טכנולוגיית תרבית אורגנואידית מוחית עדיין מסובכת לתפעול וקשה ליישום בקנה מידה גדול. יש צורך למצוא פתרון פשוט ומעשי. לכן, פרוטוקול אורגנואידים מוחי אפשרי יותר מוצע במחקר הנוכחי. כדי לפתור את אי הנוחות הבלתי נמנעת בשינוי בינוני והעברה אורגנואידית בשלב מוקדם, המחקר הנוכחי מייעל את טכנולוגיית הפעולה על ידי יישום העיקרון ההנדסי. מנורת אור רכה אומצה כדי להאיר לרוחב את דגימות הגוף העוברי (EB), מה שמאפשר לראות את ה-EBs בעין בלתי דרך אפקט ההשתקפות המפוזרת המשופרת. באמצעות העיקרון של זרימה משנית שנוצרת על ידי סיבוב, האורגנואידים מתאספים לכיוון מרכז הבאר, מה שמקל על פעולת השינוי הבינוני או העברת האורגנואידים. בהשוואה לתא המפוזר, הגוף העוברי מתיישב מהר יותר בפיפטה. באמצעות תופעה זו, ניתן להסיר ביעילות את רוב התאים החופשיים ואת שברי התאים המתים בצורה פשוטה, ולמנוע מ-EBs לגרום נזק מצנטריפוגה. מחקר זה מקל על הפעולה של תרבית אורגנואידים מוחית ומסייע לקדם את היישום של אורגנואידים במוח.

Introduction

בהשוואה למערכות תרביות דו-ממדיות (דו-ממדיות), למערכות תרביות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) יש מספר יתרונות, כולל שכפול אמיתי ושחזור יעיל של מבנים מורכבים של איברים מסוימים¹. לכן, אורגנואידים מוחיים הם אחת משיטות העזר החשובות לתחומי המחקר של התפתחות המוח האנושי ומחלות², בדיקת תרופות וטיפול בתאים.

גידול אורגנואידים מוחיים בשיטת ההשעיה המסתובבת תורם להתפתחותם ולהבשלתם³. למרות שמערכות תרביות אורגנואידיות מוחיות זכו להצלחה רבה, הן עדיין מתמודדות עם אתגרים קריטיים המגבילים את יישומן. לדוגמה, טיפוח ידני כרוך בשלבי מניפולציה מסובכים ומציג מכשולים להשגת יישומים בקנה מידה גדול. בנוסף, בכל שלב התפתחותי בתרבית האורגנואידים המוחיים, יש צורך בשינויים במדיה ובציטוקינים שונים⁴. עם זאת, בשלב המוקדם, האורגנואידים או ה- EBs הם בעלי גדלים זעירים (כ-200 מיקרומטר עד 300 מיקרומטר) והם כמעט בלתי נגישים מבחינה חזותית ללא מנגנון מתאים. באופן בלתי נמנע, כמות מסוימת של דגימות אורגנואידיות יקרות נשטפות כאשר המדיום משתנה. טכניקות רבות נחקרו כדי להתגבר על כך בסוגים אחרים של תרביות אורגנואידיות, וכמה דוגמאות כוללות טבילה של שבבי אורגנואידים שלמים במדיום תרבית למשך 3 ימים ללא התערבות⁵; הוספת מדיום טרי דרך הכיסוי לאחר שהמדיום הישן נספג באמצעות נייר סופג⁵; או החלת צינורות מיקרופלואידיים מורכבים להחלפת נוזלים ^6,7,8. מכשול נוסף שנתקל בו בשלב המוקדם של גידול האורגנואידים הוא הקושי להשיג תצפיות ישירות בעין בלתי, מה שעלול לגרום לפעולות לקויות שמובילות לנזק ואובדן אורגנואידים במהלך שלבי העברת האורגנואידים. לכן, יש צורך להקים פרוטוקול ריאלי יותר המאפשר שינוי בינוני והעברת אורגנואידים כדי ליצור אורגנואידים.

פעולה מותאמת המתאימה המבוססת על עקרונות הנדסיים מוצעת כדי להתגבר על בעיות אלה, אשר באופן משמעותי ונוח מקל על הליכים אורגנואידים רבים. בטבע, כאשר השמש זורחת לתוך בית דרך מרווח חלון, העין הבלתי יכולה לראות את האבק רוקד בקרן האור. בשל ההשתקפות המפוזרת של אור השמש על האבק, חלק מהאור נשבר לתוך גלגל העין כדי לייצר תמונה חזותית. בהשראת העיקרון של תופעה זו ^9,10, מחקר זה יצר מנורת אור רכה והאיר את ה- EBs לרוחב. נמצא כי EBs יכולים להיות ברורים מבחינה ויזואלית מבלי להשפיע על היקף הצפייה. זרימה משנית המצביעה על המרכז נוצרת בנוזל על ידי סיבוב צלחת התרבית עקב זרמי אדי¹¹. EBs מפוזרים במקור מצטברים במרכז הצלחת. בהתבסס על זה, ועל התופעה כי מהירות השקיעה של אורגנואידים היא מהירה יותר מזו של תאים, מוצעת שיטת פעולה קלה של שינוי בינוני והעברה אורגנואידית ללא צנטריפוגה. האורגנואידים במדיום התרבית יכולים להיות מופרדים ביעילות מתאים חופשיים ושברי תאים מתים באמצעות פעולת העברה זו.

כאן, פרוטוקול קל לתפעול מוצע כדי ליצור אורגנואידים מוחיים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. טכנולוגיית הפעולה עברה אופטימיזציה על ידי יישום העיקרון ההנדסי, מה שהופך את הפעולות בתרבות התלת-ממדית לפשוטות וישימות כמו אלה שבתרבות הדו-ממדית. שיטת החלפת הנוזלים המשופרת ופעולת העברת האורגנואידים מועילות גם לסוגים אחרים של תרבית אורגנואידים ולתכנון של מכונות תרבית אוטומטיות.

Protocol

הפרוטוקול נערך בעקבות הצהרת הלסינקי. האישור ניתן על ידי ועדת האתיקה של בית החולים המסונף השלישי של האוניברסיטה הרפואית של גואנגג'ואו (סקירה רפואית ואתית [2021] מס '022). לפני הניסוי, כל מדיום הוכן על פי הנוסחה¹² של יורגן א. קנובליך (טבלאות משלימות 1-4), או שנעשה שימוש בערכת אורגנואידים מוחית זמינה מסחרית (ראו טבלת חומרים). ה-iPSCs ששימשו במחקר זה הוקמו בעבר על ידי המעבדה שלנו וקיבלו פטור מושכל. ה-SCA3-iPSCs נוצרו מנקבה בת 31 של נקבת אטקסיה ספינוקרבלרית מסוג אטקסיה מסוג 3 (SCA3) שעברה גנוטיפ של נקבה בעלת 26/78 חזרות CAG בגן ATXN3¹³ (איור משלים 1A). ה-iPSCs האנושיים הרגילים שהוזכרו במאמר קודם נבחרו כ-NC-iPSCs¹⁴, והגן ATXN3 זוהה כבעל חזרות CAG של 14/14 (איור משלים 1B).

1. הכנת תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs)

1. לאסוף 3 מ"ל של דם היקפי על ידי venipuncture עם הסכמה מדעת של מתנדבים וחולים.
2. לבודד תאים חד-גרעיניים בדם היקפי על פי שיטת Ficoll-Paque¹⁵.
3. קבעו iPSCs בהתאם לפרוטוקול של ערכת התכנות מחדש של סנדאי (ראו טבלת חומרים).
   1. תרבית את ה-iPSCs עם תווך mTeSR1 בצלחות פטרי 35 מ"מ המכוסות במטריגל (מטריצת קרום מרתף, ראו טבלת חומרים). לשנות את המדיום כל יום. צפיפות הצמיחה של iPSC לא תעלה על 75%.
   2. לעכל את התאים עם תמיסת דיסוציאציה של PSC (ראה טבלת חומרים) ולחלק אותם בתת-תרבות ביחס של 1:5 כל 3-5 ימים.
      אזהרה: וירוס סנדאי משמש כאן. יש להפעיל אותה בארון הבטיחות הביולוגית, ולנקוט באמצעי הגנה עצמית. זה צריך להיות ברור אם זה יכול לשמש באופן חוקי במדינה המקומית. יש להקפיד על החוקים והתקנות המקומיים בתחום הבטיחות הביולוגית בעת השימוש בהם.

2. הכנת EB (ימים 0-1)

1. הסר את מדיום mTeSR1 מה- iPSCs עם פיפטה ושטף אותו 2x עם 1 מ"ל של 1x PBS.
2. הסר את ה- PBS עם פיפטה, והוסף 300 μL של תמיסת ניתוק תאים (ראה טבלת חומרים) כדי לעכל את ה- iPSCs לתאים בודדים למשך 3-4 דקות ב- 37 ° C.
3. בצעו החייאה של התאים ב-2 מ"ל של מדיום היווצרות EB (טבלה משלימה 1) ולאחר מכן עשו צנטריפוגה על הדגימה למשך 5 דקות ב-300 x גרם (טמפרטורת החדר).
4. תכננו מראש את צלחת 24 הקידוחים המיוחדת עם תמיסת שטיפה נגד הדבקות (500 μL/well) למשך 5 דקות (ראו טבלת חומרים).
   הערה: תמיסת שטיפה נגד דבקות חיונית להיווצרות אופטימלית של EB וספרואידים.
5. בצעו החייאה של התאים במדיום היווצרות EB המכיל Y-27632 (ריכוז סופי, 10 μM, ראו טבלת חומרים), עם צפיפות תאים של 1.5 x 10⁶ תאים/מ"ל.
6. הסירו את תמיסת השטיפה נגד הדבקות, ושטפו כל באר ב-2 מ"ל של מדיום ליצירת EB.
7. הוסיפו את התאים ללוחות המיוחדים של 24 בארות בצפיפות של 3 x 10⁶ תאים/באר (איור 1A, משמאל).
   הערה: בדרך כלל, ניתן להכין 300 EBs בכל באר. שיטה זו יכולה להכין כמויות גדולות של EBs באותו גודל.
8. צנטריפוגה הצלחת ב 100 x g במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. פזרו באופן אחיד את התאים בכל תא בתחתית הצלחת (איור 1A, מימין).
   הערה: אם אין צנטריפוגה מתאימה, ניתן גם למקם את הצלחת ישירות לתוך האינקובטור לתרבית סטטית, אך זמן ההיווצרות של כדור ה- EB יהיה מספר שעות מאוחר יותר מזה תחת צנטריפוגה רגילה.
9. דגירה של הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 24 שעות. אם צנטריפוגה לא שימשה בשלב הקודם, דגירה במשך 36 שעות. שמור על המדגם יציב, ואל תוציא אותו מהאינקובטור בתקופה זו.

3. הכנת מנורת האור הרכה (יום 1)

1. יש להשתמש בלוח אקריליק שקוף בעובי של 0.3-0.5 ס"מ בגודל של נייר A5. הדבק רפידות לבנות בחלק הקדמי והאחורי של הצלחת האקרילית.
   1. התקינו שורה של נורות LED לבנות על קצה הצלחת, כך שהפנסים יוכלו להיכנס מהצד של הלוחית האקרילית ואז לירות החוצה במקביל (איור משלים 2A-F, איור 1B).
      הערה: מכיוון שקטריהם של EBs בשלב המוקדם הם כ-200 מיקרומטר עד 300 מיקרומטר, קשה לצפות בהם בבירור בעין בלתי מתחת למנורה הפלואורסצנטית של ספסלים נקיים. לעומת זאת, הודות לשיפור ההשתקפות המפוזרת, אנו יכולים לזהות את ה-EBs בבירור על-ידי שימוש באור רך המואר לרוחב (איור 1B, C). צלחת של 6 בארות מומלצת לתרביות EB בניסויים הבאים. עם זאת, כדי להראות טוב יותר את האפקט החזותי של אור רך, כלים משמשים לעתים לצילום תמונות וסרטונים במחקר זה במקום צלחות, אז אנא אל תבינו לא נכון. מנורת התאורה הרכה המוארת לרוחב יכולה לשמש גם לצלחת בעלת 6 הבארות.

4. העברת EB והחלפה בינונית (ימים 2-5)

1. הכינו צלחת הידבקות נמוכה חדשה בת 6 בארות, והוסיפו 2 מ"ל של מדיום היווצרות EB לכל באר.
2. הסר את ה- EBs יחד עם המדיום עם קצה פיפטה רחב של 1000 μL (ראה טבלת חומרים) והעביר אותם ללוחית הידבקות נמוכה של 6 בארות (כ-100 EBs/well).
   הערה: תהליך הפעולה מאמץ מנורת אור רכה (המוזכרת בשלב 3.) כדי להפוך את ה- EBs לקלים יותר לצפייה. כבה מקורות אור פנימיים אחרים כדי לשפר את האפקט החזותי של האור הרך.
3. החלף באותו נפח של מדיום טרי ליצירת EB בכל יום. השתמש בזרימה המשנית כדי לאסוף את ה- EBs למרכז ולשנות את המדיום.
   1. שאפו את המדיום הישן על ידי צנרת לקצה הבאר באיטיות. אל תמצוץ חזק מדי; אחרת, ה- EBs יוסרו יחד. לאחר מכן, הוסיפו מדיום רענן להחייאת ה-EBs.
      הערה: הזרימה המשנית העיקרית (איור 1D). לגרום לזרימת מערבולת על ידי סיבוב המנה לאורך מסלול מעגלי. בשל זרימת המערבולת, זרימה משנית מושרית המופנית לכיוון המרכז. ה- EBs או האורגנואידים מתכנסים למרכז הבאר בשל הזרימה המשנית הנוצרת באמצעות סיבוב, ולאחר מכן ניתן לבצע שינוי בינוני או העברה עוברית בקלות.

5. בדיקת פלוריפוטנטיות על ידי תיוג עם סמן פלוריפוטנטיות OCT4 (יום 4)

הערה: כאשר הקוטר של ה- EBs גדול מ- 300 מיקרומטר, קח מספר EBs עבור צביעת סמן OCT4 immunofluorescence כדי לזהות את הפלוריפוטנטיות שלהם.

1. תקן את ה- EBs ב- 4% paraformaldehyde ב- 4 ° C למשך 30 דקות, ולאחר מכן שטיפה ב 1x PBS 3x במשך 10 דקות בכל פעם.
2. העבר את ה- EBs ל- PBS בטמפרטורת החדר המכיל 0.3% Triton X-100 ו- 3% BSA למשך 2 שעות, ולאחר מכן שטיפה ב- PBS 3x למשך 10 דקות בכל פעם.
   הערה: לאחר טיפול ב-Triton X-100, ה- EBs צפים על פני השטח הנוזליים וניתן לשאוב אותם בקלות עם הנוזל במהלך הניקוי. מומלץ לפעול תחת סטריאומיקרוסקופ.
3. דיללו את הנוגדן הראשוני OCT4 (ראו טבלת חומרים) עם 1 מ"ל של 1x PBS המכיל 1% BSA ביחס של 1:200 והוסיפו ל-EBs לדגירה ב-4 מעלות צלזיוס במהלך הלילה, ואז שטפו ב-PBS 3x למשך 10 דקות בכל פעם.
4. דיללו את הנוגדן המשני המתאים (ראו טבלת חומרים) עם 1x PBS בשעה 1:500 והוסיפו 1 מ"ל ל-EBs.
5. לאחר דגירה בטמפרטורת החדר במשך 2 שעות, לשטוף את התאים ב 1x PBS 3x במשך 10 דקות בכל פעם.
6. הסר את ה- PBS, הוסף 2 מ"ל של תמיסת PBS 1x המכילה 1 מיקרוגרם / מ"ל DAPI, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ולאחר מכן לשטוף ב- PBS 3x למשך 10 דקות בכל פעם.
7. הזיזו את ה-EB המכיל כמות קטנה של נוזל על המגלשה, אטמו את המגלשה בזכוכית כיסוי המצופה בג'לי נפט זמין מסחרית (ראו טבלת חומרים) בקצה, ולאחר מכן צפו ואספו את התמונה תחת המיקרוסקופ הפלואורסצנטי הקונפוקלי.
   הערה: ביטוי OCT4 מייצג EB pluripotency¹². כאשר הביטוי של OCT4 הוא פחות מ -90%, יש להשליך את ה- EBs, ויש להכין את ה- EBs שוב.

6. אינדוקציה עצבית (ימים 5-7)

1. הכינו צלחת חדשה בת 6 בארות עם הידבקות נמוכה, והוסיפו 3 מ"ל של מדיום אינדוקציה עצבי (טבלה משלימה 2) לכל באר.
2. הפעילו את האור הרך לרוחב (המוזכר בשלב 3)וכבו מקורות אור פנימיים אחרים.
3. העבר את ה- EBs ללוח 6 הבארות עם תוספת של מדיום אינדוקציה עצבית (~ 100 EBs / באר). הוסף כמה שפחות מהמדיום המקורי לבאר החדשה.
   הערה: הצג מיומנויות פשוטות של העברת אורגניזם. באופן טבעי, תחת כוח הכבידה ועם צפיפות גבוהה יחסית מהתווך, ה-EBs המחודשים ישקעו בהדרגה על ידי יישום הפעולה המוצגת באיור 1E. לפיכך, ניתן להעביר את ה- EBs בנוחות. מאחר שבהשוואה ל-EBs, תאים חופשיים ושברי תאים מתים שוקעים לאט יותר, ניתן להסיר את רוב התאים החופשיים ואת שברי התאים המתים באמצעות שיטת שקיעה זו (איור 1F).
4. דגירה של הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 24 שעות.
   הערה: תחת המיקרוסקופ, הקוטר של ה- EBs היה בערך 500 מיקרומטר, והקצה היה שקוף, מה שמעיד על כך שנוצרה שכבה נוירואפיתליאלית.
5. המשך לשלב הבא.

7. הטמעה במטריצת קרום המרתף (ימים 7-10)

1. מקם את מטריצת הממברנה במקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות מראש כדי להתמוסס. חשב את כמות המטריצה הנדרשת מראש. כ-100 EBs הוטמעו ב-1.5 מ"ל של מטריצת הממברנה.
2. הדליקו את האור הרך לרוחב וכבו את מקור האור בחלק העליון של הקונסולה.
3. שמור את מטריצת הממברנה על קרח כדי למנוע התמצקות.
4. מעבירים כמות קטנה של EBs למנה של 60 מ"מ המכילה מדיום הרחבה טרי (טבלה משלימה 3) בכל פעם. הקטן את מספר ה- EBs כדי להקל על הסרת EB יחיד.
5. לאחר מכן, השתמש בצלחת הידבקות נמוכה חדשה של 6 בארות. מוצצים EB יחיד (המכיל כ-10 μL בינוני) עם קצה פיפטה רחב של 200 μL (ראו טבלת חומרים) בכל פעם, ולאחר מכן מוסיפים אותו לתחתית הצלחת בעלת 6 הבארות כדי ליצור טיפות. השתמש בחמש טיפות לכל באר.
   הערה: המפתח הוא להתאים את הטווח של אקדח הפיפטה ל-50 μL ולמצוץ EB, ולאחר מכן להתייחס לפעולה של איור 1E. כאשר ה-EB מתיישב לבור של קצה הפיפטה, הקצה נוגע במהירות בתחתית הבאר של הצלחת ודוחף החוצה כ-10 מיקרול של נוזל כדי ליצור טיפה.
6. הוסף 15 μL של מטריצת הממברנה לכל טיפה המכילה EB וערבב אותה במהירות. הטמיעו את כדור ה-EB במרכז הטיפה.
   הערה: אסור לשאוף ל-EBs עם קצה פיפטה סטנדרטי, מה שפוגע ב-EB. יש להשתמש במקום זאת בקצה הפיפטה בעל הקידוח הרחב של 200 μL.
7. ממקמים את צלחת 6 הקידוחים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, וממצקים את טיפות מטריצת הממברנה המכילות EBs.
8. הוסף 3 מ"ל של מדיום ההרחבה לכל באר ופוצץ בעדינות את ה- EBs המוטבעים במטריצה כדי להשעות אותם.
9. דגירה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ למשך 3 ימים.
   הערה: אם נצפה ניצנים על פני השטח של EB, זה אומר שנוצר נוירו-פיתליום מורחב¹⁶.

8. התבגרות אורגנואידית (ימים 10-40)

1. הסר בעדינות את המדיום המקורי, והוסף 3 מ"ל של מדיום הבשלה (טבלה משלימה 4) לכל באר.
2. הניחו את הצלחת האורגנואידית על שייקר אופקי באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
3. המשך לסובב את התרבות אופקית. הגדר את השייקר למהירות המתאימה.
   הערה: בעת גידול אורגנואידים מוחיים על צלחת של 6 בארות, כוח צנטריפוגלי יחסי (RCF) של 0.11808 x g מתאים יותר, על פי היצרן של השייקר האופקי (ראה טבלת חומרים). על פי ההמרה בין הכוח הצנטריפוגלי היחסי למהירות הסיבוב^17,18, RCF = 1.118 x 10⁻⁵ × R × סל"ד², כאשר RCF = כוח צנטריפוגלי יחסי (g), סל"ד = סיבובים לדקה (r/min), ו- R = רדיוס סיבוב (cm), הידוע גם בשם זריקת טלטולים. הפרמטרים של זריקת הרעידות של שייקרים שונים עשויים להיות שונים. לכן, ניתן להעריך כי מהירות הסיבוב היא סל"ד = 299 x (RCF / R) ^1/2.
4. שנה את מדיום ההתבגרות הטרי כל 2-3 ימים.
5. לאחר 20-30 יום, בהדרגה תרבית את האורגנואידים המוחיים לבגרות.
   הערה: במהלך תקופה זו, ניתן להשתמש באורגנואידים לניסויים וזיהוי, כגון זיהוי סמנים עצביים וריצוף תעתיק 19,20,21.

9. מקטעים קפואים ואימונופלואורסצנציה של אורגנואידים מוחיים

1. תקן את האורגנואידים ב 4% paraformaldehyde ב 4 ° C במשך 16 שעות ולאחר מכן לשטוף אותם 3x עם 1x PBS במשך 10 דקות בכל פעם.
2. הסר את ה- PBS, וטבול את האורגנואידים ב 30% סוכרוז ב 4 ° C לילה.
3. הטמיעו את האורגנואידים ב-10%/7.5% ג'לטין/סוכרוז ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת ולאחר מכן העבירו אותם במהירות לתבנית ההטבעה.
4. הוסיפו קרח יבש ל-100% אתנול כדי להכין קרח יבש/אתנול, והניחו בו את הדגימות האורגנואידיות להקפאה מהירה.
5. אחסן את הדגימות הקפואות במקפיא של −80 מעלות צלזיוס. בעת הצורך, לעשות חלקים קפואים בעובי של 20 מיקרומטר.
6. עיין בשלבים 5.3.-5.5. עבור אימונופלואורסצנציה. השתמש בנוגדן PAX6 כדי לסמן תאי אב אפיקליים, בנוגדן TUJ1 (ראה טבלת חומרים) כדי לתייג תאים עצביים ^22,23,24, וב-DAPI עבור צביעת DNA גרעינית.

תוצאות

המחקר הנוכחי גרם ל-iPSCs (איור 2B) לתוך אורגנואידים מוחיים (איור 2C). ה-EBs שטופחו בשלב המוקדם ביטאו את סמן OCT4 (איור 2A), שהצביע על פלוריפוטנטיות טובה. בשלב מאוחר יותר, ה-EBs התפתחו לאורגנואידים מוחיים בוגרים (איור 2D). המחקר טיפח iPSCs מאנשי...

Discussion

אורגנואידים מוחיים פותחים אפיקים חדשים למחקר רפואי. יישומים שימושיים רבים של טכנולוגיה זו מתחילים להיחקר רק²⁸. מחקר זה מצא כי תוצאות ריצוף השעתוק של אורגנואידים מוחיים חולים גנטית ואורגנואידים מוחיים רגילים יכולות לשקף את ההבדלים בין מחלה לבריאות. לדוגמה, תוצאות ניתוח הנתונ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Filter	NEST Biotechnology, China	331001
1000 μL wide-bore pipette tip	Thermo Fisher Scientific, USA	9405163
200 μL wide-bore pipette tip	Thermo Fisher Scientific, USA	9405020
2-Mercaptoethanol	Merck, Germany	8057400005
4% Paraformaldehyde	Servicebio, China	G1101
6-well low adhesion plate	NEST Biotechnology, China	703011	It is used for EBs suspension cultures
Aaccute cell detachment solution	STEMCELL Technologies, Canada	07920	It is used to digest iPSC into single cells.
AggreWell800 24-well	STEMCELL Technologies, Canada	34811	Microporous culture plate for EBs preparation.
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies, Canada	07010	Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion
B27-vit. A supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	12587010
bFGF	Peprotech, USA	GMP100-18B
BSA	Beyotime Biotechnology, China	ST025
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5810 R	It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates.
Cover glass	Shitai Laboratory Equipment, China	10212020C
DAPI	Beyotime Biotechnology, China	C1002	Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm.
DMEM-F12	Thermo Fisher Scientific, USA	11330032
ES-quality FBS	Thermo Fisher Scientific, USA	10270106
Ficoll Paque	General Electric Company, USA	17-5442-02	Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method.
Gelatin	Sangon Bioteach, China	A609764
Glutamax supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	35050061
Glutamax supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	17504044
Goat anti-Chicken IgY  secondary antibody	Abcam, UK	ab150171	Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Mouse IgG secondary antibody	Abcam, UK	ab150120	Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody	Abcam, UK	ab150077	Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution.
Heparin	Merck, Germany	H3149
Horizontal shaker	Servicebio, China	DS-H200	Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland).
Insulin	Merck, Germany	I9278-5ML
KOSR	Thermo Fisher Scientific, USA	10828028
Matrigel	Corning, USA	354277	Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature.
MEM-NEAA	Thermo Fisher Scientific, USA	11140050
mTeSR1	STEMCELL Technologies, Canada	85850	iPSC culture medium
N2 supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	17502048
Neurobasal	Thermo Fisher Scientific, USA	21103049
OCT4 primary antibody	Abcam, UK	ab19857	Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution.
Pathological frozen slicer	Leica, Germany	Leica CM1860
PAX6 primary antibody	Abcam, UK	ab78545	Host: Mouse. Use at 1:100 dilution.
PBS	STEMCELL Technologies, Canada	37350
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, USA	15140122
PSC dissociation solution	Beijing Saibei Biotechnology, China	CA3001500	Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage.
Sendai Reprogramming Kit	Thermo Fisher Scientific, USA	A16518	Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit.
Slide Glass	Shitai Laboratory Equipment, China	188105W
Soft light lamp	NUT	NUT	A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation.
STEMdiff Cerebral Organoid Kit	STEMCELL Technologies, Canada	8570	Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium.
STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit	STEMCELL Technologies, Canada	8571	Maturation Medium
Sucrose	Sangon Bioteach, China	A502792
Triton X-100	Merck, Germany	X100
TUJ1 primary antibody	Abcam, UK	ab41489	Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution.
Vaseline	Sangon Bioteach, China	A510146
Y-27632	STEMCELL Technologies, Canada	72302	Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS.
Weblink
Raw sequencing data	Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences	GSA-Human: HRA002430	https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/