横方向ソフトライト照明 による 大脳オルガノイド培養の促進

要約

脳オルガノイドは、臓器の発達とヒトの疾患病理を研究するための前例のない機会を提供します。脳オルガノイド培養系では大きな成功を収めていますが、この技術を適用するには運用上の困難が依然としてあります。本プロトコールは、培地交換およびオルガノイド移動を容易にする大脳オルガノイド手順を記述する。

要約

現在、大脳オルガノイド培養技術は依然として操作が複雑であり、大規模に適用することは困難である。シンプルで実用的な解決策を見つける必要があります。したがって、より実現可能な脳オルガノイドプロトコルが本研究において提案されている。培地交換やオルガノイド移動における避けられない不便さを早期に解決するため、現在の研究では工学原理を応用して運用技術を最適化しています。軟質ライトランプを採用して胚様体(EB)サンプルを横方向に照らし、拡散反射効果を高めてEBを肉眼で見ることができました。回転によって生成される二次流れの原理を使用して、オルガノイドは井戸の中心に向かって集まり、培地交換またはオルガノイド移動の動作を容易にする。分散した細胞と比較して、胚様体はピペット内でより速く沈降する。この現象を使用すると、ほとんどの遊離細胞および死細胞断片を簡単な方法で効果的に除去することができ、EBが遠心分離による損傷を被るのを防ぐことができる。この研究は、脳オルガノイド培養の操作を容易にし、脳オルガノイドの適用を促進するのに役立つ。

概要

2次元(2D)培養系と比較して、3次元(3D)培養系は、特定の器官の真の複製および複雑な構造の効率的な再生を含むいくつかの利点を有する¹。したがって、脳オルガノイドは、ヒトの脳の発達や疾患²、薬物スクリーニング、細胞治療などの研究分野にとって重要な補助方法の一つである。

回転懸濁法によって大脳オルガノイドを培養することは、それらの発達および成熟に資する³.脳オルガノイド培養系は大きな成功を収めていますが、依然としてその適用を制限する重大な課題に直面しています。例えば、手作業による栽培は複雑な操作工程を伴い、大規模な施用を実現する上での障害となります。さらに、脳オルガノイドの培養における各発達段階では、異なる培地およびサイトカインの変化が必要である⁴。しかし、初期段階では、オルガノイドまたはEBは小さなサイズ(約200μm〜300μm)を有し、適切な装置なしではほとんど視覚的にアクセスできない。必然的に、培地を交換すると、一定量の貴重なオルガノイドサンプルが洗い流されます。他の種類のオルガノイド培養においてこれを克服するために多くの技術が探求されており、いくつかの例には、オルガノイドチップ全体を介入なしに3日間培養培地に浸漬することが含まれる⁵;古い媒体が吸収紙⁵を用いて吸収された後、カバースリップを通して新鮮な媒体を添加するステップと、または流体交換のために複雑なマイクロ流体パイプラインを適用する^6,7,8。オルガノイド培養の初期段階で遭遇するもう一つの障害は、肉眼で直接観察を達成することの難しさであり、オルガノイド移送ステップ中にオルガノイドの損傷および損失につながる貧弱な操作を引き起こす可能性がある。したがって、オルガノイドを生成するための培地交換およびオルガノイド移動を容易にする、より実現可能なプロトコルを確立する必要がある。

これらの問題を克服するために、工学原理に基づく対応する最適化された操作が提案され、これは多くのオルガノイド手順を有意かつ便利に容易にする。自然界では、太陽が窓の隙間から家に照らされると、肉眼では光線の中で踊るほこりを見ることができます。ほこりに太陽光が拡散反射するため、一部の光が眼球に屈折して視覚的な画像が生成されます。この現象^9,10の原理に触発されて、この研究は柔らかいライトランプを作り、EBを横方向に照らしました。EB は、表示範囲に影響を与えずに視覚的に明瞭であることがわかりました。渦電流¹¹により培養プレートを回転させることにより、中心を指す二次流れが液体中に発生する。もともと分散したEBはプレートの中央に蓄積します。これに基づき、オルガノイドの沈降速度が細胞の沈降速度よりも速いという現象や、遠心分離を行わずに培地交換やオルガノイド移送の容易な操作方法が提案されている。培養液中のオルガノイドは、この移入操作によって遊離細胞および死細胞断片から効果的に分離することができる。

ここでは、ヒト多能性幹細胞から脳オルガノイドを生成するために、操作が容易なプロトコルが提案されている。操作技術は、エンジニアリング原理を適用することで最適化され、3D文化での操作を2D文化の操作と同じくらいシンプルで実現可能にしました。改善された液体交換法およびオルガノイド移送操作は、他のタイプのオルガノイド培養および自動培養機の設計にも有用である。

プロトコル

議定書はヘルシンキ宣言に従って実施された。広州医科大学第三附属病院の倫理委員会より承認を得ました(医学倫理審査[2021]第022号)。実験の前に、各培地をユルゲン・A・ノブリッヒの式¹² (補足表1〜4)に従って調製し、または市販の脳オルガノイドキットを使用した( 材料表参照)。本研究で用いたiPS細胞は、当研究室が事前に確立したものであり、十分な情報を得た上での免除を受けています。SCA3-iPSCsは、ATXN3遺伝子13に26/78 CAGリピートを保有する遺伝子型決定型化された³¹ 歳の女性脊髄小脳失調症3型(SCA3)患者から生成された(補足図1A)。前回の記事で言及した正常なヒトiPSCをNC-iPSCs14として選択し、ATXN3遺伝子は¹⁴/14 CAGリピートを有すると同定された(補足図1B)。

人工多能性幹細胞(iPSC)の作製

1. ボランティアと患者のインフォームドコンセントを得て静脈穿刺によって末梢血3mLを採取する。
2. 末梢血単核球をFicoll-Paque法¹⁵に従って単離する。
3. 仙台リプログラミングキットのプロトコルに従ってiPS細胞を作製する( 資料表参照)。
   1. mTeSR1培地を用いてiPS細胞をマトリゲル(基底膜マトリックス、 材料表参照)で覆った35mmペトリ皿中で培養する。毎日メディアを交換します。iPSCの成長密度は75%を超えてはなりません。
   2. PSC解離溶液( 材料表参照)で細胞を消化し、3〜5日ごとに1:5の比率で継代培養します。
      注意:ここではセンダイウイルスを使用しています。バイオセーフティキャビネットで操作し、自己保護対策を講じる必要があります。現地で合法的に使用できるかどうかは明確でなければなりません。使用時には、地域のバイオセーフティに関する法律や規制に厳密に従わなければなりません。

EB準備(0-1日目)

1. iPS細胞からmTeSR1培地をピペットで取り出し、1mLの1x PBSで2倍洗浄します。
2. PBSをピペットで取り出し、300μLの細胞剥離液( 材料表参照)を加えて、iPSCを37°Cで3~4分間単一細胞に消化します。
3. 細胞を2 mLのEB形成培地(補足表1)に再懸濁し、次いでサンプルを300 x g (室温)で5分間遠心分離する。
4. 特殊な24ウェルプレートを付着防止リンス液(500 μL/ウェル)で5分間前処理します( 材料表を参照)。
   注:付着防止リンス溶液は、最適なEBおよびスフェロイド形成に不可欠です。
5. 細胞密度1.5 x 106 cells/mLのY-27632(最終濃度、10 μM、 材料表参照)を含むEB形成培地^{に細胞を再} 懸濁します。
6. 付着防止リンス液を除去し、各ウェルを2mLのEB形成培地ですすいでください。
7. 特殊な24ウェルプレートに、3 x¹⁰⁶ 細胞/ウェルの密度で細胞を追加します(図1A、左)。
   注:通常、各ウェルに300EBを準備できます。この方法は、同じサイズのEBを大量に調製することができる。
8. プレートを100 x g で室温で2分間遠心分離します。プレートの下部にある各チャンバーに細胞を均一に分布させます(図1A、右)。
   注:適切な遠心分離機がない場合は、プレートをインキュベーターに直接入れて静置することもできますが、EBボールの形成時間は通常の遠心分離の場合よりも数時間遅くなります。
9. サンプルを37°Cおよび5%_CO2で24 時間インキュベートします。前の工程で遠心分離を使用しなかった場合は、36時間インキュベートする。サンプルを安定させ、この期間中はインキュベーターから取り出さないでください。

3. ソフトライトランプの準備(1日目)

1. A5用紙サイズの厚さ0.3〜0.5cmの透明なアクリル板を使用してください。アクリル板の表裏に白いパッドを貼り付けます。
   1. LEDの白色ライトをプレートの端に並べて取り付け、アクリルプレートの側面からライトが入り、平行に射出されるようにします(補足図2A-F、図1B)。
      注:初期段階のEBの直径は200μm~300μm程度であるため、クリーンベンチの蛍光灯の下で肉眼ではっきりと観察することは困難です。これに対して、拡散反射の増強により、横方向に照らされた柔らかい光を用いることでEBを明瞭に検出することができます(図1B、C)。6ウェルプレートは、その後の実験におけるEB培養に推奨される。しかし、本研究では、柔らかな光の視覚効果をよりよく示すために、皿の代わりに皿を使って写真やビデオを撮ることもありますので、誤解しないでください。横方向に照らされたソフトライトランプも6ウェルプレートに使用できます。

4. EB移送と培地交換(2~5日目)

1. 新しい6ウェル低接着プレートを用意し、各ウェルに2mLのEB形成培地を加える。
2. EBを1000 μLの広口径ピペットチップ( 材料表を参照)で培地とともに取り出し、6ウェルの低接着プレート(約100EB /ウェル)に移します。
   メモ:操作プロセスでは、EBを観察しやすくするために、ソフトライトランプ(手順3で説明)を採用しています。他の屋内光源をオフにして、柔らかい光の視覚効果を良くします。
3. 毎日同じ量の新鮮なEB形成培地と交換してください。セカンダリ フローを使用して、EB を中央に集め、メディアを変更します。
   1. 井戸の端までゆっくりとピペッティングして古い培地を吸引します。あまりにも強く吸わないでください;それ以外の場合、EB は一緒に削除されます。次に、EBを再懸濁するために新鮮な培地を追加します。
      メモ:原則的な二次フロー(図1D)。円軌道に沿って皿を回転させることによって渦巻き流を誘発する。渦巻き流のために、二次流が中心に向かって誘導される。EBまたはオルガノイドは、回転によって生成される二次流れのためにウェルの中心に収束し、その後、培地交換または胚様移植を容易に実行することができる。

5. 多能性マーカーOCT4によるラベリングによる多能性の確認(4日目)

注:EBの直径が300μmを超える場合は、OCT4マーカー免疫蛍光染色のためにいくつかのEBを採取して、それらの多能性を検出します。

1. EBsを4°Cで4%パラホルムアルデヒドに30分間固定し、続いて1x PBS 3xで毎回10分間洗浄した。
2. EBを0.3%Triton X-100および3%BSAを含む室温PBSに2時間移し、続いてPBS 3xで毎回10分間洗浄した。
   注:Triton X-100で処理した後、EBは液面に浮かび、洗浄中に液体と一緒に簡単に吸い取ることができます。実体顕微鏡下での操作を推奨します。
3. OCT4一次抗体( 材料表参照)を1%BSAを含む1mLの1x PBSで1:200の比率で希釈し、EBsに添加して4°Cで一晩インキュベートした後、PBS 3xで毎回10分間洗浄する。
4. それぞれの二次抗体( 材料表を参照)を1:500で1x PBSで希釈し、EBに1mLを加える。
5. 室温で2時間インキュベートした後、細胞を1x PBS 3xで毎回10分間洗浄する。
6. PBSを取り出し、1μg/mLのDAPIを含む2mLの1x PBS溶液を加え、室温で10分間インキュベートした後、PBS 3xで毎回10分間洗浄する。
7. 少量の液体を含むEBをスライド上に移動させ、端に市販のワセリン( 材料表参照)をコーティングしたカバーガラスでスライドを密封し、蛍光共焦点顕微鏡で画像を観察し収集します。
   注:OCT4発現はEB多能性¹²を表す。OCT4 の式が 90% 未満の場合、EB は破棄し、EB を再度準備する必要があります。

6. 神経誘導(5~7日目)

1. 接着力の低い新しい6ウェルプレートを用意し、各ウェルに3mLの神経誘導培地(補足表2)を加える。
2. 横方向のソフトライト(手順3で説明)をオンにし、他の屋内光源をオフにします。
3. EBを神経誘導培地(〜100EB /ウェル)を添加した6ウェルプレートに移します。新しい井戸に元の培地をできるだけ少なく加えます。
   注:オルガノイド転送の簡単なスキルを紹介します。当然のことながら、重力下で、媒体よりも比較的高い密度で、再懸濁されたEBは、 図1Eに示す動作を適用することによって徐々に沈む。したがって、EBは便利に転送できます。EBと比較して、遊離細胞および死細胞断片はよりゆっくりと沈むので、したがって、遊離細胞および死細胞断片の大部分は、この沈降法によって除去することができる(図1F)。
4. サンプルを37°Cおよび5%_CO2で24 時間インキュベートします。
   注:顕微鏡下では、EBの直径は約500μmであり、縁は半透明であり、神経上皮層が形成されたことを示している。
5. 次の手順に進みます。

7. 基底膜マトリックスへの埋め込み(7~10日目)

1. 膜マトリックスを4°Cの冷蔵庫に60分間置き、予め溶解させた。必要な行列の量を事前に計算してください。約100個のEBを1.5mLの膜マトリックスに包埋した。
2. 横方向のソフトライトをオンにし、本体上部の光源をオフにします。
3. 固化を防ぐために、膜マトリックスを氷上に保ちます。
4. 毎回、少量のEBを新鮮な膨張培地(補足表3)を含む60mmディッシュに移します。EB の数を減らして、1 つの EB を簡単に削除できるようにします。
5. その後、新しい6ウェル低接着プレートを使用する。毎回、1 つの EB (約 10 μL 培地を含む) を 200 μL の広口径ピペットチップ ( 材料表を参照) で吸い込み、6 ウェルプレートの底部に追加して液滴を作ります。ウェルあたり5つの液滴を使用してください。
   メモ:ピペットガンの範囲を50 μLに調整し、EBを吸い込んでから、 図1Eの動作を参照してください。EBがピペットチップのボアに落ち着くと、チップはすぐにプレートのウェル底部に触れ、約10μLの液体を押し出して液滴を形成します。
6. EBを含む各滴に15μLの膜マトリックスを加え、素早く混合する。液滴の中央にEBボールを埋め込む。
   メモ: EB を標準のピペットチップで吸引してはならず、EB を損傷します。代わりに、200 μLのワイドボアピペットチップを使用する必要があります。
7. 6ウェルプレートを37°Cのインキュベーター内に30分間置き、EBsを含む膜マトリックス液滴を固化させた。
8. 各ウェルに3 mLの膨張培地を加え、マトリックス埋め込みEBを静かに吹き飛ばして懸濁させます。
9. 37°Cおよび5%_CO2 で3日間インキュベートする。
   注:EBの表面に出芽が観察される場合、それは拡張された神経上皮が形成されたことを意味する¹⁶。

8.オルガノイド成熟(10-40日目)

1. 元の培地を穏やかに取り出し、3 mLの成熟培地(補足表4)を各ウェルに加えた。
2. オルガノイドプレートを37°Cのインキュベーター内の水平シェーカーの上に置きます。
3. カルチャを水平方向に回転させ続けます。シェーカーを適切な速度に設定します。
   注:6ウェルプレート上で大脳オルガノイドを培養する場合、水平シェーカーの製造元によると、0.11808 x gの相対遠心力(RCF)がより適切です(材料表を参照)。相対遠心力と回転速度^17,18の間の変換によると、RCF = 1.118 x 10⁻⁵ × R × rpm ²、ここでRCF = 相対遠心力(g)、 rpm = 毎分回転数(r / min)、R = 回転半径(cm)(シェイクスローとも呼ばれます)。 異なるシェーカーの振とうスローパラメータは異なる場合があります。したがって、回転数はrpm=299×(RCF/R)^1/2と推定できる。
4. 新鮮な成熟培地を2〜3日ごとに交換してください。
5. 20〜30日後、成熟するまで大脳オルガノイドを徐々に培養する。
   注:この期間中、オルガノイドは、神経マーカー検出およびトランスクリプトームシーケンシング19^、20、²¹などの実験および検出に^{使用することができる。}

9. 脳オルガノイドの凍結切片と免疫蛍光

1. オルガノイドを4%パラホルムアルデヒドに4°Cで16時間固定し、1回1倍PBSで3倍に10分間洗浄します。
2. PBSを取り出し、オルガノイドを4°Cで30%スクロースに一晩浸漬した。
3. オルガノイドを37°Cで1時間10%/7.5%ゼラチン/スクロースに包埋し、その後すぐに包埋型に移します。
4. 100%エタノールにドライアイスを加えてドライアイス/エタノールスラリーを調製し、その中にオルガノイドサンプルを入れて急速凍結させます。
5. 凍結したサンプルを-80°Cの冷凍庫に保管します。必要に応じて、厚さ20μmの凍結切片を作ります。
6. ステップ 5.3.-5.5 を参照してください。免疫蛍光用。PAX6抗体を使用して頂端前駆細胞を標識し、TUJ1抗体(材料表を参照)、神経細胞²²、^23、24を標識し^、DAPIを核DNA染色に使用します。

結果

本研究は、iPS細胞(図2B)を脳オルガノイド(図2C)に誘導した。初期段階で栽培されたEBsはOCT4マーカー(図2A)を発現し、良好な多能性を示した。後の段階では、EBは成熟した脳オルガノイドに発達した(図2D)。この研究では、正常な健常者およびSCA3患者からiPS細胞を脳オルガノイドに培養した(?...

ディスカッション

脳オルガノイドは、医学研究のための新しい道を開きます。この技術の多くの有用な応用は、まだ探求され始めたばかりである²⁸。この研究は、遺伝的に罹患した大脳オルガノイドと正常な脳オルガノイドのトランスクリプトームシーケンシング結果が、疾患と健康の違いを反映し得ることを見出した。例えば、RNA-seqデータ解析結果(図3B)は、SCA3疾患?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Filter	NEST Biotechnology, China	331001
1000 μL wide-bore pipette tip	Thermo Fisher Scientific, USA	9405163
200 μL wide-bore pipette tip	Thermo Fisher Scientific, USA	9405020
2-Mercaptoethanol	Merck, Germany	8057400005
4% Paraformaldehyde	Servicebio, China	G1101
6-well low adhesion plate	NEST Biotechnology, China	703011	It is used for EBs suspension cultures
Aaccute cell detachment solution	STEMCELL Technologies, Canada	07920	It is used to digest iPSC into single cells.
AggreWell800 24-well	STEMCELL Technologies, Canada	34811	Microporous culture plate for EBs preparation.
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies, Canada	07010	Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion
B27-vit. A supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	12587010
bFGF	Peprotech, USA	GMP100-18B
BSA	Beyotime Biotechnology, China	ST025
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5810 R	It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates.
Cover glass	Shitai Laboratory Equipment, China	10212020C
DAPI	Beyotime Biotechnology, China	C1002	Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm.
DMEM-F12	Thermo Fisher Scientific, USA	11330032
ES-quality FBS	Thermo Fisher Scientific, USA	10270106
Ficoll Paque	General Electric Company, USA	17-5442-02	Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method.
Gelatin	Sangon Bioteach, China	A609764
Glutamax supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	35050061
Glutamax supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	17504044
Goat anti-Chicken IgY  secondary antibody	Abcam, UK	ab150171	Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Mouse IgG secondary antibody	Abcam, UK	ab150120	Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody	Abcam, UK	ab150077	Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution.
Heparin	Merck, Germany	H3149
Horizontal shaker	Servicebio, China	DS-H200	Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland).
Insulin	Merck, Germany	I9278-5ML
KOSR	Thermo Fisher Scientific, USA	10828028
Matrigel	Corning, USA	354277	Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature.
MEM-NEAA	Thermo Fisher Scientific, USA	11140050
mTeSR1	STEMCELL Technologies, Canada	85850	iPSC culture medium
N2 supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	17502048
Neurobasal	Thermo Fisher Scientific, USA	21103049
OCT4 primary antibody	Abcam, UK	ab19857	Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution.
Pathological frozen slicer	Leica, Germany	Leica CM1860
PAX6 primary antibody	Abcam, UK	ab78545	Host: Mouse. Use at 1:100 dilution.
PBS	STEMCELL Technologies, Canada	37350
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, USA	15140122
PSC dissociation solution	Beijing Saibei Biotechnology, China	CA3001500	Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage.
Sendai Reprogramming Kit	Thermo Fisher Scientific, USA	A16518	Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit.
Slide Glass	Shitai Laboratory Equipment, China	188105W
Soft light lamp	NUT	NUT	A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation.
STEMdiff Cerebral Organoid Kit	STEMCELL Technologies, Canada	8570	Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium.
STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit	STEMCELL Technologies, Canada	8571	Maturation Medium
Sucrose	Sangon Bioteach, China	A502792
Triton X-100	Merck, Germany	X100
TUJ1 primary antibody	Abcam, UK	ab41489	Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution.
Vaseline	Sangon Bioteach, China	A510146
Y-27632	STEMCELL Technologies, Canada	72302	Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS.
Weblink
Raw sequencing data	Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences	GSA-Human: HRA002430	https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/