Облегчение церебральной органоидной культуры с помощью бокового мягкого светового освещения

Резюме

Церебральные органоиды предоставляют беспрецедентные возможности для изучения развития органов и патологии заболеваний человека. Хотя большие успехи были достигнуты с системами церебральных органоидных культур, все еще существуют операционные трудности в применении этой технологии. Настоящий протокол описывает церебральную органоидную процедуру, которая облегчает изменение среды и перенос органоидов.

Аннотация

В настоящее время технология церебральной органоидной культуры все еще сложна в эксплуатации и трудна для применения в больших масштабах. Необходимо найти простое и практичное решение. Поэтому в настоящем исследовании предлагается более осуществимый церебральный органоидный протокол. Чтобы решить неизбежные неудобства в изменении среды и переносе органоидов на ранней стадии, текущие исследования оптимизируют технологию работы, применяя инженерный принцип. Для бокового освещения образцов эмбриоидного тела (EB) была принята лампа мягкого света, позволяющая ЭБ быть видимыми невооруженным глазом через усиленный эффект диффузного отражения. Используя принцип вторичного потока, генерируемого вращением, органоиды собираются к центру скважины, что облегчает операцию изменения среды или переноса органоидов. По сравнению с дисперсной клеткой, эмбриональное тело быстрее оседает в пипетке. Используя это явление, большинство свободных клеток и фрагментов мертвых клеток могут быть эффективно удалены простым способом, предотвращая повреждение ЭБ от центрифугирования. Это исследование облегчает работу мозговой органоидной культуры и способствует применению органоидов головного мозга.

Введение

По сравнению с двумерными (2D) системами культур, трехмерные (3D) системы культур имеют ряд преимуществ, включая подлинную репликацию и эффективное воспроизведение сложных структур определенных органов¹. Поэтому церебральные органоиды являются одним из важных вспомогательных методов для исследований в области развития мозга человека и болезни², скрининга лекарств и клеточной терапии.

Культивирование церебральных органоидов методом вращающейся суспензии способствует их развитию и созреванию³. Хотя системы церебральных органоидных культур достигли больших успехов, они по-....

протокол

Протокол был составлен после Хельсинкской декларации. Одобрение было предоставлено Комитетом по этике Третьей аффилированной больницы Медицинского университета Гуанчжоу (Медицинский и этический обзор [2021] No 022). Перед экспериментом каждую среду готовили по формуле¹² Юргена А. Кноблиха (дополнительные таблицы 1-4) или использовали коммерчески доступный церебральный органоидный набор (см. Таблицу материалов). IPSCs, используемые в этом исследовании, были ранее установлены нашей лабораторией и получили обоснованное исключение. SCA3-iPSCs были получены от 31-летней пациентки со спиноцеребеллярной атаксией типа ....

Результаты

Настоящее исследование индуцировало ИПСК (Рисунок 2В) в церебральные органоиды (Рисунок 2С). ЭБ, культивируемые на ранней стадии, выражали маркер OCT4 (рисунок 2A), который указывал на хорошую плюрипотентность. На более поздней стадии ЭБ разви.......

Обсуждение

Церебральные органоиды открывают новые возможности для медицинских исследований. Многие полезные применения этой технологии только начинают изучаться²⁸. Это исследование показало, что результаты секвенирования транскриптома генетически больных церебральных органоидо?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Filter	NEST Biotechnology, China	331001
1000 μL wide-bore pipette tip	Thermo Fisher Scientific, USA	9405163
200 μL wide-bore pipette tip	Thermo Fisher Scientific, USA	9405020
2-Mercaptoethanol	Merck, Germany	8057400005
4% Paraformaldehyde	Servicebio, China	G1101
6-well low adhesion plate	NEST Biotechnology, China	703011	It is used for EBs suspension cultures
Aaccute cell detachment solution	STEMCELL Technologies, Canada	07920	It is used to digest iPSC into single cells.
AggreWell800 24-well	STEMCELL Technologies, Canada	34811	Microporous culture plate for EBs preparation.
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies, Canada	07010	Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion
B27-vit. A supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	12587010
bFGF	Peprotech, USA	GMP100-18B
BSA	Beyotime Biotechnology, China	ST025
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5810 R	It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates.
Cover glass	Shitai Laboratory Equipment, China	10212020C
DAPI	Beyotime Biotechnology, China	C1002	Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm.
DMEM-F12	Thermo Fisher Scientific, USA	11330032
ES-quality FBS	Thermo Fisher Scientific, USA	10270106
Ficoll Paque	General Electric Company, USA	17-5442-02	Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method.
Gelatin	Sangon Bioteach, China	A609764
Glutamax supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	35050061
Glutamax supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	17504044
Goat anti-Chicken IgY  secondary antibody	Abcam, UK	ab150171	Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Mouse IgG secondary antibody	Abcam, UK	ab150120	Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody	Abcam, UK	ab150077	Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution.
Heparin	Merck, Germany	H3149
Horizontal shaker	Servicebio, China	DS-H200	Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland).
Insulin	Merck, Germany	I9278-5ML
KOSR	Thermo Fisher Scientific, USA	10828028
Matrigel	Corning, USA	354277	Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature.
MEM-NEAA	Thermo Fisher Scientific, USA	11140050
mTeSR1	STEMCELL Technologies, Canada	85850	iPSC culture medium
N2 supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	17502048
Neurobasal	Thermo Fisher Scientific, USA	21103049
OCT4 primary antibody	Abcam, UK	ab19857	Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution.
Pathological frozen slicer	Leica, Germany	Leica CM1860
PAX6 primary antibody	Abcam, UK	ab78545	Host: Mouse. Use at 1:100 dilution.
PBS	STEMCELL Technologies, Canada	37350
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, USA	15140122
PSC dissociation solution	Beijing Saibei Biotechnology, China	CA3001500	Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage.
Sendai Reprogramming Kit	Thermo Fisher Scientific, USA	A16518	Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit.
Slide Glass	Shitai Laboratory Equipment, China	188105W
Soft light lamp	NUT	NUT	A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation.
STEMdiff Cerebral Organoid Kit	STEMCELL Technologies, Canada	8570	Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium.
STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit	STEMCELL Technologies, Canada	8571	Maturation Medium
Sucrose	Sangon Bioteach, China	A502792
Triton X-100	Merck, Germany	X100
TUJ1 primary antibody	Abcam, UK	ab41489	Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution.
Vaseline	Sangon Bioteach, China	A510146
Y-27632	STEMCELL Technologies, Canada	72302	Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS.
Weblink
Raw sequencing data	Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences	GSA-Human: HRA002430	https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/