Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Церебральные органоиды предоставляют беспрецедентные возможности для изучения развития органов и патологии заболеваний человека. Хотя большие успехи были достигнуты с системами церебральных органоидных культур, все еще существуют операционные трудности в применении этой технологии. Настоящий протокол описывает церебральную органоидную процедуру, которая облегчает изменение среды и перенос органоидов.
В настоящее время технология церебральной органоидной культуры все еще сложна в эксплуатации и трудна для применения в больших масштабах. Необходимо найти простое и практичное решение. Поэтому в настоящем исследовании предлагается более осуществимый церебральный органоидный протокол. Чтобы решить неизбежные неудобства в изменении среды и переносе органоидов на ранней стадии, текущие исследования оптимизируют технологию работы, применяя инженерный принцип. Для бокового освещения образцов эмбриоидного тела (EB) была принята лампа мягкого света, позволяющая ЭБ быть видимыми невооруженным глазом через усиленный эффект диффузного отражения. Используя принцип вторичного потока, генерируемого вращением, органоиды собираются к центру скважины, что облегчает операцию изменения среды или переноса органоидов. По сравнению с дисперсной клеткой, эмбриональное тело быстрее оседает в пипетке. Используя это явление, большинство свободных клеток и фрагментов мертвых клеток могут быть эффективно удалены простым способом, предотвращая повреждение ЭБ от центрифугирования. Это исследование облегчает работу мозговой органоидной культуры и способствует применению органоидов головного мозга.
По сравнению с двумерными (2D) системами культур, трехмерные (3D) системы культур имеют ряд преимуществ, включая подлинную репликацию и эффективное воспроизведение сложных структур определенных органов1. Поэтому церебральные органоиды являются одним из важных вспомогательных методов для исследований в области развития мозга человека и болезни2, скрининга лекарств и клеточной терапии.
Культивирование церебральных органоидов методом вращающейся суспензии способствует их развитию и созреванию3. Хотя системы церебральных органоидных культур достигли больших успехов, они по-прежнему сталкиваются с критическими проблемами, которые ограничивают их применение. Например, ручное выращивание включает в себя сложные этапы манипуляции и создает препятствия для достижения крупномасштабных применений. Дополнительно на каждом этапе развития в культуре церебральных органоидов необходимы изменения в различных средах и цитокинах4. Однако на ранней стадии органоиды или ЭБ имеют крошечные размеры (примерно от 200 мкм до 300 мкм) и почти визуально недоступны без соответствующего аппарата. Неизбежно, определенное количество драгоценных образцов органоидов вымывается при изменении среды. Было изучено много методов преодоления этого в других видах органоидных культур, и некоторые примеры включают погружение целых органоидных чипов в культуральную среду в течение 3 дней без вмешательства5; добавление свежей среды через крышку после поглощения старой среды с использованием абсорбирующей бумаги5; или применение сложных микрофлюидных трубопроводов для жидкостообмена 6,7,8. Другим препятствием, встречающимся на ранней стадии культивирования органоидов, является трудность достижения прямых наблюдений невооруженным глазом, что может привести к плохим операциям, которые приводят к повреждению и потере органоидов во время этапов переноса органоидов. Поэтому необходимо установить более осуществимый протокол, который облегчает изменение среды и перенос органоидов для генерации органоидов.
Для преодоления этих проблем предлагается соответствующая оптимизированная операция, основанная на инженерных принципах, что значительно и удобно облегчает многие органоидные процедуры. В природе, когда солнце светит в дом через оконную щель, невооруженным глазом можно увидеть пыль, танцующую в луче света. Из-за диффузного отражения солнечного света на пыли часть света преломляется в глазное яблоко для получения визуального изображения. Вдохновленный принципом этого явления 9,10, это исследование сделало лампу мягкого света и осветило ЭБ сбоку. Было обнаружено, что ЭБ могут быть визуально чистыми, не влияя на область просмотра. Вторичный поток, указывающий на центр, генерируется в жидкости путем вращения культуральной пластины за счет вихревых токов11. Первоначально дисперсные ЭБ накапливаются в центре пластины. Исходя из этого, а также явления, что скорость осаждения органоидов быстрее, чем у клеток, предложен простой в эксплуатации метод изменения среды и переноса органоидов без центрифугирования. Органоиды в культуральной среде могут быть эффективно отделены от свободных клеток и фрагментов мертвых клеток с помощью этой операции переноса.
Здесь предлагается протокол, который прост в эксплуатации, для генерации церебральных органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека. Технология работы была оптимизирована за счет применения инженерного принципа, что делает операции в 3D-культуре такими же простыми и осуществимыми, как и в 2D-культуре. Улучшенный метод обмена жидкости и операция переноса органоидов также полезны для других типов органоидных культур и конструкции автоматических культуральных машин.
Протокол был составлен после Хельсинкской декларации. Одобрение было предоставлено Комитетом по этике Третьей аффилированной больницы Медицинского университета Гуанчжоу (Медицинский и этический обзор [2021] No 022). Перед экспериментом каждую среду готовили по формуле12 Юргена А. Кноблиха (дополнительные таблицы 1-4) или использовали коммерчески доступный церебральный органоидный набор (см. Таблицу материалов). IPSCs, используемые в этом исследовании, были ранее установлены нашей лабораторией и получили обоснованное исключение. SCA3-iPSCs были получены от 31-летней пациентки со спиноцеребеллярной атаксией типа 3 (SCA3), генотипированной как содержащая 26/78 ЦАГ-повторов в гене ATXN313 (дополнительный рисунок 1A). Нормальные человеческие IPSCs, упомянутые в предыдущей статье, были выбраны как NC-iPSCs14, а ген ATXN3 был идентифицирован как имеющий 14/14 ЦАГ-повторов (дополнительный рисунок 1B).
1. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)
2. Подготовка EB (дни 0-1)
3. Подготовка лампы мягкого света (день 1)
4. Перенос EB и замена среды (дни 2-5)
5. Проверка плюрипотентности путем маркировки маркером плюрипотентности OCT4 (день 4)
ПРИМЕЧАНИЕ: Когда диаметр ЭБ превышает 300 мкм, возьмите несколько ЭБ для окрашивания маркером иммунофлуоресценции OCT4, чтобы обнаружить их плюрипотентность.
6. Нейронная индукция (дни 5-7)
7. Встраивание в матрицу базальной мембраны (7-10 дней)
8. Созревание органоидов (10-40 дней)
9. Замороженные срезы и иммунофлуоресценция церебральных органоидов
Настоящее исследование индуцировало ИПСК (Рисунок 2В) в церебральные органоиды (Рисунок 2С). ЭБ, культивируемые на ранней стадии, выражали маркер OCT4 (рисунок 2A), который указывал на хорошую плюрипотентность. На более поздней стадии ЭБ разви...
Церебральные органоиды открывают новые возможности для медицинских исследований. Многие полезные применения этой технологии только начинают изучаться28. Это исследование показало, что результаты секвенирования транскриптома генетически больных церебральных органоидо?...
Авторам нечего раскрывать.
Это исследование было поддержано Фондом естественных наук провинции Гуандун (грант No 2020A0505100062), Проектом по ключевым темам науки и техники города Гуанчжоу (грант No 201904020025), Национальным фондом естественных наук Китая (грант No 31872800, 32070582, 82101937) и проектом постдокторских исследований города Гуанчжоу (Бангчжу Чену).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.2 μm Filter | NEST Biotechnology, China | 331001 | |
1000 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405163 | |
200 μL wide-bore pipette tip | Thermo Fisher Scientific, USA | 9405020 | |
2-Mercaptoethanol | Merck, Germany | 8057400005 | |
4% Paraformaldehyde | Servicebio, China | G1101 | |
6-well low adhesion plate | NEST Biotechnology, China | 703011 | It is used for EBs suspension cultures |
Aaccute cell detachment solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07920 | It is used to digest iPSC into single cells. |
AggreWell800 24-well | STEMCELL Technologies, Canada | 34811 | Microporous culture plate for EBs preparation. |
Anti-Adherence Rinsing Solution | STEMCELL Technologies, Canada | 07010 | Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion |
B27-vit. A supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 12587010 | |
bFGF | Peprotech, USA | GMP100-18B | |
BSA | Beyotime Biotechnology, China | ST025 | |
Centrifuge | Eppendorf, Germany | 5810 R | It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates. |
Cover glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 10212020C | |
DAPI | Beyotime Biotechnology, China | C1002 | Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm. |
DMEM-F12 | Thermo Fisher Scientific, USA | 11330032 | |
ES-quality FBS | Thermo Fisher Scientific, USA | 10270106 | |
Ficoll Paque | General Electric Company, USA | 17-5442-02 | Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method. |
Gelatin | Sangon Bioteach, China | A609764 | |
Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 35050061 | |
Glutamax supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17504044 | |
Goat anti-Chicken IgY secondary antibody | Abcam, UK | ab150171 | Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution. |
Goat anti-Mouse IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150120 | Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution. |
Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody | Abcam, UK | ab150077 | Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution. |
Heparin | Merck, Germany | H3149 | |
Horizontal shaker | Servicebio, China | DS-H200 | Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland). |
Insulin | Merck, Germany | I9278-5ML | |
KOSR | Thermo Fisher Scientific, USA | 10828028 | |
Matrigel | Corning, USA | 354277 | Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature. |
MEM-NEAA | Thermo Fisher Scientific, USA | 11140050 | |
mTeSR1 | STEMCELL Technologies, Canada | 85850 | iPSC culture medium |
N2 supplement | Thermo Fisher Scientific, USA | 17502048 | |
Neurobasal | Thermo Fisher Scientific, USA | 21103049 | |
OCT4 primary antibody | Abcam, UK | ab19857 | Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution. |
Pathological frozen slicer | Leica, Germany | Leica CM1860 | |
PAX6 primary antibody | Abcam, UK | ab78545 | Host: Mouse. Use at 1:100 dilution. |
PBS | STEMCELL Technologies, Canada | 37350 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific, USA | 15140122 | |
PSC dissociation solution | Beijing Saibei Biotechnology, China | CA3001500 | Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage. |
Sendai Reprogramming Kit | Thermo Fisher Scientific, USA | A16518 | Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit. |
Slide Glass | Shitai Laboratory Equipment, China | 188105W | |
Soft light lamp | NUT | NUT | A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation. |
STEMdiff Cerebral Organoid Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8570 | Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium. |
STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit | STEMCELL Technologies, Canada | 8571 | Maturation Medium |
Sucrose | Sangon Bioteach, China | A502792 | |
Triton X-100 | Merck, Germany | X100 | |
TUJ1 primary antibody | Abcam, UK | ab41489 | Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution. |
Vaseline | Sangon Bioteach, China | A510146 | |
Y-27632 | STEMCELL Technologies, Canada | 72302 | Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS. |
Weblink | |||
Raw sequencing data | Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences | GSA-Human: HRA002430 | https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/ |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены