通过侧向柔光照明促进脑类器官培养

摘要

脑类器官为研究器官发育和人类疾病病理学提供了前所未有的机会。虽然脑类器官培养系统取得了巨大成功，但在应用这项技术方面仍然存在操作困难。本方案描述了一种促进介质改变和类器官转移的脑类器官程序。

摘要

目前，脑类器官培养技术操作仍复杂，难以大规模应用。有必要找到一个简单而实用的解决方案。因此，本研究提出了一种更可行的脑类器官方案。为了解决早期介质变化和类器官转移中不可避免的不便，目前的研究通过应用工程原理优化了操作技术。采用柔和的光灯横向照亮胚体（EB）样品，通过增强的漫反射效果，肉眼可以看到EB。利用旋转产生的二次流动原理，类器官向孔中心聚集，这有利于介质变化或类器官转移的操作。与分散的细胞相比，胚状体在移液器中沉降得更快。利用这种现象，可以以简单的方式有效地去除大多数游离细胞和死细胞碎片，防止EB因离心而受到损害。本研究促进脑类器官培养的操作，并有助于促进脑类器官的应用。

引言

与二维（2D）培养系统相比，三维（3D）培养系统具有几个优点，包括某些器官的复杂结构的真实复制和有效复制¹。因此，脑类器官是人脑发育与疾病²、药物筛选、细胞治疗等研究领域的重要辅助方法之一。

通过旋转悬浮法培养脑类器官有利于它们的发育和成熟³.虽然大脑类器官培养系统取得了巨大的成功，但它们仍然面临着限制其应用的关键挑战。例如，手工栽培涉及复杂的操作步骤，并给实现大规模应用带来了障碍。此外，在脑类器官培养的每个发育阶段，需要改变不同的培养基和细胞因子⁴.然而，在早期阶段，类器官或EB具有微小的尺寸（约200μm至300μm），并且在没有适当的设备的情况下几乎无法在视觉上进入。不可避免地，当介质发生变化时，一定量的珍贵类器官样品被冲走。已经探索了许多技术来克服其他类型的类器官培养物中的这一点，一些例子包括将整个类器官芯片浸入培养基中3天而不进行干预⁵;在旧介质被吸收后，使用吸水纸⁵通过盖玻片添加新鲜介质;或应用复杂的微流体管道进行流体交换^6，7，8。在类器官培养的早期阶段遇到的另一个障碍是难以用肉眼进行直接观察，这可能导致操作不良，导致类器官移植步骤中的类器官损伤和丢失。因此，有必要建立一个更可行的方案，促进介质变化和类器官转移以产生类器官。

为了克服这些问题，提出了一种基于工程原理的相应优化操作，这显着且方便地促进了许多类器官手术。在自然界中，当太阳透过窗户缝隙照射到房屋中时，肉眼可以看到光束中舞动的灰尘。由于太阳光对尘埃的漫反射，一些光线被折射到眼球中以产生视觉图像。受9^{，10现象原理}的启发，本研究制作了柔和的光灯并横向照亮了EB。研究发现，EB可以在不影响观察范围的情况下在视觉上清晰可见。由于涡流¹¹，通过旋转培养板在液体中产生指向中心的二次流。原本分散的EB积聚在板的中心。基于此，针对类器官沉降速度快于细胞的现象，提出一种无需离心即可进行介质更换和类器官转移的简便操作方法。通过这种转移操作，培养基中的类器官可以有效地与游离细胞和死细胞碎片分离。

这里提出了一种易于操作的方案，从人多能干细胞中产生脑类器官。通过应用工程原理优化操作技术，使3D文化中的操作与2D文化中的操作一样简单可行。改进的液体交换方法和类器官转移操作也有助于其他类型的类器官培养和自动培养机的设计。

研究方案

该议定书是在《赫尔辛基宣言》之后进行的。经广州医科大学第三附属医院伦理委员会批准（医德伦理审查[2021]022号）。在实验之前，每种培养基都是根据Juergen A. Knoblich的配方¹² （补充表1-4）制备的，或者使用市售的脑类器官试剂盒（见 材料表）。本研究中使用的iPSC先前由我们的实验室建立，并已获得知情豁免。SCA3-iPSCs由一名31岁的女性脊髓小脑共济失调3型（SCA3）患者产生，该患者基因型为ATXN3基因¹³ 中含有26/78 CAG重复序列（补充图1A）。上一篇文章中提到的正常人iPSC被选为NC-iPSCs¹⁴，并且ATXN3基因被鉴定为具有14/14个CAG重复序列（补充图1B）。

1. 诱导多能干细胞（iPSCs）的制备

1. 在志愿者和患者知情同意的情况下，通过静脉穿刺收集3 mL外周血。
2. 根据菲科尔-帕克方法¹⁵分离外周血单核细胞。
3. 根据仙台重编程套件的协议建立 iPSC（参见 材料表）。
   1. 用mTeSR1培养基将iPSC培养在覆盖有基质胶（基底膜基质，参见 材料表）的35mm培养皿中。每天更换培养基。iPSC生长密度不得超过75%。
   2. 用PSC解离溶液消化细胞（参见 材料表），并以每3-5天1:5的比例传代培养它们。
      注意:这里使用仙台病毒。它必须在生物安全柜中操作，并且必须采取自我保护措施。应该清楚它是否可以在当地合法使用。使用时必须严格遵守当地生物安全法律法规。

2. EB 准备（第 0-1 天）

1. 用移液管从 iPSC 中取出 mTeSR1 培养基，并用 1 mL 1x PBS 洗涤 2 倍。
2. 用移液管取出PBS，并加入300μL细胞分离溶液（参见 材料表）以在37°C下将iPSC消化到单个细胞中3-4分钟。
3. 将细胞重悬于2mLEB形成培养基中（补充表1），然后在300× g （室温）下将样品离心5分钟。
4. 用抗粘附冲洗液（500μL /孔）预处理专用的24孔板5分钟（参见 材料表）。
   注意:抗粘附漂洗液对于最佳的EB和球状体形成至关重要。
5. 将细胞重悬于含有Y-27632（终浓度，10μM，参见 材料表）的EB形成培养基中，细胞密度为1.5×10⁶ 个细胞/ mL。
6. 取出抗粘附冲洗液，并用2 mL EB形成培养基冲洗每个孔。
7. 将细胞以3×10⁶ 个细胞/孔的密度加入专门的24孔板中（图1A，左）。
   注意:通常，每个孔中可以制备300个EB。该方法可以制备大量相同大小的EB。
8. 在室温下以100× g 离心板2分钟。将细胞均匀分布在板底部的每个腔室中（图1A，右）。
   注意:如果没有合适的离心机，也可以将板直接放入培养箱中进行静态培养，但EB球的形成时间将比正常离心下晚几个小时。
9. 将样品在37°C和5%CO₂ 下孵育24小时。如果在上一步中未使用离心，则孵育36小时。保持样品稳定，在此期间不要将其带出培养箱。

3. 柔光灯的准备（第1天）

1. 使用厚度为0.3-0.5厘米的透明亚克力板，尺寸为A5纸。将白色垫贴在亚克力板的正面和背面。
   1. 在板的边缘安装一排LED白光灯，使灯可以从亚克力板的侧面进入，然后平行射出（补充图2A-F，图1B）。
      注意:由于早期阶段EB的直径约为200μm至300μm，因此很难在洁净长凳的荧光灯下用肉眼清楚地观察到它们。相比之下，由于漫反射的增强，我们可以通过使用横向照明的柔光清楚地检测EB（图1B，C）。在随后的实验中，建议使用6孔板进行EB培养。但是，为了更好地展示柔光的视觉效果，本研究中有时使用盘子代替盘子来拍照和录像，所以请不要误解。侧照柔光灯也可用于6孔板。

4. EB 转移和介质更换（第 2-5 天）

1. 准备一个新的6孔低粘附板，并向每个孔中加入2 mL EB形成培养基。
2. 用1000μL宽孔移液器吸头（参见 材料表）将EB与培养基一起除去，并将其转移到6孔低粘附板（〜100 EBs /孔）。
   注:操作过程采用柔光灯（步骤3中提到），使EB更易于观察。关闭其他室内光源，以获得更好的柔光的视觉效果。
3. 每天用相同体积的新鲜EB形成培养基替换。使用辅助流将EB收集到中心并更换介质。
   1. 通过缓慢移液到孔的边缘来吸出旧培养基。不要吸吮太用力;否则，这些 EB 将一起删除。然后，加入新的培养基以重悬EB。
      注:原理二次流（图1D）。通过沿圆形轨道旋转培养皿来诱导涡流。由于涡流，二次流被诱导到中心。由于通过旋转产生的次级流动，EBs或类器官会聚到孔的中心，之后可以很容易地进行介质变化或胚状转移。

5. 通过用多能性标记物OCT4标记来检查多能性（第4天）

注意:当EB的直径大于300μm时，取几个EB进行OCT4标记免疫荧光染色以检测其多能性。

1. 将EB固定在4%多聚甲醛中，在4°C下30分钟，然后每次在1x PBS 3x中洗涤10分钟。
2. 将EB转移到含有0.3%曲拉第X-100和3%BSA的室温PBS中2小时，然后每次在PBS 3x中洗涤10分钟。
   注意:使用Triton X-100处理后，EBs漂浮在液体表面上，在清洁过程中可以很容易地与液体一起吸走。建议在立体显微镜下操作。
3. 用1mL含有1%BSA的1x PBS以1:200的比例稀释OCT4一抗（参见 材料表），并加入EBs中在4°C下孵育过夜，然后每次在PBS中洗涤10分钟。
4. 在1:500下用1x PBS稀释相应的二抗（参见 材料表），并向EB中加入1 mL。
5. 在室温下孵育2小时后，每次以1x PBS 3x洗涤细胞10分钟。
6. 取出PBS，加入2mL含有1μg/ mL DAPI的1x PBS溶液，在室温下孵育10分钟，然后每次在PBS中洗涤3x10分钟。
7. 将含有少量液体的EB移动到载玻片上，用涂有市售凡士林的盖玻片密封载玻片（参见 材料表），然后在荧光共聚焦显微镜下观察并收集图像。
   注意:OCT4 表达式表示 EB 多能性¹²。当 OCT4 的表达式小于 90% 时，应丢弃 EB，并再次准备 EB。

6. 神经诱导（第5-7天）

1. 制备具有低粘附力的新6孔板，并向每个孔中加入3mL神经诱导培养基（补充表2）。
2. 打开横向柔光（在步骤 3 中提到）并关闭其他室内光源。
3. 将EB转移到6孔板中，并添加神经诱导介质（〜100 EB /孔）。尽可能少地将原始培养基添加到新井中。
   注意:介绍一下类有机体转移的简单技能。当然，在重力作用下，密度相对高于介质，重悬的EB将通过应用 图1E所示的操作逐渐下沉。因此，可以方便地转移EB。由于与EBs相比，游离细胞和死细胞碎片的下沉速度较慢，因此可以通过这种沉淀方法去除大多数游离细胞和死细胞碎片（图1F）。
4. 将样品在37°C和5%CO₂ 下孵育24小时。
   注意:在显微镜下，EBs的直径约为500μm，边缘是半透明的，表明形成了神经上皮层。
5. 继续执行下一步。

7.嵌入基底膜基质（第7-10天）

1. 将膜基质提前在4°C冰箱中放置60分钟以溶解。提前计算所需矩阵的数量。大约100个EB被包埋在1.5 mL的膜基质中。
2. 打开横向柔光灯，然后关闭主机顶部的光源。
3. 将膜基质保持在冰上以防止凝固。
4. 每次将少量EB转移到含有新鲜膨胀培养基的60毫米培养皿中（补充表3）。减少 EB 的数量，以便更轻松地删除单个 EB。
5. 然后，使用新的6孔低粘附板。每次用200μL宽口径移液器吸头（参见 材料表）吸入单个EB（含有约10μL培养基），然后将其添加到6孔板的底部以产生液滴。每孔使用五个液滴。
   注意:关键是将移液枪的范围调整到50μL并吸出EB，然后参考 图1E的操作。当 EB 沉降到移液器吸头的孔口时，吸头迅速接触板的孔底部，并推出约 10 μL 液体以形成液滴。
6. 将15μL膜基质加入含有EB的每滴中，并快速混合。将 EB 球嵌入液滴的中心。
   注意:EB 不得使用标准移液器吸头吸出，否则会损坏 EB。需要改用 200 μL 宽孔移液器吸头。
7. 将6孔板放入37°C培养箱中30分钟，并固化含有EB的膜基质液滴。
8. 向每个孔中加入3 mL膨胀培养基，并轻轻吹起基质嵌入的EB以悬浮它们。
9. 在37°C和5%CO₂ 下孵育3天。
   注意:如果观察到EB表面的萌芽，则意味着已经形成了扩展的神经上皮¹⁶。

8. 类器官成熟（第10-40天）

1. 轻轻取出原始培养基，并向每个孔中加入3mL成熟培养基（补充表4）。
2. 将类器官板放在37°C培养箱中的水平振荡器上。
3. 继续水平旋转区域性。将摇床设置为适当的速度。
   注意:根据水平振荡器的制造商的说法，在6孔板上培养脑类器官时，相对离心力（RCF）为0.11808 x g 更合适（见 材料表）。根据相对离心力与转速^17，18之间的换算， RCF = 1.118 x 10⁻⁵ × R × rpm²，其中 RCF =相对离心力（g）， rpm =每分钟转数（r /min）， R =旋转半径（cm），也称为振动抛掷。不同摇床的晃动投掷参数可能不同。因此，可以估计转速为 rpm = 299 x （RCF/R）^1/2。
4. 每2-3天更换一次新鲜成熟培养基。
5. 20-30天后，逐渐培养大脑类器官至成熟。
   注意:在此期间，类器官可用于实验和检测，例如神经标志物检测和转录组测序^19，20，21。

9. 脑类器官的冷冻切片和免疫荧光

1. 将类器官固定在4%多聚甲醛中，在4°C下16小时，然后每次用1x PBS洗涤3x，每次10分钟。
2. 除去PBS，并将类器官浸入4°C的30%蔗糖中过夜。
3. 将类器官在37°C下嵌入10%/ 7.5%明胶/蔗糖中1小时，然后快速将其转移到包埋模具中。
4. 将干冰加入100%乙醇中，制备干冰/乙醇浆料，并将类器官样品放入其中快速冷冻。
5. 将冷冻样品储存在−80°C冰箱中。需要时，制作厚度为20μm的冷冻切片。
6. 请参阅步骤 5.3.-5.5。用于免疫荧光。使用PAX6抗体标记顶端祖细胞，使用TUJ1抗体（见 材料表）标记神经元细胞^22，23，24和DAPI进行核DNA染色。

结果

本研究诱导iPSCs（图2B）进入脑类器官（图2C）。早期培养的EB表示OCT4标记（图2A），表明良好的多能性。在后期阶段，EBs发育成成熟的脑类器官（图2D）。该研究将iPSC从正常健康个体和SCA3患者培养成脑类器官（图3A）。SCA3，也称为马查多- 约瑟夫病（MJD），是由ATXN3基因^25<...

讨论

大脑类器官为医学研究开辟了新的途径。该技术的许多有用应用才刚刚开始探索²⁸.本研究发现，遗传性疾病性脑类器官与正常脑类器官的转录组测序结果可以反映疾病与健康之间的差异。例如，RNA-seq数据分析结果（图3B）与许多报道的SCA3疾病^{29，30，31，32}的研?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 μm Filter	NEST Biotechnology, China	331001
1000 μL wide-bore pipette tip	Thermo Fisher Scientific, USA	9405163
200 μL wide-bore pipette tip	Thermo Fisher Scientific, USA	9405020
2-Mercaptoethanol	Merck, Germany	8057400005
4% Paraformaldehyde	Servicebio, China	G1101
6-well low adhesion plate	NEST Biotechnology, China	703011	It is used for EBs suspension cultures
Aaccute cell detachment solution	STEMCELL Technologies, Canada	07920	It is used to digest iPSC into single cells.
AggreWell800 24-well	STEMCELL Technologies, Canada	34811	Microporous culture plate for EBs preparation.
Anti-Adherence Rinsing Solution	STEMCELL Technologies, Canada	07010	Rinsing solution for cultureware to prevent cell adhesion
B27-vit. A supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	12587010
bFGF	Peprotech, USA	GMP100-18B
BSA	Beyotime Biotechnology, China	ST025
Centrifuge	Eppendorf, Germany	5810 R	It can be used for centrifugation of various types of centrifuge tubes, reagent bottles and working plates.
Cover glass	Shitai Laboratory Equipment, China	10212020C
DAPI	Beyotime Biotechnology, China	C1002	Used for nuclear staining. After DAPI was combined with double stranded DNA, the maximum excitation wavelength was 364nm and the maximum emission wavelength was 454nm.
DMEM-F12	Thermo Fisher Scientific, USA	11330032
ES-quality FBS	Thermo Fisher Scientific, USA	10270106
Ficoll Paque	General Electric Company, USA	17-5442-02	Isolate the peripheral blood mononuclear cells according to Ficoll-Paque method.
Gelatin	Sangon Bioteach, China	A609764
Glutamax supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	35050061
Glutamax supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	17504044
Goat anti-Chicken IgY  secondary antibody	Abcam, UK	ab150171	Goat anti-Chicken IgG. Conjugation: Alexa Fluor 647. Ex: 652 nm, Em: 668 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Mouse IgG secondary antibody	Abcam, UK	ab150120	Goat anti-Mouse IgG. Conjugation: Alexa Fluor 594. Ex: 590 nm, Em: 617 nm. Use at 1:500 dilution.
Goat anti-Rabbit IgG secondary antibody	Abcam, UK	ab150077	Goat Anti-Rabbit IgG. Conjugation: Alexa Fluor 488. Ex: 495 nm, Em: 519 nm. Use at 1:500 dilution.
Heparin	Merck, Germany	H3149
Horizontal shaker	Servicebio, China	DS-H200	Relative centrifugal force (RCF) of 0.11808 x g is more appropriate, according to the manufacturer INFORS HT (Switzerland).
Insulin	Merck, Germany	I9278-5ML
KOSR	Thermo Fisher Scientific, USA	10828028
Matrigel	Corning, USA	354277	Matrigel will solidify in the environment higher than 4 °C, so it should be sub packed at low temperature.
MEM-NEAA	Thermo Fisher Scientific, USA	11140050
mTeSR1	STEMCELL Technologies, Canada	85850	iPSC culture medium
N2 supplement	Thermo Fisher Scientific, USA	17502048
Neurobasal	Thermo Fisher Scientific, USA	21103049
OCT4 primary antibody	Abcam, UK	ab19857	Host: Rabbit. Dissolve with 500 μL PBS. Use at 1:200 dilution.
Pathological frozen slicer	Leica, Germany	Leica CM1860
PAX6 primary antibody	Abcam, UK	ab78545	Host: Mouse. Use at 1:100 dilution.
PBS	STEMCELL Technologies, Canada	37350
Penicillin-Streptomycin	Thermo Fisher Scientific, USA	15140122
PSC dissociation solution	Beijing Saibei Biotechnology, China	CA3001500	Enzyme free dissociation solution can be used for iPSC digestion and passage.
Sendai Reprogramming Kit	Thermo Fisher Scientific, USA	A16518	Establish iPSC according to the protocol of Sendai Reprogramming Kit.
Slide Glass	Shitai Laboratory Equipment, China	188105W
Soft light lamp	NUT	NUT	A simple self made device, refer to supplementary figure 2 for preparation.
STEMdiff Cerebral Organoid Kit	STEMCELL Technologies, Canada	8570	Contain: 1. EB Formation Medium; 2. Induction Medium; 3. Expansion Medium; 4. Maturation Medium.
STEMdiff Cerebral Organoid Maturation Kit	STEMCELL Technologies, Canada	8571	Maturation Medium
Sucrose	Sangon Bioteach, China	A502792
Triton X-100	Merck, Germany	X100
TUJ1 primary antibody	Abcam, UK	ab41489	Host: Chicken. Use at 1:1000 dilution.
Vaseline	Sangon Bioteach, China	A510146
Y-27632	STEMCELL Technologies, Canada	72302	Prepare a 5 mM stock solution in PBS, resuspend 1 mg in 624 µL of PBS.
Weblink
Raw sequencing data	Genome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021) in National Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022), China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences	GSA-Human: HRA002430	https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/