JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

في هذه الدراسة ، تم إنشاء استنساخ معدي من الفيروس الغدي البشري من النوع 7 (HAdV-7) ، وتم إنشاء نظام ناقل HAdV-7 المحذوف من E3 عن طريق تعديل الاستنساخ المعدي. يمكن تعميم هذه الإستراتيجية المستخدمة هنا لعمل نواقل نقل الجينات من الفيروسات الغدية الأخرى من النوع البري.

Abstract

تم استخدام نواقل الفيروسات الغدية كأداة لنقل الجينات في العلاج الجيني لأكثر من ثلاثة عقود. هنا ، نقدم بروتوكولا لبناء ناقل الفيروس الغدي عن طريق التلاعب بالحمض النووي الجيني ل HAdV-7 من النوع البري باستخدام طريقة تجميع الحمض النووي. أولا ، تم إنشاء استنساخ معدي ل HAdV-7 ، pKan-Ad7 ، عن طريق دمج الحمض النووي الجيني الفيروسي مع منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل من العمود الفقري البلازميد ، الذي يتكون من الجين المقاوم للكاناميسين وأصل النسخ المتماثل (Kan-Ori) ، من خلال تجميع الحمض النووي. تم ذلك من خلال تصميم زوج من بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، والتي تحتوي على ~ 25 نيوكليوتيد من التسلسل الطرفي لتكرار المحطة المقلوبة HAdV-7 (ITR) في نهاية 5 '، وموقع إنزيم تقييد غير قاطع لجينوم HAdV-7 في المنتصف ، وتسلسل خاص بالقالب لتحضير تفاعل البوليميراز المتسلسل في نهاية 3'. ثانيا ، تم استخدام استراتيجية وسيطة قائمة على البلازميد لاستبدال منطقة E3 بعناصر عبر عن الجينات المعدلة وراثيا في الاستنساخ المعدي لتوليد ناقل فيروسي غدي. باختصار ، تم هضم pKan-Ad7 باستخدام إنزيم تقييد القاطع المزدوج Hpa I ، وتم ربط الجزء الذي يحتوي على منطقة E3 بمنتج PCR آخر من العمود الفقري البلازميد بواسطة تجميع جيبسون لبناء بلازميد وسيط pKan-Ad7HpaI. للراحة ، تم استخدام التجميع التقييدي لتعيين طريقة استنساخ البلازميد للهضم والتجميع التقييدي المشترك. باستخدام تجميع التقييد ، تم استبدال جينات E3 في pKan-Ad7HpaI بكاستيت تعبير بروتين فلوري أخضر (GFP) ، وتم إطلاق منطقة E3 المعدلة من البلازميد الوسيط واستعادتها إلى الاستنساخ المعدي لتوليد بلازميد غدي pKAd7-E3GFP. أخيرا ، تم خطية pKAd7-E3GFP بواسطة هضم Pme I واستخدامها لنقل خلايا التعبئة والتغليف HEK293 لإنقاذ فيروس HAdV-7 المؤتلف. في الختام ، تم تقديم استراتيجية قائمة على تجميع الحمض النووي هنا لبناء نواقل الفيروسات الغدية في المختبرات العامة للبيولوجيا الجزيئية دون الحاجة إلى مواد وأدوات متخصصة.

Introduction

على مدى العقود الثلاثة الماضية ، تم استخدام نواقل الفيروسات الغدية المؤتلفة على نطاق واسع في تطوير اللقاحات والعلاج الجيني1،2،3،4 وكذلك في الأبحاث الأساسية نظرا لخصائصها البيولوجية البارزة ، مثل كفاءة نقل الجينات العالية ، وعدم التكامل في الجينوم المضيف ، والجينوم الفيروسي المتلاعب ، وسهولة الإنتاج على نطاق واسع.

حاليا ، يتم إنشاء نواقل الفيروسات الغدية الأكثر استخداما بناء على الفيروس الغدي البشري 5 (HAdV-5) 5،6. على الرغم من أن التنبيغ بوساطة النواقل HAdV-5 يوفر نتائج مشجعة ، فقد كشفت التطبيقات قبل السريرية والسريرية عن العديد من العيوب ، (على سبيل المثال ، المناعة العالية الموجودة مسبقا المضادة للنواقل داخل البشر وكفاءة النقل المنخفضة في الخلايا التي تفتقر إلى فيروس كوكساكي ومستقبلات الفيروس الغدي (CAR)). للتحايل على هذه المشاكل ، كان هناك اهتمام كبير ببناء نواقل بناء على أنواع الفيروسات الغدية البشرية أو الثديية الأخرى3،7،8.

حتى الآن ، الطريقة الأكثر شيوعا لبناء ناقل الفيروسات الغدية هي إعادة التركيب المتماثل في البكتيريا5. يجب أن تعبر هذه السلالات البكتيرية عن إعادة التركيب ، والتي يمكن أن تؤثر على استقرار أو تضخيم البلازميدات التي تحملها. حتى أن بعض السلالات غير متوفرة تجاريا. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام طرق تستند إلى مبادئ أخرى ، بما في ذلك الكروموسومات الاصطناعية البكتيرية أو الاستنساخ المباشر أو التجميع المباشر للحمض النووي ، لتوليد استنساخات معدية من الفيروسات الغدية أو نواقل الفيروسات الغدية المؤتلفة9،10،11،12. ومع ذلك ، فإن هذه الأساليب غير ودية إلى حد ما للباحثين ذوي الخبرة القليلة في هذا المجال.

في عام 2018 ، تم تبسيط عملية بناء استنساخ فيروس غدي معدي في المختبر عن طريق ربط جينوم الفيروس مباشرة بمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يحمل العمود الفقري للبلازميد من خلال تجميع جيبسون13. بعد ذلك ، يتم الجمع بين طرق تقييد الهضم وتجميع جيبسون معا لتحميل الجينات المعدلة وراثيا إلى البلازميدات الفيروسية الغديةالموجودة 14،15،16،17،18. من أجل الراحة ، يتم استخدام تجميع التقييد فيما يلي للإشارة إلى طريقة هضم إنزيم التقييد المشترك وتجميع جيبسون. تم تطوير استراتيجيات أخرى لبناء نواقل الفيروسات الغدية من المستنسخة المعدية باستخدام تجميع التقييد19. يتمثل جوهر تجميع التقييد في تضمين الأجزاء المستقاوثة من البلازميدات قدر الإمكان في تفاعل تجميع الحمض النووي ، بينما تعمل منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل القصيرة كروابط أو بقع لتعديل البلازميد. في الوقت نفسه ، يتم الاحتفاظ بعدد الأجزاء المضمنة عند أدنى مستوى ممكن. وتعكس هذه الجهود المثمرة؛ وهذه الجهود تعكس المكافآت؛ وهذه الجهود تعكس المكافآ يمكن تقليل احتمالية حدوث طفرات غير مرغوب فيها ناتجة عن تفاعل البوليميراز المتسلسل أو تجميع الحمض النووي ، ويمكن تحسين معدل النجاح. بشكل قاطع ، تم إنشاء خط أنابيب من فيروس غدي من النوع البري إلى ناقل فيروسات غدية في المختبر13،14،15،16،17،18،19.

هنا ، نحاول تقديم هذه الأساليب من خلال تقديم أمثلة على إنشاء استنساخ معدي HAdV-7 وناقل HAdV-7 ذو كفاءة في النسخ المتماثل المحذوف E3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

ملاحظة: تصنف الفيروسات الغدية على أنها مستوى السلامة البيولوجية 2 (BSL-2) ؛ تم تنفيذ جميع خطوات استخدام الفيروسات في مختبر السلامة البيولوجية من المستوى 2. تم عزل HAdV-7 من النوع البري في عام 2017 من عينة الشفط الأنفي البلعومي لرضيع يبلغ من العمر 10 أشهر تم نقله إلى المستشفى بسبب عدوى حادة في الجهاز التنفسي في مستشفى بكينللأطفال 20. تم تخزين مخزونات الفيروس عند -80 درجة مئوية.

1. استخراج الحمض النووي الجيني HAdV-7

  1. بذرة 2.0 × 106 من خلايا HEK293 في قارورة واحدة من طراز T-25 تحتوي على 5 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) بالإضافة إلى 10٪ مصل بقري للجنين (FBS) ومزرعة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مكمل ب 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. يجب أن تكون الخلايا 80٪ -90٪ ملتقية وجاهزة للعدوى في 18-24 ساعة.
  2. تلقيح الخلايا ب HAdV-7 من النوع البري لمدة 2 ساعة. قم بإزالة الوسط المحتوي على الفيروس عن طريق الشفط وأضف 5 مل من DMEM الطازج الذي يحتوي على 2٪ FBS إلى الخلايا.
  3. استخراج الحمض النووي الجيني الفيروسي باستخدام طريقة هيرت المعدلة21
    1. في غضون يومين أو ثلاثة أيام بعد الإصابة ، عندما يلاحظ تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) على 50٪ -90٪ من الخلايا ، تخلص من المادة الطافية المزروعة واشطف الخلايا مرة واحدة باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
      ملاحظة: يعرف تأثير الاعتلال الخلوي (CPE) بأنه ظاهرة تتجمع فيها الخلايا المصابة بالفيروس وتنتفخ وتلتصق بشكل فضفاض أو تنفصل عن قارورة الثقافة إلى مجموعات تشبه العنب22.
    2. خلايا الليز في القارورة في 1.0 مل من محلول التحلل الذي يحتوي على 25 ملي مولار Tris-HCl ، و 0.5 ملي EDTA ، و 50 ميكروغرام / مل من البروتياز K ، و 0.8٪ SDS (pH7.6) لمدة 5 دقائق على الجليد. انقل المحللة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل واحتضان الأنبوب في حمام مائي عند 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. أضف 120 ميكرولتر من المخزن المؤقت لهطول الأمطار إلى الأنبوب. ضع الأنبوب على الثلج لمدة 30 دقيقة أخرى بعد الخلط برفق.
      ملاحظة: يتكون المخزن المؤقت لهطول الأمطار من 3 M CsCl و 1 M أسيتات البوتاسيوم و 0.67 M من حمض الخليك. سيساعد في ترسيب الحطام الخلوي والحمض النووي للكروموسوم الخلوي بعد الطرد المركزي مع الحفاظ على جينوم الفيروس في المادة الطافية.
    4. قم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة 25 دقيقة عند 15,000 × جم عند 4 درجات مئوية ، ثم قم بنقل المادة الطافية (حوالي 1.1 مل) إلى أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 مل.
    5. أضف 2.2 مل من الإيثانول المطلق المثلج إلى الأنبوب. تخلط برفق وتترك الأنبوب يقف على الثلج لمدة 15 دقيقة. جهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 2000 × جم في درجة حرارة الغرفة.
    6. شفط المادة الطافية بعناية واغسل الراسب (الحمض النووي الجيني للفيروس) مرة واحدة ب 800 ميكرولتر من 70٪ إيثانول. جهاز الطرد المركزي للأنبوب لمدة 6 دقائق عند 15,000 × جم في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وجفف حبيبات الحمض النووي في الأسفل بالهواء لا تفرط في تجفيف حبيبات الحمض النووي لأنها قد تسبب صعوبة في إعادة الذوبان.
    7. قم بإذابة الحبيبات في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE (10 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.0 ، 0.1 ملي مولار EDTA) ، أضف 1 ميكرولتر من RNase A (10 مجم / مل) ، واحتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. قم بتنقية الحمض النووي المذاب باستخدام مجموعة أدوات تنظيف ومكثف للحمض النووي الجينومي التجاري (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: قم بقياس الحمض النووي الجيني الفيروسي بالطريقة الشائعة الاستخدام في المختبر. بشكل عام ، يمكن الحصول على 1-5 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني في قارورة T-25 من خلايا HEK293 المصابة بالفيروس الغدي.

2. بناء استنساخ معدي ل HAdV-7 عن طريق تجميع الحمض النووي

  1. صمم بادئات PCR لتضخيم العمود الفقري للبلازميد (الشكل 1). أضف تسلسلات التداخل اللازمة لتجميع الحمض النووي إلى نهايات 5 بوصات من بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). بالإضافة إلى ذلك ، قم بتضمين مواقع التقييد غير القاطعة (على سبيل المثال ، موقع Pme I) على طرفي جينوم HAdV-7 للمساعدة في إطلاق الجينوم الفيروسي من الاستنساخ المعدي.
    ملاحظة: يتم تضخيم العمود الفقري البلازميد الذي يحتوي على جين مقاوم للمضادات الحيوية وأصل النسخ المتماثل بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل ويتم دمجها في جينوم HAdV-7. يمكن إنقاذ الفيروسات الغدية من خلايا التعبئة بكفاءة أعلى عند استخدام جينوم الفيروس الخطي بدلا من البلازميد الفيروسي الغدي الدائري. بعد النظر في العوامل المذكورة أعلاه ، تم تصميم الاشعال كما هو موضح في الشكل 1.
  2. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم جزء (Kan-Ori) يحتوي على جين مقاومة الكاناميسين (Kan) وأصل pBR322 (Ori) باستخدام pShuttle-CMV كقالب مع بادئات Ad7KanF1 و Ad7KanR1 (الجدول S1). اضبط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل على النحو التالي: دورة واحدة عند 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، ثم خمس دورات من تغيير الطبيعة عند 98 درجة مئوية لمدة 8 ثوان ، والتلدين عند 68 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 90 ثانية ، وأخيرا 25 دورة من تغيير الطبيعة عند 98 درجة مئوية لمدة 8 ثوان ، والتلدين والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
  3. قم بتشغيل منتج PCR في هلام الاغاروز بنسبة 1٪ عن طريق الرحلان الكهربائي ، وقم بتنقية الجزء باستخدام مجموعة استعادة هلام الحمض النووي التجارية.
  4. أضف Kan-Ori المستعاد والحمض النووي الجيني الفيروسي ل HAdV-7 إلى مزيج تجميع الحمض النووي التجاري. قم بإعداد تفاعل التجميع بحجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر ونسبة مولية من المتجه إلى الحمض النووي الجيني الفيروسي 1: 2. احتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: اضبط التفاعل في حجم إجمالي قدره 20 ميكرولتر مع 1-3 ميكرولتر من المتجه ، و 7-9 ميكرولتر من الحمض النووي الجيني الفيروسي ، و 10 ميكرولتر من مزيج تجميع الحمض النووي.
  5. قم بتحويل خلايا الإشريكية القولونية TOP10 المختصة كيميائيا ب 10 ميكرولتر من منتج التجميع باستخدام صدمة حرارية. انشر مزيج التحويل على ألواح Luria-Bertani (LB-Kan) المحتوية على الكاناميسين (50 ميكروغرام / مل). احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة على الأقل.
  6. قم بتلقيح ما لا يقل عن ثلاثة نسخ لكل منها 5 مل من وسط LB-Kan عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة مع رج لطيف (200-250 دورة في الدقيقة). استخرج الحمض النووي البلازميد باستخدام مجموعة Plasmid Miniprep التجارية.
  7. هضم البلازميد باستخدام نوكلياز التقييد ، ثم تحقق من حجم شظايا الحمض النووي باستخدام الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز (الشكل 2 أ). علاوة على ذلك ، قم بتأكيد مواقع الاندماج عن طريق التسلسل. يسمى بلازميد التجميع الصحيح pKan-Ad7.
  8. قم بزراعة 100 مل من البكتيريا من الاستنساخ الصحيح. استخرج مستحضر البلازميد الطويل باستخدام مجموعة البلازميد Maxprep التجارية.

3. في بناء السيليكو وتعديل البلازميد الوسيط

ملاحظة: بشكل عام ، يجب إنشاء بلازميد وسيط ، وكيفية بناء بلازميد وسيط مثالي هي الخطوة الأساسية. هناك حاجة إلى برنامج تحليل الحمض النووي مع وحدة إنزيم التقييد ، مثل pDRAW32 (برنامج مجاني ، متوفر في www.acaclone.com) ، لتصميم بلازميد وسيط.

  1. قم باستيراد تسلسل الحمض النووي ل pKan-Ad7 إلى pDRAW32 لرسم خريطة البلازميد. أضف تعليقات توضيحية إلى مناطق الاهتمام على الخريطة. بالنسبة ل pKan-Ad7 ، تم شرح مناطق E1 و E3 والعمود الفقري البلازميد (Kan-Ori).
  2. قم بتشغيل برنامج pDRAW32. انقر فوق الإعدادات > تحديد الإنزيم أولا، ثم انقر فوق الحد الأدنى/الحد الأقصى للتخفيضات. أدخل 1 في المربع Min وأدخل 2 في المربع Max ، وحدد المربع قبل في التسلسل بأكمله. أخيرا ، انقر فوق موافق لإظهار مواقع إنزيم تقييد القاطع الفريدة والمزدوجة على الخريطة.
    ملاحظة: بشكل عام ، يتم تحديد إنزيمات التقييد فقط التي تتعرف على تسلسل 6 نقاط أساس أو أكثر. كما هو موضح في الشكل 3 أ ، يتطابق 17 إنزيما مع معايير اختيار الإنزيم.
  3. ضع في اعتبارك موقع التقييد الأول الذي يحيط بمنطقة E3 حيث من المخطط تعديل E3. استوفت Hpa I و Sal I و Avr II-Mlu I و Spe I المتطلبات.
    ملاحظة: بالنسبة لهذه التجربة ، تم اختيار Hpa I لأن هضم pKan-Ad7 معه سيولد أقصر جزء يحمل منطقة E3 ، وسيجعل البلازميد الوسيط الأصغر التعديل المستقبلي أسهل. يتميز اختيار مواقع Sal I أيضا بمزايا - مثل هذا البلازميد الوسيط مناسب لتعديل كل من منطقتي E1 و E3 (الشكل S1).
  4. قم بإنشاء ملف تسلسل نهائي يعرض كلا خيوط الحمض النووي للبلازميد الوسيط pKan-Ad7HpaI. يمكن استخدام هذا التسلسل الافتراضي كقالب لتصميم بادئات متداخلة.
    1. انسخ التسلسل بين موقعي تقييد Hpa I بما في ذلك منطقة E3. للتجميع اللاحق ، من الضروري نسخ كل تسلسل ~ 20 نقطة أساس (Tm يساوي أو أكبر من 48 درجة مئوية) خارج موقع تقييد Hpa I (الشكل 3C ، التداخل النهائي 1 والتداخل النهائي 2).
    2. أضف تسلسل التعرف على Pme I (الشكل 3C ، gtttaaac) في طرفي التسلسل أعلاه.
    3. أضف تسلسل البلازميد الفقري الذي يحتوي على جين مقاوم للمضادات الحيوية وأصل النسخ المتماثل (الشكل 3C ، Kan-Ori) خارج موقع تقييد Pme I.
    4. قم باستيراد التسلسل النهائي إلى pDRAW32 لرسم خريطة البلازميد. أضف تعليقا توضيحيا إلى منطقة E3 على الخريطة.
    5. قم بتشغيل برنامج pDRAW32. انقر فوق الإعدادات > تحديد الإنزيم أولا، ثم انقر فوق الحد الأدنى/الحد الأقصى للتخفيضات. أدخل 1 في كل من المربع Min و Max ، وحدد المربع قبل بالتسلسل الكامل. انقر فوق موافق أخيرا لإظهار مواقع إنزيم التقييد الفريدة على الخريطة. يمكن ملاحظة أن الكثير من القواطع الفريدة متوفرة لتعديل E3.
      ملاحظة: بالنسبة لهذه التجربة ، تم اختيار BstZ17 I و Mlu I لاستبدال E3 الجزئي. يمكن أن يكون القاطع المزدوج مفيدا أيضا. على سبيل المثال ، يمكن اختيار القاطع المزدوج Ssp I جنبا إلى جنب مع القاطع الفريد BssH II لاستبدال منطقة E3 بأكملها باستخدام تمديد التداخل PCR.
  5. تصميم الاشعال باستخدام التسلسل الافتراضي كقالب لبناء البلازميد الوسيط (الشكل 3C).
    ملاحظة: لتقصير طول كل برايمر ، تم تصميم أربعة بادئات. سيتم استخدام منتج PCR ، الذي يتم تضخيمه باستخدام بادئات Ad7HpaIF1 و Ad7HpaIR1 ، كقالب للحصول على جزء PCR النهائي مع بادئات Ad7HpaIF2 و Ad7HpaIR2 (الشكل 3C).

4. إنقاذ الفيروس الغدي المؤتلف المعدي في خلايا HEK293

ملاحظة: يتم إنقاذ جميع الفيروسات الغدية الثلاثة التي تم إنشاؤها في هذه المقالة وفقا للبروتوكول التالي.

  1. هضم 10 ميكروغرام من البلازميد الفيروسي الغدي المؤتلف مع 2 ميكرولتر من Pme I لمدة 5 ساعات عند 37 درجة مئوية في حجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر لخطية البلازميد. تحقق من 1 ميكرولتر من الحمض النووي المهضوم على جل الاغاروز 0.8٪. يجب أن ينتج عن الهضم جزء ~ 34 كيلو بايت من جينوم الفيروسات الغدية والعمود الفقري البلازميد ~ 2.5 كيلو بايت من Kan-Ori.
  2. قم بتنقية بلازميد الفيروسات الغدية الخطي المتبقي باستخدام مجموعة أدوات تنظيف وتركيز الحمض النووي الجيني.
  3. زراعة خلايا HEK293 في DMEM بالإضافة إلى 10٪ FBS. بذور خلايا HEK293 (2 × 106 خلايا) في قارورة T-25 قبل يوم واحد من التعدي بحيث تصل إلى 70٪ -80٪ التقاء في اليوم التالي. استخدم 5 ميكروغرام من بلازميد الفيروسات الغدية المهضوم Pme I لنقل خلايا HEK293 باستخدام كواشف التعداء المتاحة تجاريا.
    ملاحظة: يجب استبدال وسط الخلايا المنقولة كل 3 أيام.
  4. افحص الخلايا كل يوم ، واجمع الخلايا ، ووسط الزراعة في أنبوب بولي بروبيلين سعة 15 مل عندما تتشكل بؤر المذنب (الشكل 2 ب ، مما يشير إلى تكاثر الفيروس).
  5. قم بتحلل الخلايا عبر ثلاث دورات تجميد وذوبان. بعد الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة عند 1200 × جم في درجة حرارة الغرفة ، اجمع المادة الطافية وقم بتخزينها عند -80 درجة مئوية لانتشار الفيروس لاحقا.
    ملاحظة: عندما يعبر الفيروس الغدي المؤتلف عن GFP أو بروتينات الفلورسنت الأخرى ، يكون من الأسهل تحديد ما إذا كان الفيروس قد تم إنقاذه بنجاح ، حيث يمكن ملاحظة البؤر التي تشكلها الخلايا الإيجابية للبروتين الفلوري تحت المجهر الفلوري بشكل حدسي.

5. بناء بلازميد الجينوم HAdV-7 المحذوف من E3

ملاحظة: يبلغ طول جينوم HAdV-7 35،239 نقطة أساس ، وتقع منطقة E3 بين 27،354 نقطة أساس و 31،057 نقطة أساس من الجينوم. لبناء بلازميد وسيط ، ابحث عن نوكلياز داخلي مع موقعين للقطع على بلازميد استنساخ المعدي ، أو اثنين من نوكليازات داخلية مع موقع قطع واحد على البلازميد. تتوفر Hpa I أو Sal I أو Avr II و Mlu I. يجب حذف التسلسل بين BstZ17 I (28,312 نقطة أساس) و Mlu I (30,757 نقطة أساس) واستبداله بشريط CMV-GFP-PA أو كاسيت CMV-mCherry-PA.

  1. هضم 600 نانوغرام من pKan-Ad7 مع Hpa I. قم بتنقية الجزء الكبير pKAd7-HpaI-FL (~ 30 كيلو بايت) والجزء الصغير pKAd7-HpaI-FS (~ 7 كيلو بايت) على التوالي ، باستخدام مجموعة استعادة هلام الحمض النووي بعد الرحلان الكهربائي للهلام. قم بتخزين pKAd7-HpaI-FL عند -20 درجة مئوية.
  2. قم بتضخيم الجزء الذي يحتوي على Kan و Ori باستخدام pShuttle-CMV كقالب باستخدام بادئات Ad7HpaIF1 و Ad7HpaIR1 (الجدول S1) بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). استعادة وتخفيف منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (2541 نقطة أساس) لاستخدامه كقالب للجولة الثانية من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم Kan-Ori2 باستخدام بادئات Ad7HpaIF2 و Ad7HpaIR2.
    1. قم بتنقية منتج PCR (2584 نقطة أساس) بعد أن يتم حلها في هلام الاغاروز بنسبة 1٪ عن طريق الرحلان الكهربائي. اضبط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل على النحو التالي: دورة واحدة عند 98 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، ثم 30 دورة من تغيير الطبيعة عند 98 درجة مئوية لمدة 8 ثوان ، والتلدين والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
      ملاحظة: الجزء المركزي من Kan-Ori2 هو الجزء الذي يحتوي على Kan و Ori ، متبوعا بتسلسلات نوكلياز تقييد فريد غير موجود في الجزء الصغير pKAd7-HpaI-FS (على سبيل المثال ، Pme I) ، والمنطقة المتداخلة مع الجزء الكبير pKAd7-HpaI-FL ؛ التسلسلات الخارجية هي المنطقة المتداخلة مع جزء صغير pKAd7-HpaI-FS.
  3. أضف منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل Kan-Ori2 و pKAd7-HpaI-FS المستعاد في الخطوة 5.1 إلى DNA Assembly Master Mix. احتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. اتبع الخطوات 2.4 - 2.6. يسمى البلازميد الصحيح pKan-Ad7HpaI (~ 10 كيلو بايت).
  4. قم بتضخيم جزء CMV-GFP-PA (~ 1.7 كيلو بايت) الذي يحتوي على محفز CMV و GFP CDS وإشارة SV40 polyA (PA) باستخدام pShuttle-GFP23 كقالب مع بادئات Ad7E3GFPF1 و Ad7E3GFPR1 (الجدول S1). قم بتنقية منتج PCR (1650 نقطة أساس) بعد حلها في هلام الاغاروز 1٪ عن طريق الرحلان الكهربائي.
    ملاحظة: يجب تضمين المناطق المتداخلة التي يمكن تجميعها باستخدام BstZ17 I و Mlu I هضمت pKan-Ad7HpaI في الاشعال ، وتتم إضافة موقع تقييد فريد (على سبيل المثال ، Sbf I) غير موجود في البلازميد pKan-Ad7 إلى الاشعال لمزيد من تجميع التقييد.
  5. هضم 300 نانوغرام من pKan-Ad7HpaI مع BstZ17 I و Mlu I. قم بتنقية جزء 7.3 كيلو بايت (يتم حذف معظم مناطق E3) بعد حلها في هلام الاغاروز بنسبة 1٪ بواسطة الرحلان الكهربائي. أضف الجزء المسترد 7.3 كيلو بايت وجزء CMV-GFP-PA المستعاد (~ 1.6 كيلو بايت) إلى DNA Assembly Master Mix. اتبع الخطوات 2.4-2.6. يسمى البلازميد الصحيح pKAd7-E3GFP (~ 9 كيلو بايت).
    ملاحظة: تنتمي جميع التسلسلات بين BstZ17 I و Mlu I إلى منطقة E3.
  6. هضم 300 نانوغرام من pKAd7-HE3GFP مع Pme I. قم بتنقية الجزء الكبير (~ 6.4 كيلو بايت) باستخدام مجموعة استعادة هلام الحمض النووي بعد الرحلان الكهربائي للهلام. أضف الجزء المنقى و pKAd7-HpaI-FL الذي تم استرداده في الخطوة 5.1 إلى DNA Assembly Master Mix. احتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. اتبع الخطوات 2.4 - 2.6. يسمى البلازميد الصحيح pKAd7-E3GFP.
  7. خلايا HEK293 الشفافة مع pKAd7-E3GFP الخطي Pme I كما هو موضح في القسم 3. يطلق على الفيروس الغدي الذي تم إنقاذه اسم Ad7-E3GFP.
  8. قم بتضخيم جزء CMV-mCherry-PA (~ 1.6 كيلو بايت) الذي يحتوي على محفز CMV و mCherry CDS و SV40 polyA باستخدام pKFAV4-CX19A كقالب مع الاشعال Ad7E3CHEF1 و Ad7E3CHER1. قم بتنقية منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل بعد حله في هلام الاغاروز 1٪ عن طريق الرحلان الكهربائي.
  9. هضم 600 نانوغرام من pKAd7-E3GFP مع Sbf I ، وتنقية الجزء من ~ 35 كيلو بايت. أضف الجزء الذي يبلغ حجمه 35 كيلو بايت وجزء CMV-mCherry-PA المستعاد إلى DNA Assembly Master Mix. احتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. اتبع الخطوات 2.4-2.6. يسمى البلازميد الصحيح pKAd7-E3CHE.
  10. خلايا HEK293 الشفافة مع pKAd7-E3CHE الخطي Pme I كما هو موضح في القسم 3. يطلق على الفيروس الغدي الذي تم إنقاذه اسم Ad7-E3CHE.

6. تضخيم وتنقية الفيروس الغدي المؤتلف في خلايا HEK293

  1. قم بتلقيح طبقة أحادية التقاء بنسبة 80٪ -90٪ من خلايا HEK293 المزروعة في ثمانية أطباق استزراع معالجة TC بقطر 150 مم بالفيروس الغدي. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة تحت تحريض خفيف. استبدل المادة الطافية ب 25 مل من DMEM تحتوي على 2٪ FBS.
  2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
    1. تخلص من معظم المواد الطاففية للأطباق الثمانية التي يبلغ قطرها 150 مم عندما يؤثر CPE على غالبية الخلايا. حصاد الخلايا المصابة باستخدام رافعات الخلايا بحجم شطف نهائي ~ 6.0 مل في أنابيب البولي بروبلين سعة 15 مل.
    2. قم بتعطيل الخلايا بثلاث دورات تجميد وذوبان الجليد لإطلاق الفيروس. قم بتنظيف المحللة عن طريق الطرد المركزي لمدة 12 دقيقة عند 1200 × جم في درجة حرارة الغرفة. اجمع المادة الطافية المحتوية على الفيروس.
  3. أضف MgCl2 (0.1 مل) ونوكلاز البنزوناز (50 وحدة / مل) إلى المادة الطافية. دوامة برفق لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية. أضف كلوريد الصوديوم (600 مل) إلى المادة الطافية والدوامة برفق لمدة 40 دقيقة أخرى عند 37 درجة مئوية. جهاز طرد مركزي لمدة 12 دقيقة عند 1200 × جم في درجة حرارة الغرفة. اجمع المادة الطافية المحتوية على الفيروس لتنقيتها.
  4. تحضير كلوريد السيزيوم (CsCl) بتركيزات مختلفة من 1.35 جم / مل و 1.30 جم / مل و 1.25 جم / مل مع 10 ملي Tris-HCl.
    1. أضف 0.8 مل من محلول CsCl سعة 1.35 جم/مل في قاع أنبوب فائق الوضوح سعة 5.1 مل باستخدام ماصة، ثم أضف ببطء 0.8 مل من محلول CsCl سعة 1.30 جم/مل و0.8 مل من محلول CsCl سعة 1.25 جم/مل أعلى المحلول الأول بالتتابع.
    2. أخيرا ، قم بتراكب ~ 2.5 مل من المادة الطافية التي تم جمعها في الخطوة 6.3 أعلى محلول CsCl 1.25 جم / مل ، واملأ الأنبوب إلى 2-3 مم من الأعلى باستخدام 10 ملي مولار Tris-HCl.
  5. جهاز طرد مركزي لمدة ساعتين عند 200,000 × جم و 8 درجات مئوية في دوار دلو متأرجح مع تسارع وتباطؤ بطيء لفصل الجسيمات الفيروسية السليمة عن الجسيمات الفيروسية المعيبة.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي ، يمكن رؤية العديد من الأشرطة البيضاء بوضوح في محلول CsCl.
  6. قم بإزالة أشرطة الجسيمات الفارغة وطبقة بقايا الخلية بعناية باستخدام الماصة ، واجمع النطاق الأدنى الذي يحتوي على فيروس ناضج باستخدام حقنة سعة 2 مل.
  7. انقل معلق الفيروس الذي تم جمعه إلى كاسيت غسيل الكلى 20 كيلو MWCO ، وغسيل الكلى في مخزن غسيل الكلى الذي يحتوي على 10 ملي مولار Tris-HCl و 150 ملي كلوريد الصوديوم و 1 ملي ملي كلوريدالصوديوم 2 و 2٪ جلسرين (درجة الحموضة 8.0) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
    1. استبدل المخزن المؤقت لغسيل الكلى الذي يحتوي على 10 ملي مولار Tris-Cl و 150 ملي كلوريد الصوديوم و 1 ملي ملي كلوريد2 و 5٪ جلسرين (درجة الحموضة 8.0) في اليوم التالي وغسيل الكلى لمدة 5 ساعات عند 4 درجات مئوية.
    2. اجمع جزيئات الفيروس التي تم تحللها باستخدام حقنة سعة 2 مل. قم بإعداد كميات متعددة من الأحجام الصغيرة المرغوبة (20-200 ميكرولتر) وتخزين الفيروس المنقى عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن تحديد عيار الجسيمات للفيروس المنقى عن طريق قياس محتوى الحمض النووي الجيني ، ويمكن تحديد عيار العدوى على خلايا HEK293 عن طريق حساب الخلايا الإيجابية ل GFP باستخدام مقايسة التخفيف المحدودة.

7. تحديد جينوم الفيروس الغدي المؤتلف عن طريق هضم إنزيم التقييد

  1. يصيب طبقة أحادية التقاء بنسبة 80٪ -90٪ من خلايا HEK293 المزروعة في قارورة واحدة من T-25 بالفيروس الغدي المؤتلف. احتضان لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. استبدل وسط الاستزراع ب DMEM الطازج الذي يحتوي على 2٪ FBS.
  2. قم بإزالة المادة الطافية للزراعة واستخرج الحمض النووي الجيني الفيروسي باستخدام طريقة Hirt المعدلة الموضحة في الخطوة 1.3 عند حدوث CPE في غضون 2-3 أيام.
  3. هضم الحمض النووي الجيني للفيروس الغدي المؤتلف بالإنزيمات المشار إليها ، وتحليل الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. كان البلازميد الفيروسي الغدي المؤتلف بمثابة عنصر تحكم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

تظهر استراتيجية بناء استنساخ معدي ل HAdV-7 في الشكل 1 والشكل 2. تم اختيار اثنين من البلازميدات المستنسخة المعدية بشكل عشوائي وتحديدها بواسطة BstZ17 I و BamH I و EcoR V ، على التوالي. أظهرت النتائج أن الشظايا كانت متوافقة مع الحجم المتوقع (ال...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

تحتوي الفيروسات الغدية المختلفة على انتوائيات مختلفة في الأنسجة ، ويمكن أن يتقلب انتشار مناعة المضيف الموجودة مسبقا ضد الفيروسات الغدية المختلفة بشكل مكثف لدى البشر24 ، مما يجذب الاهتمام ببناء نواقل فيروسات غدية جديدة للعلاج الجيني أو تطوير اللقاح. ومع ذلك...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

تم تمويل هذا البحث من قبل مؤسسة بكين للعلوم الطبيعية (7204258) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82161138001 ، 82072266) ، وصندوق CAMS للابتكار للعلوم الطبية (2019-I2M-5-026) ، والبحث والتطبيق على التتبع الجزيئي لمسببات الأمراض التنفسية الأساسية في بكين ، من قبل Capital Health Development and Research of Special (2021-1G-3012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL polypropylene microcentrifuge TubeAxygenMCT-150-CStorage of virus
15 mL polypropylene centrifuge tubesCorning430790Storage of virus
150 mm TC-treated culture dishesCorning430599Growth of HEK29E cells
20 K MWCO dialysis cassetteThermoFisher Scientific66005Dialysis of virus
Acetic acidAmresco714Extraction of DNA
Afl IINEBR0520Digestion
AgaroseTakara5260Electrophoresis
Age INEBR0552Digestion
Asc INEBR0558Digestion
BamH INEBR0136Digestion
Benzonase NucleaseSigmaE8263-25KUPurification of virus
BsrG INEBR0575Digestion
Cell lifterCorning3008Scrape off the cells 
CsClSigmaC3032Purification of virus
DNA gel recovery kitZymoD4045Recovery of DNA
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)CytivaSH30022.01HEK293 cells medium
E.coli TOP10 competent cellsTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.CB-104Transformation of assembly product
EcoR VNEBR3195Digestion
EDTAThermo Fisher ScientificR3104Extraction of DNA
Fetal bovine serum (FBS)CytivaSV30208.02HEK293 cells culture
Genomic DNA Clean and concentrator kitZymoD4065Purification of DNA
GlycerolShanghai Macklin Biochemical Co., LtdG810575Dialysis of virus
HEK293 cellsATCCCRL-1573Amplification of virus
High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0491PCR
Hind IIINEBR3104Digestion
Kanamycin sulfateAmresco408Selection of plasmid
Kpn INEBR3142Digestion
Lambda/HindIII DNA markerTakara3403Electrophoresis
LB brothBD240230LB plate for bacteria
LB mediumSolarbio Life ScienceL1010Medium for bacteria
MgCl2Sigma63068Dialysis of virus
MicrocentrifugeThermo Fisher ScientificSorvall Legend Micro 21RExtraction of DNA
NaClSigmaS5886Dialysis of virus
Nde INEBR0111Digestion
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621DNA assembly
Nhe INEBR0131Digestion
Phosphate Buffered SalineCytivaSH30256.01Washing of cells
PipetteThermo Fisher ScientificMatrixAspirate the medium
Plasmid Maxprep KitVigorous Biotechnology Beijing Co., Ltd.N001Extraction of DNA
Plasmid Miniprep KitTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.DP103Extraction of DNA
Pme INEBR0560Digestion
Potassium acetateAmresco698Extraction of DNA
Protease KThermo Fisher ScientificAM2542Extraction of DNA
pShuttle-CMVStratagene240007PCR template
RNaseBeyotimeD7089Extraction of DNA
Sal INEBR0138Digestion
Sbf INEBR3642Digestion
SDSAmresco227Extraction of DNA
Swinging-bucket rotorHITACHIS52STPurification of virus
T-25 cell flaskCorning430639Growth of HEK29E cells
T-75 cell flaskCorning430641Growth of HEK29E cells
Transfection reagentPolyplus-transfection114-15Transfection
Transmission electron microscopeFEITECNAI 12Obsevation of virus
Tris-HClAmresco234Dialysis of virus
UltracentrifugeHITACHIHimac CS120GXIIPurification of virus

References

  1. Lasaro, M. O., Ertl, H. C. New insights on adenovirus as vaccine vectors. Molecular Therapy. 17 (8), 1333-1339 (2009).
  2. Fuchs, J. D., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant adenovirus serotype 35-Vectored HIV-1 vaccine in adenovirus serotype 5 seronegative and seropositive individuals. Journal of AIDS & Clinical Research. 6 (5), (2015).
  3. Milligan, I. D., et al. Safety and immunogenicity of novel adenovirus type 26- and modified vaccinia ankara-vectored ebola vaccines: a randomized clinical trial. JAMA. 315 (15), 1610-1623 (2016).
  4. Zhu, F. C., et al. Safety, tolerability, and immunogenicity of a recombinant adenovirus type-5 vectored COVID-19 vaccine: a dose-escalation, open-label, non-randomised, first-in-human trial. Lancet. 395 (10240), 1845-1854 (2020).
  5. He, T. C., et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2509-2514 (1998).
  6. Danthinne, X., Imperiale, M. J. Production of first generation adenovirus vectors: a review. Gene Therapy. 7 (20), 1707-1714 (2000).
  7. Guo, X., et al. Systemic and mucosal immunity in mice elicited by a single immunization with human adenovirus type 5 or 41 vector-based vaccines carrying the spike protein of Middle East respiratory syndrome coronavirus. Immunology. 145 (4), 476-484 (2015).
  8. Folegatti, P. M., et al. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).
  9. Jang, Y., Bunz, F. AdenoBuilder: A platform for the modular assembly of recombinant adenoviruses. STAR Protocols. 3 (1), 101123(2022).
  10. Zhou, X., Sena-Esteves, M., Gao, G. Construction of recombinant adenovirus genomes by direct cloning. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (5), (2019).
  11. Ruzsics, Z., Lemnitzer, F., Thirion, C. Engineering adenovirus genome by bacterial artificial chromosome (BAC) technology. Methods in Molecular Biology. 1089, 143-158 (2014).
  12. Zhou, D., et al. An efficient method of directly cloning chimpanzee adenovirus as a vaccine vector. Nature Protocols. 5 (11), 1775-1785 (2010).
  13. Zou, X. H., et al. DNA assembly technique simplifies the construction of infectious clone of fowl adenovirus. Journal of Virological Methods. 257, 85-92 (2018).
  14. Guo, X., et al. Site-directed modification of adenoviral vector with combined DNA assembly and restriction-ligation cloning. Journal of Biotechnology. 307, 193-201 (2020).
  15. Liu, H., et al. Single plasmid-based, upgradable, and backward-compatible adenoviral vector systems. Human Gene Therapy. 30 (6), 777-791 (2019).
  16. Yan, B., et al. User-friendly reverse genetics system for modification of the right end of fowl adenovirus 4 genome. Viruses. 12 (3), 301(2020).
  17. Zhang, W., et al. Fiber modifications enable fowl adenovirus 4 vectors to transduce human cells. Journal of Gene Medicine. 23 (10), 3368(2021).
  18. Zou, X., et al. Fiber1, but not fiber2, is the essential fiber gene for fowl adenovirus 4 (FAdV-4). Journal of General Virology. 102 (3), 001559(2021).
  19. Guo, X., et al. Restriction-assembly: a solution to construct novel adenovirus vector. Viruses. 14 (3), 546(2022).
  20. Duan, Y., et al. Genetic analysis of human adenovirus type 7 strains circulating in different parts of China. Virologica Sinica. 36 (3), 382-392 (2021).
  21. Arad, U. Modified Hirt procedure for rapid purification of extrachromosomal DNA from mammalian cells. Biotechniques. 24 (5), 760-762 (1998).
  22. Knipe, D. M. H. P. M. Fields' Virology. 2, 1733(2013).
  23. Liu, H. Y., Han, B. J., Zhong, Y. X., Lu, Z. Z. A three-plasmid system for construction of armed oncolytic adenovirus. Journal of Virological Methods. 162 (1-2), 8-13 (2009).
  24. Mennechet, F. J. D., et al. A review of 65 years of human adenovirus seroprevalence. Expert Review of Vaccines. 18 (6), 597-613 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

HAdV 7PCRE3HEK293

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved