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요약

본 연구에서는 인간 아데노바이러스 7형(HAdV-7)의 감염성 클론을 구축하고, 감염성 클론을 변형하여 E3-deleted HAdV-7 벡터 시스템을 구축하였다. 여기에 사용된 이 전략은 다른 야생형 아데노바이러스로부터 유전자 전달 벡터를 만들기 위해 일반화될 수 있습니다.

초록

아데노바이러스 벡터는 30년 이상 유전자 치료에서 유전자 전달 도구로 사용되어 왔습니다. 여기에서는 DNA Assembly Method를 이용하여 야생형 HAdV-7의 유전체 DNA를 조작하여 아데노바이러스 벡터를 구성하는 프로토콜을 소개합니다. 첫째, HAdV-7의 감염성 클론인 pKan-Ad7은 DNA 조립을 통해 kanamycin 저항성 유전자와 복제기원(Kan-Ori)으로 구성된 플라스미드 백본의 PCR 산물과 바이러스 게놈 DNA를 융합하여 생성되었습니다. 이는 5' 말단에 HAdV-7 역말단 반복(ITR)의 말단 염기서열의 ~25 뉴클레오티드, 중간에 HAdV-7 게놈에 대한 비커터 제한 효소 부위, 3' 말단에 PCR 프라이밍을 위한 템플릿 특이적 염기서열을 포함하는 한 쌍의 PCR 프라이머를 설계하여 수행되었습니다. 둘째, 중간 플라스미드 기반 전략을 사용하여 E3 영역을 감염성 클론의 전이유전자 발현 요소로 대체하여 아데노바이러스 벡터를 생성했습니다. 간략하게, pKan-Ad7을 듀얼 커터 제한 효소 Hpa I으로 절단하고, E3 영역을 포함하는 단편을 Gibson 어셈블리에 의해 플라스미드 골격의 다른 PCR 산물로 연결하여 중간 플라스미드 pKan-Ad7HpaI을 구축했습니다. 편의상, restriction-assembly는 결합된 restriction digestion 및 assembly의 plasmid cloning 방법을 지정하는 데 사용되었습니다. 제한 조립을 사용하여 pKan-Ad7HpaI의 E3 유전자를 녹색 형광 단백질(GFP) 발현 카세트로 대체하고, 변형된 E3 영역을 중간 플라스미드에서 방출하고 감염성 클론으로 복원하여 아데노바이러스 플라스미드 pKAd7-E3GFP를 생성했습니다. 마지막으로, pKAd7-E3GFP는 Pme I 분해에 의해 선형화되어 HEK293 패키징 세포를 transfection하여 재조합 HAdV-7 바이러스를 구출하는 데 사용되었습니다. 결론적으로, 전문 재료와 기구 없이 일반 분자 생물학 실험실에서 아데노바이러스 벡터를 구성하기 위해 DNA 조립 기반 전략이 여기에 도입되었습니다.

서문

지난 30년 동안 재조합 아데노바이러스 벡터는 높은 유전자 전달 효율, 숙주 게놈에 대한 비통합, 조작 바이러스 게놈 및 대규모 생산의 용이성과 같은 뛰어난 생물학적 특성으로 인해 백신 개발 및 유전자 치료 1,2,3,4뿐만 아니라 기초 연구에도 널리 사용되었습니다.

현재 가장 일반적으로 사용되는 아데노바이러스 벡터는 인간 아데노바이러스 5(HAdV-5)5,6를 기반으로 구축됩니다. HAdV-5 벡터 매개 형질도입은 고무적인 결과를 제공하지만, 전임상 및 임상 적용에서는 몇 가지 단점이 드러났습니다(예: 인간 집단 내에서 기존의 높은 항벡터 면역 및 콕사키바이러스 및 아데노바이러스 수용체(CAR)가 결핍된 세포에서 낮은 형질도입 효율). 이러한 문제를 피하기 위해 다른 인간 또는 포유류 아데노바이러스 유형 3,7,8을 기반으로 벡터를 구성하는 데 큰 관심이 있었습니다.

지금까지 아데노바이러스 벡터를 구성하는 가장 인기 있는 방법은 박테리아 내 상동 재조합5입니다. 이러한 박테리아 균주는 재조합효소를 발현해야 하며, 이는 그들이 지닌 플라스미드의 안정성 또는 증폭에 영향을 미칠 수 있습니다. 일부 균주는 상업적으로 이용할 수 없습니다. 최근에는 박테리아 인공 염색체, 직접 복제 또는 직접 DNA 조립을 포함한 다른 원리에 기반한 방법이 아데노바이러스 또는 재조합 아데노바이러스 벡터의 감염성 클론을 생성하는 데 사용되었습니다 9,10,11,12. 그러나 이러한 방법은 이 분야에 대한 경험이 거의 없는 연구자에게는 다소 비우호적입니다.

2018년에는 Gibson Assembly13을 통해 플라스미드 백본을 운반하는 PCR 산물로 바이러스 게놈을 직접 연결함으로써 실험실에서 아데노바이러스 감염성 클론을 구성하는 과정을 단순화했습니다. 그 후, 제한 분해 및 Gibson 조립 방법을 함께 결합하여 기존 아데노바이러스 플라스미드 14,15,16,17,18에 전이유전자를 로드합니다. 편의상 이하에서는 restriction-assembly를 사용하여 restriction enzyme digestion과 Gibson assembly를 결합하는 방법을 지칭한다. restriction-assembly19를 사용하여 감염성 클론으로부터 아데노바이러스 벡터를 구축하기 위한 전략이 추가로 개발되었습니다. 제한 조립의 핵심은 DNA 조립 반응에서 플라스미드에서 절제된 단편을 가능한 한 많이 포함하는 것이며, 짧은 PCR 산물은 플라스미드 변형을 위한 링커 또는 패치 역할을 합니다. 동시에 포함된 조각의 수는 가능한 한 낮게 유지됩니다. 이러한 노력은 그 결실을 반영합니다. PCR 또는 DNA 조립으로 인한 원치 않는 돌연변이의 가능성을 최소화할 수 있으며 성공률을 높일 수 있습니다. 결론적으로, 야생형 아데노바이러스에서 아데노바이러스 벡터로의 파이프라인이 실험실에 설정되었습니다 13,14,15,16,17,18,19.

여기에서는 HAdV-7 감염성 클론 및 E3 삭제 복제 가능 HAdV-7 벡터를 구성하는 예를 제공하여 이러한 방법을 소개하려고 합니다.

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프로토콜

참고: 아데노바이러스는 생물안전성 레벨 2(BSL-2)로 분류됩니다. 바이러스를 사용하기 위한 모든 단계는 생물 안전성 레벨 2 실험실에서 수행되었습니다. 야생형 HAdV-7은 2017년 베이징 아동병원(Beijing Children's Hospital20)에서 급성 호흡기 감염으로 입원한 10개월 된 영아의 비인두 흡인 표본에서 분리되었다. 바이러스 재고는 -80°C에서 보관되었습니다.

1. HAdV-7 게놈 DNA 추출

  1. Dulbecco의 변형된 Eagle's medium(DMEM) 5mL와 10% 소 태아 혈청(FBS)을 포함하는 하나의 T-25 플라스크에 HEK293 세포 2.0 x 106 을 파종하고 5%CO2가 보충된 가습 분위기에서 37°C에서 배양합니다. 세포는 80%-90% 융합되어야 하며 18-24시간 내에 감염될 준비가 되어야 합니다.
  2. 세포에 야생형 HAdV-7을 2시간 동안 접종합니다. 흡인에 의해 바이러스 함유 배지를 제거하고 2% FBS를 함유한 신선한 DMEM 5mL를 세포에 첨가합니다.
  3. 변형된 Hirt's method21로 바이러스 게놈 DNA를 추출합니다.
    1. 감염 후 2-3일 이내에 세포의 50%-90%에서 세포병성 효과(CPE)가 관찰되면 배양 상등액을 버리고 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 한 번 헹굽니다.
      참고: 세포병성 효과(Cytopathic effect, CPE)는 바이러스에 감염된 세포가 둥글어지고, 팽창하고, 배양 플라스크에서 포도와 같은 클러스터로 느슨하게 부착 또는 분리되는 현상으로 정의됩니다22.
    2. 얼음에서 5분 동안 25mM Tris-HCl, 0.5mM EDTA, 50μg/mL 프로테아제 K 및 0.8% SDS(pH7.6)를 포함하는 1.0mL의 용해 완충액에 플라스크의 세포를 용해합니다. 용해물을 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 50°C의 수조에서 30분 동안 튜브를 배양합니다.
    3. 튜브에 120μL의 침전 버퍼를 추가합니다. 부드럽게 섞은 후 튜브를 얼음 위에 30분 더 놓습니다.
      참고: 침전 버퍼는 3M CsCl, 1M 칼륨 아세테이트 및 0.67M 아세트산으로 구성됩니다. 원심분리 후 세포 파편과 세포 염색체 DNA를 침전시키는 동시에 바이러스 게놈을 상층액에 유지하는 데 도움이 됩니다.
    4. 4°C에서 15,000 x g 에서 25분 동안 튜브를 원심분리한 다음 상등액(약 1.1mL)을 15mL 폴리프로필렌 튜브로 옮깁니다.
    5. 튜브에 얼음처럼 차가운 앱솔루트 에탄올 2.2mL를 추가합니다. 부드럽게 섞고 튜브를 얼음 위에 15분 동안 그대로 둡니다. 실온에서 2000 x g 에서 5분 동안 원심분리기.
    6. 상등액을 조심스럽게 흡인하고 침전물(바이러스 게놈 DNA)을 800μL의 70% 에탄올로 한 번 세척합니다. 실온에서 15,000 x g 에서 6분 동안 튜브를 원심분리합니다. 상등액을 버리고 하단의 DNA 펠릿을 자연 건조시킵니다. DNA 펠릿은 재용해에 어려움을 겪을 수 있으므로 과도하게 건조하지 마십시오.
    7. 펠릿을 200μL의 TE 완충액(10mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1mM EDTA)에 용해시키고 1μL의 RNase A(10mg/mL)를 첨가한 다음 37°C에서 15분 동안 튜브를 배양합니다. 상용 게놈 DNA 세척 및 농축기 키트를 사용하여 용해된 DNA를 정제합니다( 재료 표 참조).
      참고: 실험실에서 일반적으로 사용되는 방법으로 바이러스 게놈 DNA를 정량화합니다. 일반적으로 아데노바이러스에 감염된 HEK293 세포의 T-25 플라스크에서 1-5μg의 게놈 DNA를 얻을 수 있습니다.

2. DNA 조립에 의한 HAdV-7의 감염성 클론 구축

  1. 플라스미드 골격을 증폭하도록 PCR 프라이머를 설계합니다(그림 1). DNA 조립에 필요한 중첩 염기서열을 PCR 프라이머의 5' 말단에 추가합니다. 또한 HAdV-7 게놈의 양쪽 끝에 비커터 제한 부위(예: Pme I 부위)를 포함하여 감염성 클론에서 바이러스 게놈을 방출하는 데 도움을 줍니다.
    참고: 항생제 내성 유전자 및 복제 기원을 포함하는 플라스미드 골격은 PCR에 의해 증폭되고 HAdV-7 게놈에 융합됩니다. 아데노바이러스는 원형 아데노바이러스 플라스미드 대신 선형화된 바이러스 게놈을 사용할 때 더 높은 효율로 패키징 세포에서 구출될 수 있습니다. 위에서 언급한 요소들을 고려한 후, 프라이머는 그림 1과 같이 설계된다.
  2. Ad7KanF1 및 Ad7KanR1의 프라이머를 가진 주형으로 pShuttle-CMV를 사용하여 카나마이신 내성 유전자(Kan) 및 pBR322 기원(Ori)을 포함하는 단편(Kan-Ori)을 증폭하기 위해 PCR을 수행한다(표 S1). PCR 반응을 다음과 같이 설정하십시오 : 30 초 동안 98 °C에서 1 사이클, 8 초 동안 98 °C에서 변성의 5 사이클, 30 초 동안 68 °C에서 어닐링, 90 초 동안 72 °C에서 연장, 마지막으로 98 °C에서 8 초 동안 변성의 25 사이클, 2 분 동안 72 °C에서 어닐링 및 확장.
  3. 전기영동으로 PCR 산물을 1% 아가로스 겔에 넣고 상용 DNA 겔 회수 키트를 사용하여 단편을 정제합니다.
  4. 회수된 HAdV-7의 Kan-Ori 및 바이러스 게놈 DNA를 상용 DNA Assembly Master Mix에 첨가합니다. 총 부피 20 μL와 벡터 대 바이러스 게놈 DNA의 몰 비율이 1:2인 상태에서 조립 반응을 설정합니다. 50 ° C에서 1 시간 동안 배양하십시오.
    참고: 1-3 μL의 벡터, 7-9 μL의 바이러스 게놈 DNA 및 10 μL의 DNA Assembly Master Mix를 사용하여 총 20 μL의 부피로 반응을 설정합니다.
  5. 열 충격을 사용하여 화학적으로 적질된 E. coli 균주 TOP10 세포를 10μL의 조립 제품으로 변형시킵니다. 형질전환 혼합물을 카나마이신 함유(50μg/mL) Luria-Bertani(LB-Kan) 플레이트에 펴 바릅니다. 37°C에서 최소 12시간 동안 플레이트를 배양합니다.
  6. 37°C에서 12시간 동안 부드러운 쉐이킹(200-250rpm)으로 5mL의 LB-Kan 배지에 각각 3개 이상의 클론을 접종합니다. 상용 Plasmid Miniprep Kit를 사용하여 플라스미드 DNA를 추출합니다.
  7. 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 플라스미드를 분해한 다음 아가로스 겔 전기영동으로 DNA 단편의 크기를 확인합니다(그림 2A). 또한 염기서열분석을 통해 융합 부위를 확인합니다. 올바른 조립 플라스미드는 pKan-Ad7로 명명됩니다.
  8. 올바른 클론에서 100mL 박테리아 배양액을 성장시킵니다. 상용 Plasmid Maxprep Kit를 사용하여 maxi-plasmid 제제를 추출합니다.

3. 인실리코(In silico ) 구조 및 중간 플라스미드의 변형

참고: 일반적으로 중간 플라스미드를 구성해야 하며, 이상적인 중간 플라스미드를 구성하는 방법이 핵심 단계입니다. 중간 플라스미드를 설계하려면 pDRAW32(무료 소프트웨어, www.acaclone.com 에서 사용 가능)와 같은 제한 효소 모듈이 있는 DNA 분석 소프트웨어가 필요합니다.

  1. pKan-Ad7의 DNA 염기서열을 pDRAW32로 가져와 플라스미드 맵을 그립니다. 맵에서 관심 영역에 주석을 추가합니다. pKan-Ad7, E1, E3 영역 및 플라스미드 백본(Kan-Ori)에 대해 주석을 달았습니다.
  2. pDRAW32 프로그램을 운영합니다. 먼저 Settings > Enzyme Selection 을 클릭한 다음 Min/Max Cuts를 클릭합니다. Min 상자에 1을 입력하고 Max 상자에 2를 입력하고 전체 시퀀스에서 이전 상자를 선택합니다. 마지막으로 OK(확인 )를 클릭하여 고유한 이중 커터 제한 효소 부위를 지도에 표시합니다.
    참고: 일반적으로 6bp 이상의 서열을 인식하는 제한 효소만 선택됩니다. 그림 3A에서 볼 수 있듯이 17개의 효소가 효소 선택 기준과 일치합니다.
  3. E3가 수정될 계획이므로 E3 영역 측면에 있는 첫 번째 제한 사이트를 고려하십시오. Hpa I, Sal I, Avr II-Mlu I 및 Spe I이 요구 사항을 충족했습니다.
    참고: 이 실험에서는 pKan-Ad7을 pKan-Ad7로 분해하면 E3 영역을 운반하는 가장 짧은 단편이 생성되고 중간 플라스미드가 더 작을수록 향후 변형이 더 쉬워지기 때문에 Hpa I이 선택되었습니다. Sal I 부위의 선택은 또한 장점이 있는데, 이러한 중간 플라스미드는 E1 및 E3 영역의 변형에 적합합니다(그림 S1).
  4. 중간 플라스미드 pKan-Ad7HpaI의 두 DNA 가닥을 모두 표시하는 최종 염기서열 파일을 생성합니다. 이 가상 시퀀스는 중첩 프라이머를 설계하기 위한 템플릿으로 사용할 수 있습니다.
    1. E3 영역을 포함한 두 Hpa I 제한 사이트 간에 시퀀스를 복사합니다. 후속 조립을 위해 Hpa I 제한 부위 외부(그림 3C, overlap-Final 1 및 overlap-Final2) 외부로 각 ~20bp 시퀀스(Tm이 48°C 이상)를 복사해야 합니다.
    2. 위 서열의 양쪽 끝에 Pme I(그림 3C, gtttaaac)의 인식 서열을 추가합니다.
    3. 항생제 내성 유전자 및 복제 기원을 포함하는 백본 플라스미드 염기서열(그림 3C, Kan-Ori)을 Pme I 제한 부위 외부에 추가합니다.
    4. 최종 시퀀스를 pDRAW32로 가져와 플라스미드 맵을 그립니다. 맵에서 E3 지역에 주석을 추가합니다.
    5. pDRAW32 프로그램을 운영합니다. 먼저 Settings > Enzyme Selection 을 클릭한 다음 Min/Max Cuts를 클릭합니다. Min 및 Max 상자에 모두 1을 입력하고 전체 시퀀스에서 이전 상자를 선택합니다. 마지막으로 확인을 클릭하여 지도에 고유한 제한 효소 부위를 표시합니다. E3 수정에 사용할 수 있는 고유한 절단기가 많이 있음을 알 수 있습니다.
      참고: 이 실험에서는 부분 E3의 대체를 위해 BstZ17 I 및 Mlu I를 선택합니다. 이중 절단기도 유용할 수 있습니다. 예를 들어, 듀얼 커터 Ssp I과 고유한 커터 BssH II를 함께 선택하면 오버랩 확장 PCR을 사용하여 전체 E3 영역을 교체할 수 있습니다.
  5. 가상 염기서열을 중간 플라스미드 구축을 위한 템플릿으로 사용하여 프라이머를 설계합니다(그림 3C).
    참고: 각 프라이머의 길이를 줄이기 위해 4개의 프라이머가 설계되었습니다. Ad7HpaIF1 및 Ad7HpaIR1의 프라이머로 증폭된 PCR 산물은 Ad7HpaIF2 및 Ad7HpaIR2의 프라이머가 있는 최종 PCR 단편을 얻기 위한 템플릿으로 사용됩니다(그림 3C).

4. HEK293 세포에서 감염성 재조합 아데노바이러스 구제

참고: 이 문서에서 생성된 세 가지 아데노바이러스는 모두 다음 프로토콜에 따라 구출됩니다.

  1. 100μL의 총 부피 100μL에서 37°C에서 5시간 동안 2μL의 Pme I과 재조합 아데노바이러스 플라스미드 10μg을 분해하여 플라스미드를 선형화합니다. 0.8% 아가로스 겔에서 소화된 DNA 1μL를 확인합니다. 분해를 통해 ~34kb의 아데노바이러스 게놈 단편과 Kan-Ori의 ~2.5kb 플라스미드 골격이 생성되어야 합니다.
  2. genomic DNA Clean and Concentrator 키트를 사용하여 잔여물 선형화된 아데노바이러스 플라스미드를 정제합니다.
  3. DMEM과 10% FBS에서 HEK293 세포를 배양합니다. HEK293 세포(2 x 10,6 세포)를 형질주입 1일 전에 T-25 플라스크에 파종하여 다음 날 70%-80% 포화도에 도달하도록 합니다. 5μg의 Pme I digested adenoviral plasmid를 사용하여 시판되는 transfection 시약을 사용하여 HEK293 세포를 transfection합니다.
    참고: 형질주입된 세포의 배지는 3일마다 교체해야 합니다.
  4. 매일 세포를 확인하고, 세포를 수집하고, 혜성-초점이 형성될 때 15mL 폴리프로필렌 튜브에 배지를 배양합니다(그림 2B, 바이러스 복제를 나타냄).
  5. 세 번의 동결-해동 주기를 통해 세포를 용해합니다. 실온에서 1200 x g 에서 12분 동안 원심분리한 후 상등액을 채취하여 후속 바이러스 증식을 위해 -80°C에서 보관합니다.
    참고: 재조합 아데노바이러스가 GFP 또는 기타 형광 단백질을 발현할 때, 형광 단백질 양성 세포에 의해 형성된 병소를 형광 현미경으로 직관적으로 관찰할 수 있기 때문에 바이러스가 성공적으로 구출되었는지 여부를 더 쉽게 식별할 수 있습니다.

5. E3-deleted HAdV-7 게놈 플라스미드의 구축

참고: HAdV-7의 게놈은 길이가 35,239 bp이고 E3 영역은 게놈의 27,354 bp에서 31,057 bp 사이에 위치합니다. 중간 플라스미드를 구축하려면, 감염성 클론 플라스미드에 두 개의 절단 부위가 있는 엔도뉴클레아제 또는 플라스미드에 단일 절단 부위가 있는 두 개의 엔도뉴클레아제를 찾으십시오. Hpa I, Sal I 또는 Avr II 및 Mlu I를 사용할 수 있습니다. BstZ17 I(28,312 bp)와 Mlu I(30,757 bp) 사이의 서열은 삭제되고 CMV-GFP-PA 카세트 또는 CMV-mCherry-PA 카세트로 대체됩니다.

  1. 600ng의 pKan-Ad7을 Hpa I으로 분해합니다. 겔 전기영동 후 DNA 겔 회수 키트를 사용하여 큰 단편 pKAd7-HpaI-FL(~30kb) 및 작은 단편 pKAd7-HpaI-FS(~7kb)를 각각 정제합니다. pKAd7-HpaI-FL은 -20°C에서 보관하십시오.
  2. PShuttle-CMV를 주형으로 사용하여 Kan 및 Ori를 포함하는 단편을 PCR에 의해 Ad7HpaIF1 및 Ad7HpaIR1(표 S1)로 증폭합니다. PCR 생성물(2541 bp)을 회수 및 희석하여 Ad7HpaIF2 및 Ad7HpaIR2의 프라이머로 Kan-Ori2를 증폭하기 위한 PCR 반응의 2차 라운드를 위한 주형으로 사용합니다.
    1. PCR 산물(2584 bp)을 전기영동으로 1% 아가로스 겔에서 분해한 후 정제합니다. PCR 반응을 다음과 같이 놓으십시오: 30 s 동안 98 °C에 1 주기, 그 후에 8 s 동안 98 °C에 변성의 30 주기, 2 분 동안 72 °C에 어닐링 및 연장.
      참고: Kan-Ori2의 중앙 부분은 Kan 및 Ori를 포함하는 단편이며, 그 다음에는 작은 단편 pKAd7-HpaI-FS(예: Pme I)에 존재하지 않는 고유한 제한 엔도뉴클레아제의 서열과 큰 단편 pKAd7-HpaI-FL과 중첩되는 영역이 있습니다. 가장 바깥쪽 염기서열은 작은 단편 pKAd7-HpaI-FS가 있는 중첩 영역입니다.
  3. PCR 산물 Kan-Ori2와 5.1단계에서 회수된 pKAd7-HpaI-FS를 DNA Assembly Master Mix에 첨가합니다. 50 ° C에서 1 시간 동안 배양하십시오. 2.4-2.6단계를 수행합니다. 올바른 플라스미드는 pKan-Ad7HpaI(~10kb)로 명명됩니다.
  4. Ad7E3GFPF1 및 Ad7E3GFPR1의 프라이머를 가진 주형으로 pShuttle-GFP23 을 사용하여 CMV 프로모터, GFP CDS 및 SV40 polyA 신호(PA)를 포함하는 CMV-GFP-PA 단편(~1.7 kb)을 증폭합니다(표 S1). PCR 산물(1650 bp)을 전기영동으로 1% 아가로스 겔에서 분해한 후 정제합니다.
    참고: BstZ17 I 및 Mlu I에서 pKan-Ad7HpaI를 분해하여 조립할 수 있는 중첩 영역을 프라이머에 포함해야 하며, 플라스미드 pKan-Ad7에 존재하지 않는 고유한 제한 부위(예: Sbf I)를 프라이머에 추가하여 추가 제한 조립을 수행합니다.
  5. 300ng의 pKan-Ad7HpaI를 BstZ17 I 및 Mlu I.로 분해합니다.전기영동으로 1% 아가로스 겔에서 분해한 후 7.3kb(대부분의 E3 영역은 삭제됨)의 단편을 정제합니다. 회수된 7.3 kb 단편과 회수된 CMV-GFP-PA 단편(~1.6 kb)을 DNA Assembly Master Mix에 추가합니다. 2.4-2.6단계를 수행합니다. 올바른 플라스미드는 pKAd7-E3GFP (~9 kb)로 명명됩니다.
    참고: BstZ17 I와 Mlu I 사이의 모든 시퀀스는 E3 영역에 속합니다.
  6. Pme I.과 함께 pKAd7-HE3GFP 300ng을 분해합니다.겔 전기영동 후 DNA 겔 회수 키트를 사용하여 큰 단편(~6.4kb)을 정제합니다. 5.1단계에서 회수된 정제된 단편과 pKAd7-HpaI-FL을 DNA Assembly Master Mix에 첨가합니다. 50 ° C에서 1 시간 동안 배양하십시오. 2.4-2.6단계를 수행합니다. 올바른 플라스미드는 pKAd7-E3GFP로 명명됩니다.
  7. 섹션 3에 설명된 대로 HEK293 셀을 Pme I-linearized pKAd7-E3GFP로 transfection합니다. 구조된 아데노바이러스는 Ad7-E3GFP로 명명되었습니다.
  8. Ad7E3CHEF1 및 Ad7E3CHER1의 프라이머와 함께 pKFAV4-CX19A를 템플릿으로 사용하여 CMV promoter, mCherry CDS 및 SV40 polyA 신호를 포함하는 CMV-mCherry-PA 단편(~1.6kb)을 증폭합니다. 전기영동으로 1% 아가로스 겔에서 분해한 후 PCR 산물을 정제합니다.
  9. 600ng의 pKAd7-E3GFP를 Sbf I으로 분해하고 ~35kb의 단편을 정제합니다. 35kb 단편과 회수된 CMV-mCherry-PA 단편을 DNA Assembly Master Mix에 추가합니다. 50 ° C에서 1 시간 동안 배양하십시오. 2.4-2.6단계를 수행합니다. 올바른 플라스미드는 pKAd7-E3CHE로 명명됩니다.
  10. 섹션 3에 설명된 대로 HEK293 셀을 Pme I-linearized pKAd7-E3CHE로 형질주입합니다. 구조된 아데노바이러스의 이름은 Ad7-E3CHE입니다.

6. HEK293 세포에서 재조합 아데노바이러스의 증폭 및 정제

  1. 8개의 150mm 직경 TC 처리 배양 접시에서 자란 HEK293 세포의 80%-90% 융합 단층에 아데노바이러스를 접종합니다. 37 ° C에서 2 시간 동안 가벼운 교반으로 배양하십시오. 상층액을 2% FBS가 함유된 25mL의 DMEM으로 교체합니다.
  2. 세포를 37 ° C에서 2-3 일 동안 배양합니다.
    1. CPE가 대부분의 세포에 영향을 미칠 때 8개의 150mm 직경 접시 중 대부분의 상등액을 폐기합니다. 최종 용출 부피가 ~6.0 mL인 세포 리프터를 사용하여 감염된 세포를 15 mL 폴리프로필렌 튜브에 채취합니다.
    2. 바이러스를 방출하기 위해 세 번의 동결-해동 주기로 세포를 파괴합니다. 실온에서 1200 x g 에서 12분 동안 원심분리로 용해물을 세척합니다. 바이러스 함유 상층액을 수집하십시오.
  3. 상층액에 MgCl2 (0.1 mM) 및 벤조나아제 뉴클레아제(50 U/mL)를 첨가합니다. 37°C에서 40분 동안 부드럽게 소용돌이칩니다. 상층액에 NaCl(600mM)을 첨가하고 37°C에서 40분 더 부드럽게 소용돌이칩니다. 실온에서 1200 x g 에서 12분 동안 원심분리기를 사용합니다. 정제를 위해 바이러스 함유 상등액을 수집합니다.
  4. 10mM Tris-HCl로 1.35g/mL, 1.30g/mL 및 1.25g/mL의 농도가 다른 염화세슘(CsCl)을 준비합니다.
    1. 피펫을 사용하여 0.8mL의 1.35g/mL CsCl 용액을 5.1mL Ultra-Clear 튜브의 바닥에 첨가한 다음 첫 번째 용액 위에 0.8mL의 1.30g/mL CsCl 용액과 0.8mL의 1.25g/mL CsCl 용액을 순차적으로 천천히 첨가합니다.
    2. 마지막으로, 6.3 단계에서 수집 한 상등액 ~ 2.5 mL를 1.25 g / mL CsCl 용액 위에 조심스럽게 오버레이하고 10 mM Tris-HCl을 사용하여 상단에서 2-3 mm까지 튜브를 채 웁니다.
  5. 스윙 버켓 로터에서 200,000 x g 및 8°C에서 2시간 동안 느린 가속 및 감속으로 원심분리기를 수행하여 결함이 있는 바이러스 입자로부터 온전한 바이러스 입자를 분리합니다.
    참고: 원심분리 후 CsCl 용액에서 여러 개의 흰색 띠를 명확하게 볼 수 있습니다.
  6. 피펫을 사용하여 빈 입자의 띠와 세포 파편층을 조심스럽게 제거하고 2mL 주사기를 사용하여 성숙한 바이러스를 포함하는 가장 낮은 띠를 수집합니다.
  7. 수집된 바이러스 현탁액을 20K MWCO 투석 카세트로 옮기고 4°C에서 하룻밤 동안 10mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1mM MgCl2 및 2% 글리세롤(pH 8.0)을 함유한 투석 버퍼에서 투석합니다.
    1. 다음날 10mM Tris-Cl, 150mM NaCl, 1mM MgCl2 및 5% 글리세롤(pH 8.0)이 포함된 투석 완충액을 교환하고 5°C에서 4시간 투석합니다.
    2. 투석된 바이러스 입자를 2mL 주사기를 사용하여 수집합니다. 원하는 소량(20-200 μL)의 여러 부분 표본을 준비하고 정제된 바이러스를 -80 °C에서 보관합니다.
      참고: 정제된 바이러스의 입자 역가는 게놈 DNA의 함량을 측정하여 측정할 수 있으며, HEK293 세포의 감염성 역가는 제한 희석 분석법으로 GFP 양성 세포를 계수하여 측정할 수 있습니다.

7. 제한효소 분해에 의한 재조합 아데노바이러스 게놈 동정

  1. 하나의 T-25 플라스크에서 자란 HEK293 세포의 80%-90% 융합 단층을 재조합 아데노바이러스에 감염시킵니다. 37 ° C에서 2 시간 동안 배양하십시오. 배양 배지를 2% FBS를 함유한 새로운 DMEM으로 교체합니다.
  2. 배양 상층액을 제거하고 2-3일 이내에 CPE가 발생하면 1.3단계에서 설명한 변형된 Hirt's method로 바이러스 유전체 DNA를 추출합니다.
  3. 지시된 효소로 재조합 아데노바이러스의 게놈 DNA를 분해하고 아가로스 겔 전기영동을 분석합니다. 재조합 아데노바이러스 플라스미드가 대조군 역할을 했습니다.

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결과

HAdV-7의 감염성 클론 구축을 위한 전략은 그림 1 및 그림 2에 나와 있습니다. 2개의 감염성 클론 플라스미드를 무작위로 선택하여 각각 BstZ17 I, BamH I 및 EcoR V로 식별했습니다. 그 결과 단편이 예상 크기와 일치하는 것으로 나타났으며(그림 2A), 이는 플라스미드가 올바르게 구성되었음을 나타냅니다. Pme I-선?...

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토론

서로 다른 아데노바이러스는 다양한 조직 영양성을 가지고 있으며, 서로 다른 아데노바이러스에 대한 숙주 기존 면역의 유병률은 인간에서 집중적으로 변동할 수 있으며,24 이는 유전자 치료 또는 백신 개발을 위한 새로운 아데노바이러스 벡터를 구축하는 데 관심을 불러일으킵니다. 그러나 새로운 아데노바이러스 벡터 시스템의 확립은 일반 분자 생물...

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공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 베이징자연과학재단(7204258), 중국국립자연과학재단(82161138001, 82072266), CAMS 의료과학혁신기금(2019-I2M-5-026)의 지원을 받았으며, 베이징 필수 호흡기 병원체의 분자 추적에 관한 연구 및 응용은 Capital Health Development and Research of Special(2021-1G-3012)의 지원을 받았습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL polypropylene microcentrifuge TubeAxygenMCT-150-CStorage of virus
15 mL polypropylene centrifuge tubesCorning430790Storage of virus
150 mm TC-treated culture dishesCorning430599Growth of HEK29E cells
20 K MWCO dialysis cassetteThermoFisher Scientific66005Dialysis of virus
Acetic acidAmresco714Extraction of DNA
Afl IINEBR0520Digestion
AgaroseTakara5260Electrophoresis
Age INEBR0552Digestion
Asc INEBR0558Digestion
BamH INEBR0136Digestion
Benzonase NucleaseSigmaE8263-25KUPurification of virus
BsrG INEBR0575Digestion
Cell lifterCorning3008Scrape off the cells 
CsClSigmaC3032Purification of virus
DNA gel recovery kitZymoD4045Recovery of DNA
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)CytivaSH30022.01HEK293 cells medium
E.coli TOP10 competent cellsTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.CB-104Transformation of assembly product
EcoR VNEBR3195Digestion
EDTAThermo Fisher ScientificR3104Extraction of DNA
Fetal bovine serum (FBS)CytivaSV30208.02HEK293 cells culture
Genomic DNA Clean and concentrator kitZymoD4065Purification of DNA
GlycerolShanghai Macklin Biochemical Co., LtdG810575Dialysis of virus
HEK293 cellsATCCCRL-1573Amplification of virus
High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0491PCR
Hind IIINEBR3104Digestion
Kanamycin sulfateAmresco408Selection of plasmid
Kpn INEBR3142Digestion
Lambda/HindIII DNA markerTakara3403Electrophoresis
LB brothBD240230LB plate for bacteria
LB mediumSolarbio Life ScienceL1010Medium for bacteria
MgCl2Sigma63068Dialysis of virus
MicrocentrifugeThermo Fisher ScientificSorvall Legend Micro 21RExtraction of DNA
NaClSigmaS5886Dialysis of virus
Nde INEBR0111Digestion
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621DNA assembly
Nhe INEBR0131Digestion
Phosphate Buffered SalineCytivaSH30256.01Washing of cells
PipetteThermo Fisher ScientificMatrixAspirate the medium
Plasmid Maxprep KitVigorous Biotechnology Beijing Co., Ltd.N001Extraction of DNA
Plasmid Miniprep KitTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.DP103Extraction of DNA
Pme INEBR0560Digestion
Potassium acetateAmresco698Extraction of DNA
Protease KThermo Fisher ScientificAM2542Extraction of DNA
pShuttle-CMVStratagene240007PCR template
RNaseBeyotimeD7089Extraction of DNA
Sal INEBR0138Digestion
Sbf INEBR3642Digestion
SDSAmresco227Extraction of DNA
Swinging-bucket rotorHITACHIS52STPurification of virus
T-25 cell flaskCorning430639Growth of HEK29E cells
T-75 cell flaskCorning430641Growth of HEK29E cells
Transfection reagentPolyplus-transfection114-15Transfection
Transmission electron microscopeFEITECNAI 12Obsevation of virus
Tris-HClAmresco234Dialysis of virus
UltracentrifugeHITACHIHimac CS120GXIIPurification of virus

참고문헌

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