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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In dieser Studie wurde ein infektiöser Klon des humanen Adenovirus Typ 7 (HAdV-7) konstruiert und ein E3-deletiertes HAdV-7-Vektorsystem durch Modifikation des infektiösen Klons etabliert. Diese hier verwendete Strategie kann verallgemeinert werden, um Gentransfervektoren aus anderen Wildtyp-Adenoviren herzustellen.

Zusammenfassung

Adenovirale Vektoren werden seit mehr als drei Jahrzehnten als Gentransferwerkzeug in der Gentherapie eingesetzt. Hier stellen wir ein Protokoll zur Konstruktion eines adenoviralen Vektors vor, indem die genomische DNA von Wildtyp-HAdV-7 mit Hilfe einer DNA-Assemblierungsmethode manipuliert wird. Zunächst wurde ein infektiöser Klon von HAdV-7, pKan-Ad7, durch Fusion der viralen genomischen DNA mit einem PCR-Produkt aus dem Plasmidrückgrat, bestehend aus dem Kanamycin-resistenten Gen und dem Ursprung der Replikation (Kan-Ori), durch DNA-Assemblierung erzeugt. Dies geschah durch das Design eines Paares von PCR-Primern, das ~25 Nukleotide der terminalen Sequenz von HAdV-7 Inverted Terminal Repeat (ITR) am 5'-Ende, eine Non-Cutter-Restriktionsenzymstelle für das HAdV-7-Genom in der Mitte und eine Template-spezifische Sequenz für das PCR-Priming am 3'-Ende enthielt. Zweitens wurde eine intermediäre plasmidbasierte Strategie angewendet, um die E3-Region durch transgenexprimierende Elemente im infektiösen Klon zu ersetzen und einen adenoviralen Vektor zu erzeugen. Kurz gesagt, pKan-Ad7 wurde mit dem Dual-Cutter-Restriktionsenzym Hpa I verdaut, und das Fragment, das die E3-Region enthielt, wurde durch Gibson-Assemblierung an ein anderes PCR-Produkt des Plasmidrückgrats ligiert, um ein intermediäres Plasmid pKan-Ad7HpaI zu konstruieren. Der Einfachheit halber wurde Restriktionsassemblierung verwendet, um das Plasmidklonierungsverfahren des kombinierten Restriktionsaufschlusses und der Assemblierung zu bezeichnen. Mittels Restriktionsassemblierung wurden die E3-Gene in pKan-Ad7HpaI durch eine Expressionskassette für grün fluoreszierendes Protein (GFP) ersetzt, und die modifizierte E3-Region wurde aus dem intermediären Plasmid freigesetzt und dem infektiösen Klon zurückgegeben, um ein adenovirales Plasmid pKAd7-E3GFP zu erzeugen. Schließlich wurde pKAd7-E3GFP durch Pme I-Verdau linearisiert und zur Transfektion von HEK293-Verpackungszellen zur Rettung des rekombinanten HAdV-7-Virus verwendet. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass hier eine DNA-Assemblierungsstrategie vorgestellt wurde, um adenovirale Vektoren in allgemeinen Laboratorien der Molekularbiologie zu konstruieren, ohne dass spezielle Materialien und Instrumente benötigt werden.

Einleitung

In den letzten drei Jahrzehnten wurden rekombinante adenovirale Vektoren aufgrund ihrer herausragenden biologischen Eigenschaften, wie z. B. der hohen Effizienz der Gentransduktion, der Nichtintegration in das Wirtsgenom, des manipulativen viralen Genoms und der Leichtigkeit der großtechnischen Produktion, in großem Umfang in der Impfstoffentwicklung und in der Gentherapie 1,2,3,4 sowie in der Grundlagenforschung eingesetzt.

Die derzeit am häufigsten verwendeten adenoviralen Vektoren basieren auf dem humanen Adenovirus 5 (HAdV-5)5,6. Obwohl die HAdV-5-Vektor-vermittelte Transduktion ermutigende Ergebnisse liefert, haben präklinische und klinische Anwendungen mehrere Nachteile gezeigt (z. B. eine hohe bereits bestehende Anti-Vektor-Immunität in der menschlichen Bevölkerung und eine geringe Transduktionseffizienz in Zellen, denen das Coxsackievirus und der Adenovirus-Rezeptor (CAR)) fehlen). Um diese Probleme zu umgehen, besteht ein großes Interesse daran, Vektoren zu konstruieren, die auf anderen Adenovirus-Typen von Menschen oder Säugetieren basieren 3,7,8.

Bisher ist die populärste Methode zur Konstruktion eines adenoviralen Vektors die homologe Rekombination in Bakterien5. Solche Bakterienstämme müssen Rekombinasen exprimieren, die die Stabilität oder Amplifikation der Plasmide, die sie tragen, beeinträchtigen können. Einige Stämme sind sogar nicht im Handel erhältlich. In jüngster Zeit wurden Methoden, die auf anderen Prinzipien basieren, einschließlich bakterieller künstlicher Chromosomen, direkter Klonierung oder direkter DNA-Assemblierung, eingesetzt, um infektiöse Klone von Adenoviren oder rekombinanten adenoviralen Vektoren zu erzeugen 9,10,11,12. Allerdings sind diese Methoden für Forscher mit wenig Erfahrung auf diesem Gebiet etwas unfreundlich.

Im Jahr 2018 wird der Prozess der Konstruktion eines infektiösen Klons eines Adenovirus im Labor vereinfacht, indem das Virusgenom direkt mit einem PCR-Produkt ligiert wird, das das Plasmidrückgrat durch die Gibson-Assemblierung13 trägt. Danach werden die Methoden des Restriktionsverdaus und der Gibson-Assemblierung miteinander kombiniert, um Transgene an bestehende adenovirale Plasmide zu laden 14,15,16,17,18. Der Einfachheit halber wird im Folgenden "Restriktions-Assemblierung" verwendet, um sich auf das Verfahren des kombinierten Restriktionsenzymaufschlusses und der Gibson-Assemblierung zu beziehen. Es wurden Strategien weiterentwickelt, um adenovirale Vektoren aus infektiösen Klonen mit Hilfe von Restriktionsassemblierungzu konstruieren 19. Das Wesen der Restriktionsassemblierung besteht darin, Fragmente, die so weit wie möglich aus Plasmiden herausgeschnitten wurden, in eine DNA-Assemblierungsreaktion einzubeziehen, während kurze PCR-Produkte als Linker oder Pflaster für die Plasmidmodifikation dienen. Gleichzeitig wird die Anzahl der enthaltenen Fragmente so gering wie möglich gehalten. Solche Bemühungen spiegeln den Gewinn wider; Die Möglichkeit unerwünschter Mutationen, die durch PCR oder DNA-Assemblierung verursacht werden, kann minimiert und die Erfolgsrate verbessert werden. Abschließend wurde im Labor 13,14,15,16,17,18,19 eine Pipeline von einem Wildtyp-Adenovirus zu einem adenoviralen Vektor aufgebaut.

Hier versuchen wir, diese Methoden vorzustellen, indem wir Beispiele für die Konstruktion eines HAdV-7-infektiösen Klons und eines E3-deletierten replikationskompetenten HAdV-7-Vektors geben.

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Protokoll

HINWEIS: Adenoviren sind als Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) eingestuft; Alle Schritte zur Verwendung der Viren wurden in einem Labor der Biosicherheitsstufe 2 durchgeführt. Der Wildtyp-HAdV-7 wurde 2017 aus der Nasopharynxaspiratprobe eines 10 Monate alten Säuglings isoliert, der mit einer akuten Atemwegsinfektion in das Pekinger Kinderkrankenhauseingeliefert wurde 20. Die Virusbestände wurden bei -80 °C gelagert.

1. Extraktion von genomischer HAdV-7-DNA

  1. 2,0 x 10 6 der HEK293-Zellen in einen T-25-Kolben mit 5 ml Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) plus 10 % fötales Rinderserum (FBS) säen und bei 37 °C in befeuchteter Atmosphäre mit 5 % CO2 ergänzen. Die Zellen sollten in 18-24 Stunden zu 80 % konfluent und bereit für eine Infektion sein.
  2. Beimpfen Sie die Zellen 2 h lang mit Wildtyp-HAdV-7. Entfernen Sie das virushaltige Medium durch Aspiration und geben Sie 5 ml frisches DMEM mit 2 % FBS in die Zellen.
  3. Extraktion der viralen genomischen DNA mit der modifizierten Hirt-Methode21
    1. 2 oder 3 Tage nach der Infektion, wenn bei 50 % bis 90 % der Zellen eine zytopathische Wirkung (CPE) beobachtet wird, verwerfen Sie den Kulturüberstand und spülen Sie die Zellen einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
      HINWEIS: Die zytopathische Wirkung (CPE) ist definiert als ein Phänomen, bei dem sich die virusinfizierten Zellen zusammenballen, anschwellen und sich locker an den Kulturkolben anheften oder sich von ihm zu traubenartigen Clustern lösen22.
    2. Die Zellen im Kolben werden in 1,0 ml Lysepuffer mit 25 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA, 50 μg/ml Protease K und 0,8 % SDS (pH7,6) für 5 Minuten auf Eis lysiert. Übertragen Sie das Lysat in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen und inkubieren Sie das Röhrchen 30 Minuten lang in einem Wasserbad bei 50 °C.
    3. Geben Sie 120 μl Fällungspuffer in das Röhrchen. Legen Sie die Tube nach dem vorsichtigen Mischen für weitere 30 Minuten auf Eis.
      HINWEIS: Der Fällungspuffer besteht aus 3 M CsCl, 1 M Kaliumacetat und 0,67 M Essigsäure. Es wird dazu beitragen, die Zelltrümmer und die zelluläre Chromosomen-DNA nach der Zentrifugation auszufällen, während das Virusgenom im Überstand verbleibt.
    4. Zentrifugieren Sie das Röhrchen 25 Minuten lang bei 15.000 x g bei 4 °C und überführen Sie dann den Überstand (ca. 1,1 mL) in ein 15-ml-Polypropylenröhrchen.
    5. Geben Sie 2,2 mL eiskaltes absolutes Ethanol in das Röhrchen. Vorsichtig mischen und die Tube 15 min auf Eis stehen lassen. 5 min bei 2000 x g bei Raumtemperatur zentrifugieren.
    6. Den Überstand vorsichtig aspirieren und den Niederschlag (genomische DNA des Virus) einmal mit 800 μl 70%igem Ethanol waschen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen 6 min lang bei 15.000 x g bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das DNA-Kügelchen an der Unterseite. Trocknen Sie das DNA-Kügelchen nicht zu stark, da es zu Schwierigkeiten beim Wiederauflösen kommen kann.
    7. Lösen Sie das Pellet in 200 μl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM EDTA) auf, fügen Sie 1 μl RNase A (10 mg/ml) hinzu und inkubieren Sie das Röhrchen 15 Minuten lang bei 37 °C. Aufreinigen Sie die gelöste DNA mit einem kommerziellen Kit zur Reinigung und zum Konzentrator genomischer DNA (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Quantifizieren Sie die virale genomische DNA mit der im Labor gebräuchlichen Methode. Im Allgemeinen können 1-5 μg genomische DNA in einem T-25-Kolben mit HEK293-Zellen gewonnen werden, die mit dem Adenovirus infiziert sind.

2. Aufbau eines infektiösen Klons von HAdV-7 durch DNA-Assemblierung

  1. Entwerfen Sie PCR-Primer zur Amplifikation des Plasmidrückgrats (Abbildung 1). Fügen Sie die Überlappungssequenzen, die für die DNA-Assemblierung benötigt werden, zu den 5'-Enden der PCR-Primer hinzu. Darüber hinaus sind an beiden Enden des HAdV-7-Genoms Nicht-Cutter-Restriktionsstellen (z. B. Pme I-Stelle) einzuschließen, um die Freisetzung des viralen Genoms aus dem infektiösen Klon zu unterstützen.
    HINWEIS: Das Plasmidrückgrat, das das antibiotikaresistente Gen und den Replikationsursprung enthält, wird durch PCR amplifiziert und mit dem HAdV-7-Genom fusioniert. Adenoviren können mit höherer Effizienz aus Verpackungszellen gerettet werden, wenn ein linearisiertes Virusgenom anstelle eines zirkulären adenoviralen Plasmids verwendet wird. Unter Berücksichtigung der oben genannten Faktoren werden die Grundierungen wie in Abbildung 1 dargestellt ausgelegt.
  2. Führen Sie eine PCR durch, um ein Fragment (Kan-Ori) zu amplifizieren, das das Kanamycin-Resistenzgen (Kan) und den Ursprung von pBR322 (Ori) enthält, wobei pShuttle-CMV als Template mit Primern von Ad7KanF1 und Ad7KanR1 verwendet wird (Tabelle S1). Die PCR-Reaktion wird wie folgt eingestellt: ein Zyklus bei 98 °C für 30 s, dann fünf Zyklen Denaturierung bei 98 °C für 8 s, Glühen bei 68 °C für 30 s, Verlängern bei 72 °C für 90 s und schließlich 25 Zyklen Denaturierung bei 98 °C für 8 s, Glühen und Verlängern bei 72 °C für 2 min.
  3. Lassen Sie das PCR-Produkt durch Elektrophorese in einem 1%igen Agarosegel laufen und reinigen Sie das Fragment mit einem kommerziellen DNA-Gel-Rückgewinnungskit.
  4. Fügen Sie die wiedergewonnene Kan-Ori- und virale genomische DNA von HAdV-7 zum kommerziellen DNA-Assemblierungs-Mastermix hinzu. Die Assemblierungsreaktion wird in einem Gesamtvolumen von 20 μl und einem molaren Verhältnis von Vektor- zu viraler genomischer DNA von 1:2 eingerichtet. 1 h bei 50 °C inkubieren.
    HINWEIS: Stellen Sie die Reaktion in einem Gesamtvolumen von 20 μl mit 1-3 μl Vektor, 7-9 μl viraler genomischer DNA und 10 μl DNA-Assemblierungs-Mastermix ein.
  5. Die chemisch kompetenten TOP10-Zellen des E . coli-Stammes werden mit 10 μl des Assemblierungsprodukts mittels Hitzeschock transformiert. Verteilen Sie die Transformationsmischung auf kanamycinhaltige (50 μg/ml) Luria-Bertani (LB-Kan) Platten. Die Platten mindestens 12 Stunden lang bei 37 °C inkubieren.
  6. Beimpfen Sie mindestens drei Klone in jeweils 5 mL LB-Kan-Medium bei 37 °C für 12 Stunden unter leichtem Schütteln (200-250 U/min). Extrahieren Sie Plasmid-DNA mit einem kommerziellen Plasmid Miniprep Kit.
  7. Verdauen Sie das Plasmid mit Restriktionsendonukompaktase und überprüfen Sie dann die Größe der DNA-Fragmente mit Agarosegelelektrophorese (Abbildung 2A). Bestätigen Sie außerdem die Fusionsstellen durch Sequenzierung. Das korrekte Assemblierungsplasmid heißt pKan-Ad7.
  8. Züchten Sie eine 100-ml-Kultur mit Bakterien aus dem richtigen Klon. Extrahieren Sie ein Maxi-Plasmid-Präparat mit einem kommerziellen Plasmid Maxprep Kit.

3. In-silico-Konstruktion und Modifikation eines Zwischenplasmids

HINWEIS: Im Allgemeinen sollte ein Zwischenplasmid konstruiert werden, und die Konstruktion eines idealen Zwischenplasmids ist der wichtigste Schritt. Für das Design eines Zwischenplasmids wird eine DNA-Analysesoftware mit einem Restriktionsenzymmodul benötigt, wie z. B. pDRAW32 (eine kostenlose Software, die unter www.acaclone.com verfügbar ist).

  1. Importieren Sie die DNA-Sequenz von pKan-Ad7 in pDRAW32, um eine Plasmidkarte zu erstellen. Kommentieren Sie die relevanten Regionen auf der Karte. Für pKan-Ad7 wurden E1-, E3-Regionen und Plasmid-Backbone (Kan-Ori) annotiert.
  2. Bedienen Sie das Programm pDRAW32. Klicken Sie zuerst auf Einstellungen > Enzymauswahl , und klicken Sie dann auf Min/Max-Schnitte. Geben Sie 1 in das Feld Min und 2 in das Feld Max ein und aktivieren Sie das Kästchen davor in der gesamten Sequenz. Klicken Sie abschließend auf OK , um die eindeutigen und dualen Cutter-Restriktionsenzymstellen auf der Karte anzuzeigen.
    HINWEIS: Im Allgemeinen werden nur die Restriktionsenzyme ausgewählt, die eine Sequenz von 6 bp oder länger erkennen. Wie in Abbildung 3A gezeigt, entsprechen 17 Enzyme den Enzymauswahlkriterien.
  3. Betrachten Sie die erste Einschränkungsstelle, die den E3-Bereich flankiert, da die E3 geändert werden soll. Hpa I, Sal I, Avr II-Mlu I und Spe I erfüllten die Anforderung.
    HINWEIS: Für dieses Experiment wird Hpa I ausgewählt, da der Aufschluss von pKan-Ad7 damit das kürzeste Fragment erzeugen würde, das die E3-Region trägt, und ein kleineres Zwischenplasmid eine zukünftige Modifikation erleichtern würde. Die Auswahl der Sal I-Stellen hat auch Vorteile - ein solches Zwischenplasmid eignet sich sowohl für die Modifikation von E1- als auch von E3-Regionen (Abbildung S1).
  4. Erstellen Sie eine abschließende Sequenzdatei, in der beide DNA-Stränge des intermediären Plasmids pKan-Ad7HpaI angezeigt werden. Diese virtuelle Sequenz kann als Vorlage verwendet werden, um überlappende Primer zu entwerfen.
    1. Kopieren Sie die Sequenz zwischen den beiden Hpa-I-Einschränkungsstandorten, einschließlich der E3-Region. Für die nachfolgende Assemblierung ist es notwendig, jede ~20 bp-Sequenz (Tm gleich oder größer als 48°C) außerhalb der Hpa I-Restriktionsstelle zu kopieren (Abbildung 3C, overlap-final 1 und overlap-final2).
    2. Fügen Sie die Erkennungssequenz von Pme I (Abbildung 3C, gtttaaac) an beiden Enden der obigen Sequenz hinzu.
    3. Fügen Sie die Sequenz des Rückgratplasmids, das das antibiotikaresistente Gen und den Replikationsursprung (Abbildung 3C, Kan-Ori) enthält, außerhalb der Pme I-Restriktionsstelle hinzu.
    4. Importieren Sie die endgültige Sequenz in pDRAW32, um eine Plasmidkarte zu zeichnen. Kommentieren Sie die E3-Region auf der Karte.
    5. Bedienen Sie das Programm pDRAW32. Klicken Sie zuerst auf Einstellungen > Enzymauswahl und dann auf Min/Max-Schnitte. Geben Sie sowohl in das Feld Min als auch in das Max-Feld 1 ein und aktivieren Sie das Kontrollkästchen davor in der gesamten Sequenz. Klicken Sie abschließend auf OK , um die eindeutigen Restriktionsenzymstellen auf der Karte anzuzeigen. Es ist ersichtlich, dass viele einzigartige Fräser für die E3-Modifikation zur Verfügung stehen.
      ANMERKUNG: Für diesen Versuch werden BstZ17 I und Mlu I als Ersatz für partielle E3 ausgewählt. Auch ein Doppelschneider kann nützlich sein. Zum Beispiel kann der Dual-Cutter Ssp I zusammen mit dem einzigartigen Cutter BssH II für den Ersatz der gesamten E3-Region durch Verwendung von Overlap Extension PCR ausgewählt werden.
  5. Design-Primer unter Verwendung der virtuellen Sequenz als Vorlage für die Konstruktion eines intermediären Plasmids (Abbildung 3C).
    HINWEIS: Um die Länge jeder Grundierung zu verkürzen, wurden vier Grundierungen entwickelt. Das PCR-Produkt, das mit Primern von Ad7HpaIF1 und Ad7HpaIR1 amplifiziert wird, würde als Template verwendet, um das endgültige PCR-Fragment mit Primern von Ad7HpaIF2 und Ad7HpaIR2 zu erhalten (Abbildung 3C).

4. Rettung von infektiösen rekombinanten Adenoviren in HEK293-Zellen

HINWEIS: Die drei in diesem Artikel erzeugten Adenoviren werden alle gemäß dem folgenden Protokoll gerettet.

  1. 10 μg rekombinantes adenovirales Plasmid mit 2 μl Pme I für 5 h bei 37 °C in einem Gesamtvolumen von 100 μl verdauen, um das Plasmid zu linearisieren. 1 μl der verdauten DNA auf einem 0,8%igen Agarosegel prüfen. Die Verdauung sollte ein ~34 kb großes Fragment des adenoviralen Genoms und ein ~2,5 kb großes Plasmidrückgrat von Kan-Ori ergeben.
  2. Reinigen Sie den Rest des linearisierten adenoviralen Plasmids mit dem genomischen DNA-Clean- und Concentrator-Kit.
  3. Kultivieren Sie HEK293-Zellen in DMEM plus 10 % FBS. HEK293-Zellen (2 x 106 Zellen) 1 Tag vor der Transfektion in einem T-25-Kolben säen, so dass sie am nächsten Tag eine Konfluenz von 70 % bis 80 % erreichen. Verwenden Sie 5 μg Pme I verdautes adenovirales Plasmid, um HEK293-Zellen unter Verwendung kommerziell erhältlicher Transfektionsreagenzien zu transfizieren.
    HINWEIS: Das Medium der transfizierten Zellen sollte alle 3 Tage ausgetauscht werden.
  4. Überprüfen Sie die Zellen jeden Tag, sammeln Sie die Zellen und das Kulturmedium in einem 15-ml-Polypropylenröhrchen, wenn sich die Kometenherde bilden (Abbildung 2B, zeigt die Virusreplikation).
  5. Lysieren Sie die Zellen in drei Gefrier-Tau-Zyklen. Nach 12 min Zentrifugation bei 1200 x g bei Raumtemperatur wird der Überstand aufgefangen und bei -80 °C für die anschließende Virusvermehrung gelagert.
    HINWEIS: Wenn das rekombinante Adenovirus GFP oder andere fluoreszierende Proteine exprimiert, ist es einfacher zu erkennen, ob das Virus erfolgreich gerettet wurde, da die von fluoreszierenden Protein-positiven Zellen gebildeten Herde intuitiv unter einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden konnten.

5. Konstruktion eines E3-deletierten HAdV-7-Genomplasmids

HINWEIS: Das Genom von HAdV-7 ist 35.239 bp lang, und die E3-Region befindet sich zwischen 27.354 bp und 31.057 bp des Genoms. Um ein Zwischenplasmid zu konstruieren, suchen Sie eine Endonuklease mit zwei Schneidstellen auf dem infektiösen Klonplasmid oder zwei Endonukleasen mit einer einzigen Schneidstelle auf dem Plasmid. Es stehen Hpa I, Sal I oder Avr II und Mlu I zur Verfügung. Die Sequenz zwischen BstZ17 I (28.312 bp) und Mlu I (30.757 bp) ist zu streichen und durch die CMV-GFP-PA-Kassette oder CMV-mCherry-PA-Kassette zu ersetzen.

  1. Verdauen Sie 600 ng pKan-Ad7 mit Hpa I. Reinigen Sie das große Fragment pKAd7-HpaI-FL (~30 kb) bzw. das kleine Fragment pKAd7-HpaI-FS (~7 kb) mit einem DNA-Gel-Rückgewinnungskit nach der Gelelektrophorese. Lagern Sie den pKAd7-HpaI-FL bei -20 °C.
  2. Amplifizieren Sie das Kan und Ori enthaltende Fragment unter Verwendung von pShuttle-CMV als Template mit Primern von Ad7HpaIF1 und Ad7HpaIR1 (Tabelle S1) durch PCR. Das PCR-Produkt (2541 bp) wird zurückgewonnen und verdünnt, das als Template für die zweite Runde der PCR-Reaktion zur Amplifikation von Kan-Ori2 mit Primern aus Ad7HpaIF2 und Ad7HpaIR2 verwendet wird.
    1. Das PCR-Produkt (2584 bp) wird gereinigt, nachdem es durch Elektrophorese in einem 1%igen Agarosegel aufgelöst wurde. Die PCR-Reaktion wird wie folgt eingestellt: ein Zyklus bei 98 °C für 30 s, dann 30 Zyklen Denaturierung bei 98 °C für 8 s, Glühen und Verlängern bei 72 °C für 2 min.
      ANMERKUNG: Der zentrale Teil von Kan-Ori2 ist das Fragment, das Kan und Ori enthält, gefolgt von den Sequenzen einer einzigartigen Restriktionsendonuklease, die in dem kleinen Fragment pKAd7-HpaI-FS (z. B. Pme I) nicht existiert, und der überlappenden Region mit dem großen Fragment pKAd7-HpaI-FL; Die äußerste Sequenz ist die überlappende Region mit dem kleinen Fragment pKAd7-HpaI-FS.
  3. Geben Sie das PCR-Produkt Kan-Ori2 und das zurückgewonnene pKAd7-HpaI-FS in Schritt 5.1 zum DNA Assembly Master Mix hinzu. 1 h bei 50 °C inkubieren. Führen Sie die Schritte 2.4 bis 2.6 aus. Das korrekte Plasmid heißt pKan-Ad7HpaI (~10 kb).
  4. Amplifizieren Sie das CMV-GFP-PA-Fragment (~1,7 kb), das CMV-Promotor, GFP CDS und SV40 polyA-Signal (PA) enthält, unter Verwendung von pShuttle-GFP23 als Template mit Primern von Ad7E3GFPF1 und Ad7E3GFPR1 (Tabelle S1). Reinigen Sie das PCR-Produkt (1650 bp) nach dem Auflösen in einem 1%igen Agarosegel durch Elektrophorese.
    HINWEIS: Überlappende Bereiche, die mit BstZ17 I und Mlu I verdautem pKan-Ad7HpaI assembliert werden können, sollten in die Primer aufgenommen werden, und eine einzigartige Restriktionsstelle (z. B. Sbf I), die im Plasmid pKan-Ad7 nicht vorhanden ist, wird den Primern zur weiteren Restriktionsassemblierung hinzugefügt.
  5. Verdauen Sie 300 ng pKan-Ad7HpaI mit BstZ17 I und Mlu I. Reinigen Sie das Fragment von 7,3 kb (die meisten E3-Regionen sind deletiert), nachdem es durch Elektrophorese in einem 1%igen Agarosegel aufgelöst wurde. Fügen Sie das wiedergefundene 7,3 kb große Fragment und das wiedergewonnene CMV-GFP-PA-Fragment (~1,6 kb) zum DNA Assembly Master Mix hinzu. Führen Sie die Schritte 2.4-2.6 aus. Das korrekte Plasmid heißt pKAd7-E3GFP (~9 kb).
    HINWEIS: Alle Sequenzen zwischen BstZ17 I und Mlu I gehören zur E3-Region.
  6. Verdauen Sie 300 ng pKAd7-HE3GFP mit Pme I. Reinigen Sie das große Fragment (~6,4 kb) mit einem DNA-Gel-Rückgewinnungskit nach der Gelelektrophorese. Geben Sie das gereinigte Fragment und das in Schritt 5.1 gewonnene pKAd7-HpaI-FL in den DNA-Assemblierungs-Mastermix. 1 h bei 50 °C inkubieren. Führen Sie die Schritte 2.4 bis 2.6 aus. Das korrekte Plasmid heißt pKAd7-E3GFP.
  7. Transfizieren Sie HEK293-Zellen mit Pme I-linearisiertem pKAd7-E3GFP, wie in Abschnitt 3 beschrieben. Das gerettete Adenovirus trägt die Bezeichnung Ad7-E3GFP.
  8. Amplifizieren Sie das CMV-mCherry-PA-Fragment (~1,6 kb), das den CMV-Promotor, das mCherry CDS und das SV40-PolyA-Signal enthält, unter Verwendung von pKFAV4-CX19A als Template mit den Primern von Ad7E3CHEF1 und Ad7E3CHER1. Reinigen Sie das PCR-Produkt nach dem Auflösen in einem 1%igen Agarosegel durch Elektrophorese.
  9. Verdauen Sie 600 ng pKAd7-E3GFP mit Sbf I und reinigen Sie das Fragment von ~35 kb. Fügen Sie das 35 kb große Fragment und das wiedergewonnene CMV-mCherry-PA-Fragment zum DNA Assembly Master Mix hinzu. 1 h bei 50 °C inkubieren. Führen Sie die Schritte 2.4-2.6 aus. Das korrekte Plasmid heißt pKAd7-E3CHE.
  10. Transfect HEK293-Zellen mit Pme I-linearisiertem pKAd7-E3CHE wie in Abschnitt 3 beschrieben. Das gerettete Adenovirus trägt den Namen Ad7-E3CHE.

6. Amplifikation und Aufreinigung des rekombinanten Adenovirus in HEK293-Zellen

  1. Beimpfen Sie eine zu 80 % bis 90 % konfluente Monoschicht aus HEK293-Zellen, die in acht TC-behandelten Kulturschalen mit einem Durchmesser von 150 mm gezüchtet wurden, mit Adenoviren. Bei 37 °C 2 h unter leichtem Rühren inkubieren. Ersetzen Sie den Überstand durch 25 ml DMEM mit 2 % FBS.
  2. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 2-3 Tage.
    1. Entsorgen Sie den größten Teil des Überstands der acht Schalen mit einem Durchmesser von 150 mm, wenn ein CPE die Mehrheit der Zellen betrifft. Ernten Sie infizierte Zellen mit Zellliftern mit einem endgültigen Elutionsvolumen von ~6,0 mL in 15 mL Polypropylen-Röhrchen.
    2. Unterbrechen Sie die Zellen durch drei Gefrier-Tau-Zyklen, um das Virus freizusetzen. Das Lysat wird durch Zentrifugieren für 12 min bei 1200 x g bei Raumtemperatur klargestellt. Sammeln Sie den virushaltigen Überstand.
  3. MgCl2 (0,1 mM) und Benzonase-Nuklease (50 U/ml) zum Überstand geben. 40 min bei 37 °C sanft vortexen. NaCl (600 mM) zum Überstand geben und weitere 40 min bei 37 °C vorsichtig vortexen. 12 min bei 1200 x g bei Raumtemperatur zentrifugieren. Sammeln Sie den virushaltigen Überstand für die Reinigung.
  4. Bereiten Sie Cäsiumchlorid (CsCl) mit unterschiedlichen Konzentrationen von 1,35 g/ml, 1,30 g/ml und 1,25 g/ml mit 10 mM Tris-HCl vor.
    1. Geben Sie 0,8 ml 1,35 g/ml CsCl-Lösung mit einer Pipette in den Boden eines 5,1 ml Ultra-Clear-Röhrchens und fügen Sie dann langsam 0,8 ml 1,30 g/ml CsCl-Lösung und 0,8 ml 1,25 g/ml CsCl-Lösung nacheinander auf die erste Lösung hinzu.
    2. Zum Schluss legen Sie vorsichtig ~2,5 mL des in Schritt 6.3 gesammelten Überstands auf die Oberseite von 1,25 g/ml CsCl-Lösung und füllen Sie das Röhrchen bis 2-3 mm von oben mit 10 mM Tris-HCl.
  5. Zentrifugieren Sie 2 h bei 200.000 x g und 8 °C in einem Schwingrotor mit langsamer Beschleunigung und Verzögerung, um die intakten Viruspartikel von den defekten Viruspartikeln zu trennen.
    HINWEIS: Nach der Zentrifugation sind mehrere weiße Streifen in der CsCl-Lösung deutlich zu sehen.
  6. Entfernen Sie vorsichtig die Banden der leeren Partikel und die Schicht der Zelltrümmer mit der Pipette und entnehmen Sie die unterste Bande mit dem reifen Virus mit einer 2-ml-Spritze.
  7. Die gesammelte Virussuspension wird in eine 20-K-MWCO-Dialysekassette überführt und über Nacht bei 4 °C in einem Dialysepuffer dialysiert, der 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2 und 2 % Glycerin (pH 8,0) enthält.
    1. Tauschen Sie den Dialysepuffer mit 10 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2 und 5 % Glycerin (pH 8,0) am nächsten Tag aus und dialysieren Sie 5 h bei 4 °C.
    2. Sammeln Sie die dialysierten Viruspartikel mit einer 2-ml-Spritze. Bereiten Sie mehrere Aliquots mit dem gewünschten kleinen Volumen (20-200 μl) vor und lagern Sie das gereinigte Virus bei -80 °C.
      HINWEIS: Der Partikeltiter des gereinigten Virus kann durch Messung des Gehalts an genomischer DNA bestimmt werden, und der Infektiositätstiter kann an HEK293-Zellen bestimmt werden, indem GFP-positive Zellen mit dem limitierenden Verdünnungsassay gezählt werden.

7. Identifizierung des rekombinanten Adenovirus-Genoms durch Verdau von Restriktionsenzymen

  1. Infizieren Sie eine zu 80 % bis 90 % konfluente Monoschicht von HEK293-Zellen, die in einem T-25-Kolben gezüchtet wurden, mit rekombinanten Adenoviren. 2 h bei 37 °C inkubieren. Ersetzen Sie das Nährmedium durch frisches DMEM mit 2 % FBS.
  2. Entfernen Sie den Kulturüberstand und extrahieren Sie die virale genomische DNA mit der in Schritt 1.3 beschriebenen modifizierten Hirt-Methode, wenn CPE innerhalb von 2-3 Tagen auftritt.
  3. Verdauen Sie die genomische DNA des rekombinanten Adenovirus mit den angegebenen Enzymen und analysieren Sie sie auf Agarose-Gelelektrophorese. Als Kontrolle diente das rekombinante adenovirale Plasmid.

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Ergebnisse

Die Strategie für die Konstruktion eines infektiösen Klons von HAdV-7 ist in Abbildung 1 und Abbildung 2 dargestellt. Zwei infektiöse Klonplasmide wurden nach dem Zufallsprinzip ausgewählt und mit BstZ17 I, BamH I und EcoR V identifiziert. Die Ergebnisse zeigten, dass die Fragmente mit der erwarteten Größe übereinstimmten (Abbildung 2A), was darauf hindeutet, dass die Plasmide korrekt konstru...

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Diskussion

Verschiedene Adenoviren weisen unterschiedliche Gewebetropismen auf, und die Prävalenz der bereits vorhandenen Immunität des Wirts gegen verschiedene Adenoviren kann beim Menschen stark schwanken24, was das Interesse an der Konstruktion neuartiger adenoviraler Vektoren für die Gentherapie oder die Impfstoffentwicklung weckt. Die Etablierung eines neuen adenoviralen Vektorsystems bleibt jedoch für generische Laboratorien der Molekularbiologie umständlich.

...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Danksagungen

Diese Forschung wurde von der Beijing Natural Science Foundation (7204258), der National Natural Science Foundation of China (82161138001, 82072266), dem CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026) und der Forschung und Anwendung zur molekularen Rückverfolgung essentieller Atemwegserreger in Peking von der Capital Health Development and Research of Special (2021-1G-3012) finanziert.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL polypropylene microcentrifuge TubeAxygenMCT-150-CStorage of virus
15 mL polypropylene centrifuge tubesCorning430790Storage of virus
150 mm TC-treated culture dishesCorning430599Growth of HEK29E cells
20 K MWCO dialysis cassetteThermoFisher Scientific66005Dialysis of virus
Acetic acidAmresco714Extraction of DNA
Afl IINEBR0520Digestion
AgaroseTakara5260Electrophoresis
Age INEBR0552Digestion
Asc INEBR0558Digestion
BamH INEBR0136Digestion
Benzonase NucleaseSigmaE8263-25KUPurification of virus
BsrG INEBR0575Digestion
Cell lifterCorning3008Scrape off the cells 
CsClSigmaC3032Purification of virus
DNA gel recovery kitZymoD4045Recovery of DNA
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)CytivaSH30022.01HEK293 cells medium
E.coli TOP10 competent cellsTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.CB-104Transformation of assembly product
EcoR VNEBR3195Digestion
EDTAThermo Fisher ScientificR3104Extraction of DNA
Fetal bovine serum (FBS)CytivaSV30208.02HEK293 cells culture
Genomic DNA Clean and concentrator kitZymoD4065Purification of DNA
GlycerolShanghai Macklin Biochemical Co., LtdG810575Dialysis of virus
HEK293 cellsATCCCRL-1573Amplification of virus
High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0491PCR
Hind IIINEBR3104Digestion
Kanamycin sulfateAmresco408Selection of plasmid
Kpn INEBR3142Digestion
Lambda/HindIII DNA markerTakara3403Electrophoresis
LB brothBD240230LB plate for bacteria
LB mediumSolarbio Life ScienceL1010Medium for bacteria
MgCl2Sigma63068Dialysis of virus
MicrocentrifugeThermo Fisher ScientificSorvall Legend Micro 21RExtraction of DNA
NaClSigmaS5886Dialysis of virus
Nde INEBR0111Digestion
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621DNA assembly
Nhe INEBR0131Digestion
Phosphate Buffered SalineCytivaSH30256.01Washing of cells
PipetteThermo Fisher ScientificMatrixAspirate the medium
Plasmid Maxprep KitVigorous Biotechnology Beijing Co., Ltd.N001Extraction of DNA
Plasmid Miniprep KitTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.DP103Extraction of DNA
Pme INEBR0560Digestion
Potassium acetateAmresco698Extraction of DNA
Protease KThermo Fisher ScientificAM2542Extraction of DNA
pShuttle-CMVStratagene240007PCR template
RNaseBeyotimeD7089Extraction of DNA
Sal INEBR0138Digestion
Sbf INEBR3642Digestion
SDSAmresco227Extraction of DNA
Swinging-bucket rotorHITACHIS52STPurification of virus
T-25 cell flaskCorning430639Growth of HEK29E cells
T-75 cell flaskCorning430641Growth of HEK29E cells
Transfection reagentPolyplus-transfection114-15Transfection
Transmission electron microscopeFEITECNAI 12Obsevation of virus
Tris-HClAmresco234Dialysis of virus
UltracentrifugeHITACHIHimac CS120GXIIPurification of virus

Referenzen

  1. Lasaro, M. O., Ertl, H. C. New insights on adenovirus as vaccine vectors. Molecular Therapy. 17 (8), 1333-1339 (2009).
  2. Fuchs, J. D., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant adenovirus serotype 35-Vectored HIV-1 vaccine in adenovirus serotype 5 seronegative and seropositive individuals. Journal of AIDS & Clinical Research. 6 (5), (2015).
  3. Milligan, I. D., et al. Safety and immunogenicity of novel adenovirus type 26- and modified vaccinia ankara-vectored ebola vaccines: a randomized clinical trial. JAMA. 315 (15), 1610-1623 (2016).
  4. Zhu, F. C., et al. Safety, tolerability, and immunogenicity of a recombinant adenovirus type-5 vectored COVID-19 vaccine: a dose-escalation, open-label, non-randomised, first-in-human trial. Lancet. 395 (10240), 1845-1854 (2020).
  5. He, T. C., et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2509-2514 (1998).
  6. Danthinne, X., Imperiale, M. J. Production of first generation adenovirus vectors: a review. Gene Therapy. 7 (20), 1707-1714 (2000).
  7. Guo, X., et al. Systemic and mucosal immunity in mice elicited by a single immunization with human adenovirus type 5 or 41 vector-based vaccines carrying the spike protein of Middle East respiratory syndrome coronavirus. Immunology. 145 (4), 476-484 (2015).
  8. Folegatti, P. M., et al. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).
  9. Jang, Y., Bunz, F. AdenoBuilder: A platform for the modular assembly of recombinant adenoviruses. STAR Protocols. 3 (1), 101123(2022).
  10. Zhou, X., Sena-Esteves, M., Gao, G. Construction of recombinant adenovirus genomes by direct cloning. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (5), (2019).
  11. Ruzsics, Z., Lemnitzer, F., Thirion, C. Engineering adenovirus genome by bacterial artificial chromosome (BAC) technology. Methods in Molecular Biology. 1089, 143-158 (2014).
  12. Zhou, D., et al. An efficient method of directly cloning chimpanzee adenovirus as a vaccine vector. Nature Protocols. 5 (11), 1775-1785 (2010).
  13. Zou, X. H., et al. DNA assembly technique simplifies the construction of infectious clone of fowl adenovirus. Journal of Virological Methods. 257, 85-92 (2018).
  14. Guo, X., et al. Site-directed modification of adenoviral vector with combined DNA assembly and restriction-ligation cloning. Journal of Biotechnology. 307, 193-201 (2020).
  15. Liu, H., et al. Single plasmid-based, upgradable, and backward-compatible adenoviral vector systems. Human Gene Therapy. 30 (6), 777-791 (2019).
  16. Yan, B., et al. User-friendly reverse genetics system for modification of the right end of fowl adenovirus 4 genome. Viruses. 12 (3), 301(2020).
  17. Zhang, W., et al. Fiber modifications enable fowl adenovirus 4 vectors to transduce human cells. Journal of Gene Medicine. 23 (10), 3368(2021).
  18. Zou, X., et al. Fiber1, but not fiber2, is the essential fiber gene for fowl adenovirus 4 (FAdV-4). Journal of General Virology. 102 (3), 001559(2021).
  19. Guo, X., et al. Restriction-assembly: a solution to construct novel adenovirus vector. Viruses. 14 (3), 546(2022).
  20. Duan, Y., et al. Genetic analysis of human adenovirus type 7 strains circulating in different parts of China. Virologica Sinica. 36 (3), 382-392 (2021).
  21. Arad, U. Modified Hirt procedure for rapid purification of extrachromosomal DNA from mammalian cells. Biotechniques. 24 (5), 760-762 (1998).
  22. Knipe, D. M. H. P. M. Fields' Virology. 2, 1733(2013).
  23. Liu, H. Y., Han, B. J., Zhong, Y. X., Lu, Z. Z. A three-plasmid system for construction of armed oncolytic adenovirus. Journal of Virological Methods. 162 (1-2), 8-13 (2009).
  24. Mennechet, F. J. D., et al. A review of 65 years of human adenovirus seroprevalence. Expert Review of Vaccines. 18 (6), 597-613 (2019).

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