JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu çalışmada, insan adenovirüsü tip 7'nin (HAdV-7) enfeksiyöz bir klonu oluşturuldu ve enfeksiyöz klon modifiye edilerek E3 ile silinen bir HAdV-7 vektör sistemi kuruldu. Burada kullanılan bu strateji, diğer vahşi tip adenovirüslerden gen transfer vektörleri yapmak için genelleştirilebilir.

Özet

Adenoviral vektörler, otuz yılı aşkın bir süredir gen terapisinde bir gen transfer aracı olarak kullanılmaktadır. Burada, bir DNA birleştirme yöntemi kullanarak vahşi tip HAdV-7'nin genomik DNA'sını manipüle ederek bir adenoviral vektör oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. İlk olarak, HAdV-7'nin enfeksiyöz bir klonu olan pKan-Ad7, viral genomik DNA'nın, DNA montajı yoluyla kanamisine dirençli gen ve replikasyonun kökeninden (Kan-Ori) oluşan plazmit omurgasından bir PCR ürünü ile kaynaştırılmasıyla üretildi. Bu, 5' ucunda HAdV-7 ters terminal tekrarının (ITR) terminal dizisinin ~ 25 nükleotidini, ortada HAdV-7 genomu için kesici olmayan bir kısıtlama enzim bölgesini içeren bir çift PCR primeri ve 3' ucunda PCR astarlaması için şablona özgü bir dizi tasarlanarak yapıldı. İkinci olarak, bir adenoviral vektör oluşturmak için E3 bölgesini enfeksiyöz klondaki transgen eksprese eden elementlerle değiştirmek için bir ara plazmid tabanlı strateji kullanıldı. Kısaca, pKan-Ad7, çift kesicili kısıtlama enzimi Hpa I ile sindirildi ve E3 bölgesini içeren fragman, bir ara plazmid pKan-Ad7HpaI oluşturmak için Gibson düzeneği tarafından plazmit omurgasının başka bir PCR ürününe bağlandı. Kolaylık sağlamak için, kombine kısıtlama sindirimi ve montajı için plazmit klonlama yöntemini belirtmek için kısıtlama montajı kullanıldı. Kısıtlama düzeneği kullanılarak, pKan-Ad7HpaI'deki E3 genleri, yeşil bir floresan protein (GFP) ekspresyon kaseti ile değiştirildi ve modifiye edilmiş E3 bölgesi, ara plazmitten salındı ve bir adenoviral plazmit pKAd7-E3GFP oluşturmak için enfeksiyöz klona geri yüklendi. Son olarak, pKAd7-E3GFP, Pme I sindirimi ile doğrusallaştırıldı ve rekombinant HAdV-7 virüsünü kurtarmak için HEK293 paketleme hücrelerini transfekte etmek için kullanıldı. Sonuç olarak, burada genel moleküler biyoloji laboratuvarlarında özel malzeme ve aletlere ihtiyaç duymadan adenoviral vektörler oluşturmak için DNA montajına dayalı bir strateji tanıtıldı.

Giriş

Son otuz yılda, rekombinant adenoviral vektörler, yüksek gen iletim verimliliği, konakçı genoma entegrasyon olmaması, manipülatif viral genom ve büyük ölçekli üretim kolaylığı gibi olağanüstü biyolojik özellikleri nedeniyle aşı geliştirme ve gen terapisi 1,2,3,4'te ve ayrıca temel araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır.

Şu anda, en yaygın olarak kullanılan adenoviral vektörler, insan adenovirüsü 5 (HAdV-5)5,6'ya dayalı olarak oluşturulmuştur. HAdV-5 vektör aracılı transdüksiyon cesaret verici sonuçlar sağlasa da, preklinik ve klinik uygulamalar çeşitli dezavantajları ortaya çıkarmıştır (ör., insan popülasyonunda önceden var olan yüksek anti-vektör bağışıklığı ve coxsackievirus ve adenovirüs reseptörü (CAR) olmayan hücrelerde düşük transdüksiyon verimliliği). Bu sorunların üstesinden gelmek için, diğer insan veya memeli adenovirüs tiplerinedayalı vektörler oluşturmaya büyük ilgi duyulmuştur 3,7,8.

Şimdiye kadar, bir adenoviral vektör oluşturmak için en popüler yöntem bakterilerdehomolog rekombinasyondur 5. Bu tür bakteri suşları, taşıdıkları plazmitlerin stabilitesini veya amplifikasyonunu etkileyebilecek rekombinazları ifade etmelidir. Hatta bazı suşlar ticari olarak mevcut değildir. Son zamanlarda, adenovirüs veya rekombinant adenoviral vektörlerin(9,10,11,12) enfeksiyöz klonlarını oluşturmak için bakteriyel yapay kromozomlar, doğrudan klonlama veya doğrudan DNA montajı dahil olmak üzere diğer ilkelere dayanan yöntemler kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yöntemler, bu alanda çok az deneyime sahip araştırmacılar için biraz düşmancadır.

2018 yılında, bir adenovirüs enfeksiyöz klonu oluşturma süreci, virüs genomunun Gibson düzeneği13 aracılığıyla plazmit omurgası taşıyan bir PCR ürünü ile doğrudan bağlanmasıyla laboratuvarda basitleştirildi. Bundan sonra, kısıtlama sindirimi ve Gibson montajı yöntemleri, transgenleri mevcut adenoviral plazmitlere 14,15,16,17,18 yüklemek için bir araya getirilir. Kolaylık sağlamak adına, kısıtlama montajı bundan sonra kombine kısıtlama enzimi sindirimi ve Gibson montajı yöntemine atıfta bulunmak için kullanılacaktır. Enfeksiyöz klonlardan adenoviral vektörler oluşturmak için kısıtlama düzeneği19 kullanılarak stratejiler daha da geliştirilmiştir. Kısıtlama düzeneğinin özü, bir DNA birleştirme reaksiyonunda mümkün olduğunca plazmitlerden eksize edilen fragmanları dahil etmektir, kısa PCR ürünleri ise plazmit modifikasyonu için bağlayıcılar veya yamalar olarak işlev görür. Aynı zamanda, dahil edilen parça sayısı mümkün olduğunca düşük tutulur. Bu tür çabalar getiriyi yansıtır; PCR veya DNA montajının neden olduğu istenmeyen mutasyon olasılığı en aza indirilebilir ve başarı oranı iyileştirilebilir. Sonuç olarak, laboratuvarda 13,14,15,16,17,18,19 vahşi tip bir adenovirüsten bir adenoviral vektöre bir boru hattı kurulmuştur.

Burada, bir HAdV-7 bulaşıcı klonu ve E3 ile silinmiş çoğaltma yetkin bir HAdV-7 vektörü oluşturma örnekleri sağlayarak bu yöntemleri tanıtmaya çalışıyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: Adenovirüsler Biyogüvenlik Seviye 2 (BSL-2) olarak sınıflandırılır; Virüsleri kullanmak için tüm adımlar bir biyogüvenlik seviye 2 laboratuvarında gerçekleştirildi. Vahşi tip HAdV-7, 2017 yılında Pekin Çocuk Hastanesi20'de akut solunum yolu enfeksiyonu ile hastaneye kaldırılan 10 aylık bir bebeğin nazofaringeal aspirat örneğinden izole edildi. Virüs stokları -80 °C'de depolandı.

1. HAdV-7 genomik DNA'nın ekstraksiyonu

  1. 5 mL Dulbecco'nun modifiye Eagle's besiyeri (DMEM) artı %10 fetal sığır serumu (FBS) içeren bir T-25 şişesinde HEK293 hücrelerinin 2.0 x10 6'sını tohumlayın ve nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de %5 CO2 ile desteklenmiş kültür. Hücreler% 80 -% 90 oranında birleşik olmalı ve 18-24 saat içinde enfeksiyona hazır olmalıdır.
  2. Hücreleri 2 saat boyunca vahşi tip HAdV-7 ile aşılayın. Virüs içeren ortamı aspirasyon ile çıkarın ve hücrelere %2 FBS içeren 5 mL taze DMEM ekleyin.
  3. Viral genomik DNA'yı modifiye edilmiş Hirt'in yöntemi21 ile ekstrakte edin
    1. Enfeksiyondan 2 veya 3 gün sonra, hücrelerin% 50-90'ında sitopatik etki (CPE) gözlendiğinde, kültür süpernatanını atın ve hücreleri bir kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın.
      NOT: Sitopatik etki (CPE), virüsle enfekte olmuş hücrelerin toplandığı, şiştiği ve kültür şişesinden üzüm benzeri kümeler halinde gevşek bir şekilde bağlandığı veya ayrıldığı bir fenomen olarak tanımlanır22.
    2. Buz üzerinde 5 dakika boyunca 25 mM Tris-HCl, 0.5 mM EDTA, 50 μg/mL proteaz K ve %0.8 SDS (pH 7.6) içeren 1.0 mL lizis tamponundaki şişedeki lizaz hücreleri. Lizatı 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve tüpü 50 ° C'de 30 dakika boyunca bir su banyosunda inkübe edin.
    3. Tüpe 120 μL yağış tamponu ekleyin. Tüpü hafifçe karıştırdıktan sonra 30 dakika daha buzun üzerine koyun.
      NOT: Çökeltme tamponu 3 M CsCl, 1 M potasyum asetat ve 0.67 M asetik asitten oluşur. Virüs genomunu süpernatantta tutarken, santrifüjlemeden sonra hücresel kalıntıların ve hücresel kromozom DNA'sının çökeltilmesine yardımcı olacaktır.
    4. Tüpü 4 ° C'de 15.000 x g'de 25 dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanı (yaklaşık 1.1 mL) 15 mL'lik bir polipropilen tüpe aktarın.
    5. Tüpe 2.2 mL buz gibi mutlak etanol ekleyin. Yavaşça karıştırın ve tüpü 15 dakika buz üzerinde bekletin. Oda sıcaklığında 2000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
    6. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve çökeltiyi (virüs genomik DNA'sı) bir kez 800 μL% 70 etanol ile yıkayın. Tüpü oda sıcaklığında 15.000 x g'da 6 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve alttaki DNA peletini havayla kurutun. Yeniden çözünmede zorluğa neden olabileceğinden DNA peletini fazla kurutmayın.
    7. Peleti 200 μL TE tamponunda (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) çözün, 1 μL RNase A (10 mg / mL) ekleyin ve tüpü 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin. Ticari bir genomik DNA temizleme ve yoğunlaştırıcı kiti kullanarak çözünmüş DNA'yı saflaştırın (bkz. Malzeme Tablosu).
      NOT: Laboratuvarda yaygın olarak kullanılan yöntemle viral genomik DNA'yı ölçün. Genel olarak, adenovirüs ile enfekte olmuş HEK293 hücrelerinin bir T-25 şişesinde 1-5 μg genomik DNA elde edilebilir.

2. DNA montajı ile HAdV-7'nin enfeksiyöz klonunun yapımı

  1. Plazmid omurgasını amplifiye etmek için PCR primerleri tasarlayın (Şekil 1). DNA montajı için gerekli olan örtüşme dizilerini PCR primerlerinin 5' uçlarına ekleyin. Ek olarak, viral genomun bulaşıcı klondan salınmasına yardımcı olmak için HAdV-7 genomunun her iki ucuna kesici olmayan kısıtlama bölgeleri (örneğin, Pme I bölgesi) ekleyin.
    NOT: Antibiyotiğe dirençli gen ve replikasyon kökeni içeren plazmit omurgası, PCR ile amplifiye edilir ve HAdV-7 genomuna kaynaştırılır. Adenovirüsler, dairesel bir adenoviral plazmit yerine doğrusallaştırılmış virüs genomu kullanıldığında daha yüksek verimlilikle ambalaj hücrelerinden kurtarılabilir. Yukarıda belirtilen faktörler göz önünde bulundurulduktan sonra, astarlar Şekil 1'de gösterildiği gibi tasarlanır.
  2. Kanamisin direnç geni (Kan) ve pBR322 orijini (Ori) içeren bir fragmanı (Kan-Ori) amplifiye etmek için Ad7KanF1 ve Ad7KanR1 primerleri ile şablon olarak pShuttle-CMV kullanarak PCR gerçekleştirin (Tablo S1). PCR reaksiyonunu aşağıdaki gibi ayarlayın: 30 saniye boyunca 98 ° C'de bir döngü, ardından 8 saniye boyunca 98 ° C'de beş döngü denatüre etme, 30 saniye boyunca 68 ° C'de tavlama, 90 saniye boyunca 72 ° C'de uzatma ve son olarak 8 saniye boyunca 98 ° C'de 25 döngü denatüre etme, tavlama ve 72 ° C'de 2 dakika boyunca uzatma.
  3. PCR ürününü elektroforez yoluyla %1'lik bir agaroz jel içinde çalıştırın ve ticari bir DNA jeli geri kazanım kiti kullanarak parçayı saflaştırın.
  4. HAdV-7'nin geri kazanılmış Kan-Ori ve viral genomik DNA'sını ticari DNA Assembly Master Mix'e ekleyin. Montaj reaksiyonunu toplam 20 μL'lik bir hacimde ve vektörün viral genomik DNA'ya molar oranı 1:2'de ayarlayın. 50 °C'de 1 saat inkübe edin.
    NOT: Reaksiyonu 1-3 μL vektör, 7-9 μL viral genomik DNA ve 10 μL DNA Assembly Master Mix ile toplam 20 μL hacimde ayarlayın.
  5. Kimyasal olarak yetkin E. coli suşu TOP10 hücrelerini, ısı şoku kullanarak 10 μL montaj ürünü ile dönüştürün. Dönüşüm karışımını kanamisin içeren (50 μg / mL) Luria-Bertani (LB-Kan) plakalarına yayın. Plakaları 37 °C'de en az 12 saat inkübe edin.
  6. Hafifçe çalkalayarak (200-250 rpm) 12 saat boyunca 37 ° C'de 5 mL LB-Kan ortamında en az üç klon aşılayın. Ticari bir Plazmid Miniprep Kiti kullanarak plazmit DNA'yı çıkarın.
  7. Restriksiyon endonükleaz kullanarak plazmidi sindirin ve ardından agaroz jel elektroforezi ile DNA fragmanlarının boyutunu kontrol edin (Şekil 2A). Ayrıca, füzyon bölgelerini sıralayarak onaylayın. Doğru montaj plazmidi pKan-Ad7 olarak adlandırılır.
  8. Doğru klondan 100 mL'lik bir bakteri kültürü büyütün. Ticari bir Plazmid Maxprep Kiti kullanarak bir maksi-plazmit preparatını çıkarın.

3. Bir ara plazmitin in silico yapımı ve modifikasyonu

NOT: Genel olarak, bir ara plazmit oluşturulmalıdır ve ideal bir ara plazmitin nasıl oluşturulacağı anahtar adımdır. Bir ara plazmidin tasarımı için pDRAW32 (www.acaclone.com'da bulunan ücretsiz bir yazılım) gibi bir kısıtlama enzim modülüne sahip DNA analiz yazılımına ihtiyaç vardır.

  1. Bir plazmit haritası çizmek için pKan-Ad7'nin DNA dizisini pDRAW32'ye aktarın. Haritada ilgilenilen bölgelere açıklama ekleyin. pKan-Ad7 için E1, E3 bölgeleri ve plazmit omurgası (Kan-Ori) açıklandı.
  2. pDRAW32 programını çalıştırın. Önce Ayarlar > Enzim Seçimi'ne tıklayın ve ardından Min/Maks Kesimler'e tıklayın. Min kutusuna 1 girin ve Max kutusuna 2 girin ve tüm dizide önceki kutuyu işaretleyin. Son olarak, tıklayın OK haritada benzersiz ve çift kesici kısıtlama enzim bölgelerini göstermek için.
    NOT: Genel olarak, yalnızca 6 bp veya daha uzun bir diziyi tanıyan kısıtlama enzimleri seçilir. Şekil 3A'da gösterildiği gibi, 17 enzim enzim seçim kriterlerine uymaktadır.
  3. E3'ün değiştirilmesi planlandığından, E3 bölgesini çevreleyen ilk kısıtlama bölgesini düşünün. Hpa I, Sal I, Avr II-Mlu I ve Spe I gereksinimi karşıladı.
    NOT: Bu deney için, Hpa I seçilmiştir, çünkü pKan-Ad7'nin onunla sindirilmesi, E3 bölgesini taşıyan en kısa parçayı oluşturacaktır ve daha küçük bir ara plazmit, gelecekteki modifikasyonu kolaylaştıracaktır. Sal I bölgelerinin seçiminin de avantajları vardır - böyle bir ara plazmit, hem E1 hem de E3 bölgelerinin modifikasyonu için uygundur (Şekil S1).
  4. Ara plazmid pKan-Ad7HpaI'nin her iki DNA zincirini de gösteren son bir dizi dosyası oluşturun. Bu sanal dizi, üst üste binen astarları tasarlamak için bir şablon olarak kullanılabilir.
    1. E3 bölgesi de dahil olmak üzere iki Hpa I kısıtlama bölgesi arasındaki diziyi kopyalayın. Sonraki montaj için, her ~20 bp dizisinin (Tm, 48 ° C'ye eşit veya daha büyük) Hpa I kısıtlama bölgesinin dışına kopyalanması gerekir (Şekil 3C, örtüşme-Final 1 ve örtüşme-Final2).
    2. Yukarıdaki dizinin her iki ucuna Pme I'in (Şekil 3C, gtttaaac) tanıma dizisini ekleyin.
    3. Antibiyotiğe dirençli gen ve replikasyon kökeni (Şekil 3C, Kan-Ori) içeren omurga plazmid dizisini Pme I kısıtlama bölgesinin dışına ekleyin.
    4. Bir plazmit haritası çizmek için son diziyi pDRAW32'ye aktarın. Haritada E3 bölgesini açıklama ekleyin.
    5. pDRAW32 programını çalıştırın. Önce Ayarlar > Enzim Seçimi'ne tıklayın ve ardından Min/Maks Kesimler'e tıklayın. Hem Min hem de Max kutusuna 1 girin ve tüm diziden önceki kutuyu işaretleyin. Haritada benzersiz kısıtlama enzim bölgelerini göstermek için son olarak Tamam'ı tıklayın. E3 modifikasyonu için birçok benzersiz kesicinin mevcut olduğu görülebilir.
      NOT: Bu deney için, kısmi E3'ün değiştirilmesi için BstZ17 I ve Mlu I seçilmiştir. Çift kesici de faydalı olabilir. Örneğin, çift kesici Ssp I ile benzersiz kesici BssH II, örtüşme uzatma PCR kullanılarak tüm E3 bölgesinin değiştirilmesi için seçilebilir.
  5. Ara plazmidin inşası için sanal diziyi bir şablon olarak kullanarak primerler tasarlayın (Şekil 3C).
    NOT: Her bir astarın uzunluğunu kısaltmak için dört astar tasarlanmıştır. Ad7HpaIF1 ve Ad7HpaIR1 primerleri ile amplifiye edilen PCR ürünü, Ad7HpaIF2 ve Ad7HpaIR2 primerleri ile nihai PCR fragmanını elde etmek için şablon olarak kullanılacaktır (Şekil 3C).

4. HEK293 hücrelerinde enfeksiyöz rekombinant adenovirüsün kurtarılması

NOT: Bu makalede oluşturulan üç adenovirüsün tümü aşağıdaki protokole göre kurtarılmıştır.

  1. Plazmidi doğrusallaştırmak için toplam 100 μL hacimde 37 ° C'de 5 saat boyunca 10 μG rekombinant adenoviral plazmiti 2 μL Pme I ile sindirin. Sindirilmiş DNA'nın 1 μL'sini %0.8'lik bir agaroz jeli üzerinde kontrol edin. Sindirim, adenoviral genomun ~ 34 kb fragmanını ve Kan-Ori'nin ~ 2.5 kb plazmit omurgasını vermelidir.
  2. Genomik DNA Temizleme ve Yoğunlaştırıcı kitini kullanarak kalan doğrusallaştırılmış adenoviral plazmiti saflaştırın.
  3. DMEM'de HEK293 hücreleri artı %10 FBS'de kültür. HEK293 hücrelerini (2 x 10,6 hücreli) transfeksiyondan 1 gün önce bir T-25 şişesine tohumlayın, böylece ertesi gün% 70 -% 80 birleşmeye ulaşırlar. Ticari olarak temin edilebilen transfeksiyon reaktiflerini kullanarak HEK293 hücrelerini transfekte etmek için 5 μg Pme I sindirilmiş adenoviral plazmit kullanın.
    NOT: Kopyalanan hücrelerin ortamı her 3 günde bir değiştirilmelidir.
  4. Hücreleri her gün kontrol edin, hücreleri toplayın ve kuyruklu yıldız odakları oluştuğunda 15 mL'lik bir polipropilen tüpte kültür ortamını toplayın (Şekil 2B, virüs replikasyonunu gösterir).
  5. Hücreleri üç donma-çözülme döngüsü ile parçalayın. Oda sıcaklığında 1200 x g'da 12 dakika santrifüjledikten sonra, süpernatantı toplayın ve sonraki virüs yayılımı için -80 °C'de saklayın.
    NOT: Rekombinant adenovirüs GFP veya diğer floresan proteinleri eksprese ettiğinde, floresan protein pozitif hücreler tarafından oluşturulan odaklar bir floresan mikroskobu altında sezgisel olarak gözlemlenebildiğinden, virüsün başarılı bir şekilde kurtarılıp kurtarılmadığını belirlemek daha kolaydır.

5. E3 ile silinmiş HAdV-7 genom plazmidinin yapımı

NOT: HAdV-7'nin genomu 35.239 bp uzunluğundadır ve E3 bölgesi, genomun 27.354 bp ile 31.057 bp'si arasında yer almaktadır. Bir ara plazmit oluşturmak için, enfeksiyöz klon plazmidi üzerinde iki kesme bölgesi olan bir endonükleaz veya plazmit üzerinde tek bir kesme bölgesi olan iki endonükleaz bulun. Hpa I, Sal I veya Avr II ve Mlu I mevcuttur. BstZ17 I (28,312 bp) ve Mlu I (30,757 bp) arasındaki dizi silinmeli ve CMV-GFP-PA kaseti veya CMV-mCherry-PA kaseti ile değiştirilmelidir.

  1. Hpa I ile 600 ng pKan-Ad7'yi sindirin. Jel elektroforezinden sonra bir DNA jeli geri kazanım kiti kullanarak büyük parça pKAd7-HpaI-FL (~ 30 kb) ve küçük parça pKAd7-HpaI-FS'yi (~ 7 kb) sırasıyla saflaştırın. pKAd7-HpaI-FL'yi -20 °C'de saklayın.
  2. Şablon olarak pShuttle-CMV kullanarak Ad7HpaIF1 ve Ad7HpaIR1 (Tablo S1) primerleri ile Kan ve Ori içeren fragmanı PCR ile çoğaltın. Kan-Ori2'yi Ad7HpaIF2 ve Ad7HpaIR2 primerleri ile amplifiye etmek için PCR reaksiyonunun ikinci turu için bir şablon olarak kullanılacak PCR ürününü (2541 bp) geri kazanın ve seyreltin.
    1. PCR ürününü (2584 bp) elektroforez ile %1'lik bir agaroz jel içinde çözündükten sonra saflaştırın. PCR reaksiyonunu şu şekilde ayarlayın: 30 saniye boyunca 98 ° C'de bir döngü, ardından 8 saniye boyunca 98 ° C'de 30 döngü denatüre etme, tavlama ve 72 ° C'de 2 dakika uzatma.
      NOT: Kan-Ori2'nin merkezi kısmı, Kan ve Ori içeren fragmandır, ardından küçük parça pKAd7-HpaI-FS'de (örneğin, Pme I) bulunmayan benzersiz bir kısıtlama endonükleazının dizileri ve büyük parça pKAd7-HpaI-FL ile örtüşen bölge; en dıştaki diziler, küçük parçalı pKAd7-HpaI-FS ile örtüşen bölgedir.
  3. PCR ürünü Kan-Ori2'yi ve adım 5.1'de geri kazanılan pKAd7-HpaI-FS'yi DNA Assembly Master Mix'e ekleyin. 50 °C'de 1 saat inkübe edin. 2.4- 2.6 adımlarını izleyin. Doğru plazmit pKan-Ad7HpaI (~10 kb) olarak adlandırılır.
  4. Ad7E3GFPF1 ve Ad7E3GFPR1 primerleri ile şablon olarak pShuttle-GFP23 kullanarak CMV promotörü, GFP CDS ve SV40 polyA sinyali (PA) içeren CMV-GFP-PA fragmanını (~ 1.7 kb) yükseltin (Tablo S1). Elektroforez ile %1650'lik bir agaroz jel içinde çözüldükten sonra PCR ürününü (1 bp) saflaştırın.
    NOT: BstZ17 I ve Mlu I sindirilmiş pKan-Ad7HpaI ile birleştirilebilen örtüşen bölgeler primerlere dahil edilmeli ve pKan-Ad7 plazmidinde bulunmayan benzersiz bir kısıtlama bölgesi (örneğin, Sbf I) daha fazla kısıtlama montajı için primerlere eklenmelidir.
  5. BstZ17 I ve Mlu I ile 300 ng pKan-Ad7HpaI'yi sindirin. Elektroforez ile% 1'lik bir agaroz jeli içinde çözüldükten sonra 7.3 kb'lik parçayı (E3 bölgelerinin çoğu silinir) saflaştırın. Kurtarılan 7.3 kb parçasını ve kurtarılan CMV-GFP-PA parçasını (~1.6 kb) DNA Assembly Master Mix'e ekleyin. 2.4-2.6 adımlarını izleyin. Doğru plazmid pKAd7-E3GFP (~9 kb) olarak adlandırılır.
    NOT: BstZ17 I ve Mlu I arasındaki tüm diziler E3 bölgesine aittir.
  6. 300 ng pKAd7-HE3GFP'yi Pme I ile sindirin. Jel elektroforezinden sonra bir DNA jeli geri kazanım kiti kullanarak büyük parçayı (~ 6.4 kb) saflaştırın. Saflaştırılmış parçayı ve adım 5.1'de geri kazanılan pKAd7-HpaI-FL'yi DNA Assembly Master Mix'e ekleyin. 50 °C'de 1 saat inkübe edin. 2.4- 2.6 adımlarını izleyin. Doğru plazmit pKAd7-E3GFP olarak adlandırılır.
  7. HEK293 hücrelerini, bölüm 3'te açıklandığı gibi Pme I-doğrusallaştırılmış pKAd7-E3GFP ile transfekte edin. Kurtarılan adenovirüse Ad7-E3GFP adı verilir.
  8. Ad7E3CHEF1 ve Ad7E3CHER1 primerleri ile şablon olarak pKFAV4-CX19A kullanarak CMV promotörü, mCherry CDS ve SV40 polyA sinyali içeren CMV-mCherry-PA fragmanını (~1.6 kb) yükseltin. PCR ürününü, elektroforez ile %1'lik bir agaroz jel içinde çözüldükten sonra saflaştırın.
  9. 600 ng pKAd7-E3GFP'yi Sbf I ile sindirin ve ~ 35 kb'lik parçayı saflaştırın. 35 kb'lık parçayı ve kurtarılan CMV-mCherry-PA parçasını DNA Assembly Master Mix'e ekleyin. 50 °C'de 1 saat inkübe edin. 2.4-2.6 adımlarını izleyin. Doğru plazmit pKAd7-E3CHE olarak adlandırılır.
  10. HEK293 hücrelerini Pme I-doğrusallaştırılmış pKAd7-E3CHE ile bölüm 3'te açıklandığı gibi transfekte edin. Kurtarılan adenovirüse Ad7-E3CHE adı verildi.

6. HEK293 hücrelerinde rekombinant adenovirüsün amplifikasyonu ve saflaştırılması

  1. Sekiz adet 150 mm çapında TC ile muamele edilmiş kültür kabında büyütülen HEK293 hücrelerinin %80-90 birleşik tek tabakasını adenovirüs ile aşılayın. Hafif çalkalama altında 37 ° C'de 2 saat inkübe edin. Süpernatanı% 2 FBS içeren 25 mL DMEM ile değiştirin.
  2. Hücreleri 37 ° C'de 2-3 gün inkübe edin.
    1. Bir CPE hücrelerin çoğunu etkilediğinde, 150 mm çapındaki sekiz tabağın süpernatantının çoğunu atın. Enfekte olmuş hücreleri, ~ 6.0 mL nihai elüsyon hacmine sahip hücre kaldırıcılar kullanarak 15 mL polipropilen tüplere hasat edin.
    2. Virüsü serbest bırakmak için hücreleri üç donma-çözülme döngüsü ile bozun. Lizatı, oda sıcaklığında 1200 x g'da 12 dakika santrifüjleme ile temizleyin. Virüs içeren süpernatanı toplayın.
  3. Süpernatanıma MgCl2( 0.1 mM) ve benzonaz nükleaz (50 U / mL) ekleyin. 37 °C'de 40 dakika boyunca hafifçe vorteksleyin. Süpernatana NaCl (600 mM) ekleyin ve 37 ° C'de 40 dakika daha hafifçe girdaplayın. Oda sıcaklığında 1200 x g'da 12 dakika santrifüjleyin. Saflaştırma için virüs içeren süpernatanı toplayın.
  4. 10 mM Tris-HCl ile 1.35 g / mL, 1.30 g / mL ve 1.25 g / mL farklı konsantrasyonlarda sezyum klorür (CsCl) hazırlayın.
    1. Bir pipet kullanarak 5.1 mL'lik bir Ultra-Clear tüpün dibine 0.8 mL 1.35 g / mL CsCl çözeltisi ekleyin ve ardından sırayla 0.8 mL 1.30 g / mL CsCl çözeltisi ve 0.8 mL 1.25 g / mL CsCl çözeltisi ekleyin.
    2. Son olarak, 1.25 g / mL CsCl çözeltisinin üstüne adım 6.3'te toplanan süpernatantın ~ 2.5 mL'sini dikkatlice kaplayın ve tüpü 10 mM Tris-HCl kullanarak üstten 2-3 mm'ye kadar doldurun.
  5. 200.000 x g ve 8 °C'de 2 saat boyunca, sağlam viral partikülleri kusurlu viral partiküllerden ayırmak için yavaş hızlanma ve yavaşlama ile sallanan kovalı bir rotorda santrifüjleyin.
    NOT: Santrifüjlemeden sonra, CsCl çözeltisinde birkaç beyaz bant açıkça görülebilir.
  6. Pipeti kullanarak boş parçacıkların bantlarını ve hücre kalıntısı tabakasını dikkatlice çıkarın ve 2 mL'lik bir şırınga kullanarak olgun virüs içeren en düşük bandı toplayın.
  7. Toplanan virüs süspansiyonunu 20 K MWCO diyaliz kasetine aktarın ve 4 ° C'de gece boyunca 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2 ve% 2 gliserol (pH 8.0) içeren diyaliz tamponunda diyalize edin.
    1. Ertesi gün 10 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, 1 mM MgCl2 ve% 5 gliserol (pH 8.0) içeren diyaliz tamponunu değiştirin ve 5 saat 4 ° C'de diyalize girin.
    2. Diyalize edilmiş virüs parçacıklarını 2 mL'lik bir şırınga kullanarak toplayın. İstenilen küçük hacimlerde (20-200 μL) birden fazla alikot hazırlayın ve saflaştırılmış virüsü -80 ° C'de saklayın.
      NOT: Saflaştırılmış virüsün partikül titresi, genomik DNA içeriğinin ölçülmesiyle belirlenebilir ve sınırlayıcı seyreltme testi ile GFP pozitif hücrelerin sayılmasıyla HEK293 hücreleri üzerinde enfektivite titresi belirlenebilir.

7. Restriksiyon enzim sindirimi ile rekombinant adenovirüs genomunun tanımlanması

  1. Bir T-25 şişesinde büyütülen HEK293 hücrelerinin %80-90 birleşik tek tabakasını rekombinant adenovirüs ile enfekte edin. 37 °C'de 2 saat inkübe edin. Kültür ortamını% 2 FBS içeren taze DMEM ile değiştirin.
  2. Kültür süpernatantını çıkarın ve CPE 2-3 gün içinde meydana geldiğinde adım 1.3'te açıklanan modifiye Hirt yöntemi ile viral genomik DNA'yı ekstrakte edin.
  3. Rekombinant adenovirüsün genomik DNA'sını belirtilen enzimlerle sindirin ve agaroz jel elektroforezi üzerinde analiz edin. Rekombinant adenoviral plazmit bir kontrol görevi gördü.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

HAdV-7'nin enfeksiyöz bir klonunun inşası için strateji Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilmiştir. İki enfeksiyöz klon plazmidi rastgele seçildi ve sırasıyla BstZ17 I, BamH I ve EcoR V ile tanımlandı. Sonuçlar, fragmanların beklenen boyutla tutarlı olduğunu gösterdi (Şekil 2A), bu da plazmitlerin doğru şekilde oluşturulduğunu gösteriyor. Pme I-doğrusallaştırılmış plazmitin...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Farklı adenovirüslerin çeşitli doku tropizmleri vardır ve farklı adenovirüslere karşı önceden var olan konak bağışıklığının prevalansı insanlarda yoğun bir şekilde dalgalanabilir24, bu da gen terapisi veya aşı geliştirme için yeni adenoviral vektörlerin oluşturulmasına olan ilgiyi çeker. Bununla birlikte, yeni bir adenoviral vektör sisteminin kurulması, genel moleküler biyoloji laboratuvarları için hantal olmaya devam etmektedir.<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu araştırma, Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (7204258), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82161138001, 82072266), CAMS Tıp Bilimleri İnovasyon Fonu (2019-I2M-5-026) ve Pekin'deki temel solunum yolu patojenlerinin moleküler izlenmesi üzerine araştırma ve uygulama tarafından finanse edilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL polypropylene microcentrifuge TubeAxygenMCT-150-CStorage of virus
15 mL polypropylene centrifuge tubesCorning430790Storage of virus
150 mm TC-treated culture dishesCorning430599Growth of HEK29E cells
20 K MWCO dialysis cassetteThermoFisher Scientific66005Dialysis of virus
Acetic acidAmresco714Extraction of DNA
Afl IINEBR0520Digestion
AgaroseTakara5260Electrophoresis
Age INEBR0552Digestion
Asc INEBR0558Digestion
BamH INEBR0136Digestion
Benzonase NucleaseSigmaE8263-25KUPurification of virus
BsrG INEBR0575Digestion
Cell lifterCorning3008Scrape off the cells 
CsClSigmaC3032Purification of virus
DNA gel recovery kitZymoD4045Recovery of DNA
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)CytivaSH30022.01HEK293 cells medium
E.coli TOP10 competent cellsTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.CB-104Transformation of assembly product
EcoR VNEBR3195Digestion
EDTAThermo Fisher ScientificR3104Extraction of DNA
Fetal bovine serum (FBS)CytivaSV30208.02HEK293 cells culture
Genomic DNA Clean and concentrator kitZymoD4065Purification of DNA
GlycerolShanghai Macklin Biochemical Co., LtdG810575Dialysis of virus
HEK293 cellsATCCCRL-1573Amplification of virus
High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0491PCR
Hind IIINEBR3104Digestion
Kanamycin sulfateAmresco408Selection of plasmid
Kpn INEBR3142Digestion
Lambda/HindIII DNA markerTakara3403Electrophoresis
LB brothBD240230LB plate for bacteria
LB mediumSolarbio Life ScienceL1010Medium for bacteria
MgCl2Sigma63068Dialysis of virus
MicrocentrifugeThermo Fisher ScientificSorvall Legend Micro 21RExtraction of DNA
NaClSigmaS5886Dialysis of virus
Nde INEBR0111Digestion
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621DNA assembly
Nhe INEBR0131Digestion
Phosphate Buffered SalineCytivaSH30256.01Washing of cells
PipetteThermo Fisher ScientificMatrixAspirate the medium
Plasmid Maxprep KitVigorous Biotechnology Beijing Co., Ltd.N001Extraction of DNA
Plasmid Miniprep KitTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.DP103Extraction of DNA
Pme INEBR0560Digestion
Potassium acetateAmresco698Extraction of DNA
Protease KThermo Fisher ScientificAM2542Extraction of DNA
pShuttle-CMVStratagene240007PCR template
RNaseBeyotimeD7089Extraction of DNA
Sal INEBR0138Digestion
Sbf INEBR3642Digestion
SDSAmresco227Extraction of DNA
Swinging-bucket rotorHITACHIS52STPurification of virus
T-25 cell flaskCorning430639Growth of HEK29E cells
T-75 cell flaskCorning430641Growth of HEK29E cells
Transfection reagentPolyplus-transfection114-15Transfection
Transmission electron microscopeFEITECNAI 12Obsevation of virus
Tris-HClAmresco234Dialysis of virus
UltracentrifugeHITACHIHimac CS120GXIIPurification of virus

Referanslar

  1. Lasaro, M. O., Ertl, H. C. New insights on adenovirus as vaccine vectors. Molecular Therapy. 17 (8), 1333-1339 (2009).
  2. Fuchs, J. D., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant adenovirus serotype 35-Vectored HIV-1 vaccine in adenovirus serotype 5 seronegative and seropositive individuals. Journal of AIDS & Clinical Research. 6 (5), (2015).
  3. Milligan, I. D., et al. Safety and immunogenicity of novel adenovirus type 26- and modified vaccinia ankara-vectored ebola vaccines: a randomized clinical trial. JAMA. 315 (15), 1610-1623 (2016).
  4. Zhu, F. C., et al. Safety, tolerability, and immunogenicity of a recombinant adenovirus type-5 vectored COVID-19 vaccine: a dose-escalation, open-label, non-randomised, first-in-human trial. Lancet. 395 (10240), 1845-1854 (2020).
  5. He, T. C., et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2509-2514 (1998).
  6. Danthinne, X., Imperiale, M. J. Production of first generation adenovirus vectors: a review. Gene Therapy. 7 (20), 1707-1714 (2000).
  7. Guo, X., et al. Systemic and mucosal immunity in mice elicited by a single immunization with human adenovirus type 5 or 41 vector-based vaccines carrying the spike protein of Middle East respiratory syndrome coronavirus. Immunology. 145 (4), 476-484 (2015).
  8. Folegatti, P. M., et al. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).
  9. Jang, Y., Bunz, F. AdenoBuilder: A platform for the modular assembly of recombinant adenoviruses. STAR Protocols. 3 (1), 101123(2022).
  10. Zhou, X., Sena-Esteves, M., Gao, G. Construction of recombinant adenovirus genomes by direct cloning. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (5), (2019).
  11. Ruzsics, Z., Lemnitzer, F., Thirion, C. Engineering adenovirus genome by bacterial artificial chromosome (BAC) technology. Methods in Molecular Biology. 1089, 143-158 (2014).
  12. Zhou, D., et al. An efficient method of directly cloning chimpanzee adenovirus as a vaccine vector. Nature Protocols. 5 (11), 1775-1785 (2010).
  13. Zou, X. H., et al. DNA assembly technique simplifies the construction of infectious clone of fowl adenovirus. Journal of Virological Methods. 257, 85-92 (2018).
  14. Guo, X., et al. Site-directed modification of adenoviral vector with combined DNA assembly and restriction-ligation cloning. Journal of Biotechnology. 307, 193-201 (2020).
  15. Liu, H., et al. Single plasmid-based, upgradable, and backward-compatible adenoviral vector systems. Human Gene Therapy. 30 (6), 777-791 (2019).
  16. Yan, B., et al. User-friendly reverse genetics system for modification of the right end of fowl adenovirus 4 genome. Viruses. 12 (3), 301(2020).
  17. Zhang, W., et al. Fiber modifications enable fowl adenovirus 4 vectors to transduce human cells. Journal of Gene Medicine. 23 (10), 3368(2021).
  18. Zou, X., et al. Fiber1, but not fiber2, is the essential fiber gene for fowl adenovirus 4 (FAdV-4). Journal of General Virology. 102 (3), 001559(2021).
  19. Guo, X., et al. Restriction-assembly: a solution to construct novel adenovirus vector. Viruses. 14 (3), 546(2022).
  20. Duan, Y., et al. Genetic analysis of human adenovirus type 7 strains circulating in different parts of China. Virologica Sinica. 36 (3), 382-392 (2021).
  21. Arad, U. Modified Hirt procedure for rapid purification of extrachromosomal DNA from mammalian cells. Biotechniques. 24 (5), 760-762 (1998).
  22. Knipe, D. M. H. P. M. Fields' Virology. 2, 1733(2013).
  23. Liu, H. Y., Han, B. J., Zhong, Y. X., Lu, Z. Z. A three-plasmid system for construction of armed oncolytic adenovirus. Journal of Virological Methods. 162 (1-2), 8-13 (2009).
  24. Mennechet, F. J. D., et al. A review of 65 years of human adenovirus seroprevalence. Expert Review of Vaccines. 18 (6), 597-613 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Adenoviral Vekt rlerGen TedavisiDNA Montaj TeknolojisiHAdV 7Enfeksiy z KlonPCR PrimerleriKanamisine Diren li GenE3 B lgesiTransgen Eksprese Eden ElementlerGibson D zene iRestriksiyon D zenekYe il Floresan ProteinHEK293 H creleriRekombinant Vir sMolek ler Biyoloji

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır