JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

במחקר זה נבנה שיבוט זיהומי של אדנו-וירוס אנושי מסוג 7 (HAdV-7), והוקמה מערכת וקטור HAdV-7 שנמחקה על ידי E3 על ידי שינוי השיבוט הזיהומי. ניתן להכליל את האסטרטגיה הזו המשמשת כאן כדי ליצור וקטורים להעברת גנים מאדנווירוסים אחרים מסוג בר.

Abstract

וקטורים אדנו-ויראליים שימשו ככלי להעברת גנים בריפוי גנטי במשך יותר משלושה עשורים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבניית וקטור אדנו-ויראלי על ידי מניפולציה של ה-DNA הגנומי של HAdV-7 מסוג בר באמצעות שיטת הרכבת DNA. ראשית, שיבוט זיהומי של HAdV-7, pKan-Ad7, נוצר על ידי מיזוג ה-DNA הגנומי הנגיפי עם תוצר PCR מעמוד השדרה של הפלסמיד, המורכב מהגן העמיד לקנמיצין ומקור השכפול (Kan-Ori), באמצעות הרכבת DNA. זה נעשה על ידי תכנון זוג פריימרים של PCR, שהכילו ~25 נוקלאוטידים של הרצף הסופי של HAdV-7 חוזר טרמינל הפוך (ITR) בקצה 5', אתר אנזים הגבלה שאינו חותך לגנום HAdV-7 באמצע, ורצף ספציפי לתבנית עבור תחול PCR בקצה 3'. שנית, נעשה שימוש באסטרטגיה מבוססת פלסמיד ביניים כדי להחליף את אזור E3 באלמנטים המבטאים טרנסגנים בשיבוט הזיהומי כדי ליצור וקטור אדנו-ויראלי. בקצרה, pKan-Ad7 עוכל עם אנזים הגבלת חותך כפול Hpa I, והמקטע המכיל את אזור E3 נקשר לתוצר PCR אחר של עמוד שדרה פלסמיד על ידי הרכבת גיבסון לבניית פלסמיד ביניים pKan-Ad7HpaI. מטעמי נוחות, נעשה שימוש בהרכבת הגבלה כדי לייעד את שיטת שיבוט הפלסמיד של עיכול והרכבה משולבים של הגבלה. באמצעות הרכבה הגבלה, הגנים E3 ב-pKan-Ad7HpaI הוחלפו בקלטת ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), ואזור ה-E3 השונה שוחרר מפלסמיד הביניים והוחזר לשיבוט הזיהומי כדי ליצור פלסמיד אדנו-ויראלי pKAd7-E3GFP. לבסוף, pKAd7-E3GFP עבר ליניאריזציה על ידי עיכול Pme I ושימש להעברת תאי אריזה של HEK293 להצלת נגיף HAdV-7 רקומביננטי. לסיכום, הוצגה כאן אסטרטגיה מבוססת הרכבת DNA לבניית וקטורים אדנו-ויראלים במעבדות כלליות של ביולוגיה מולקולרית ללא צורך בחומרים ומכשירים מיוחדים.

Introduction

במהלך שלושת העשורים האחרונים, וקטורים אדנו-ויראליים רקומביננטיים היו בשימוש נרחב בפיתוח חיסונים וטיפול גנטי 1,2,3,4 כמו גם במחקר בסיסי בשל תכונותיהם הביולוגיות יוצאות הדופן, כגון יעילות גבוהה של העברת גנים, אי אינטגרציה לגנום המארח, הגנום הנגיפי המניפולטיבי וקלות הייצור בקנה מידה גדול.

נכון לעכשיו, הווקטורים הנפוצים ביותר של אדנו-וירוס בנויים על בסיס אדנו-וירוס אנושי 5 (HAdV-5)5,6. למרות שהתמרה בתיווך וקטור HAdV-5 מספקת תוצאות מעודדות, יישומים פרה-קליניים וקליניים חשפו מספר חסרונות, (למשל, חסינות אנטי-וקטורית גבוהה קיימת באוכלוסייה האנושית ויעילות התמרה נמוכה בתאים חסרי הקוקסאקי וקולטן אדנו-וירוס (CAR)). כדי לעקוף את הבעיות הללו, היה עניין רב בבניית וקטורים המבוססים על סוגים אחרים של אדנו-וירוס אנושי או יונקים 3,7,8.

עד כה, השיטה הפופולרית ביותר לבניית וקטור אדנו-ויראלי היא רקומבינציה הומולוגית בחיידקים5. זני חיידקים כאלה חייבים לבטא רקומבינאזות, מה שעלול להשפיע על היציבות או ההגברה של הפלסמידים שהם נושאים. חלק מהזנים אפילו אינם זמינים מסחרית. לאחרונה, נעשה שימוש בשיטות המבוססות על עקרונות אחרים, כולל כרומוזומים מלאכותיים חיידקיים, שיבוט ישיר או הרכבת DNA ישירה, ליצירת שיבוטים זיהומיים של אדנו-וירוס או וקטורים אדנו-ויראלים רקומביננטיים 9,10,11,12. עם זאת, שיטות אלה אינן ידידותיות במידה מסוימת לחוקרים בעלי ניסיון מועט בתחום זה.

בשנת 2018, תהליך בניית שיבוט זיהומי של אדנו-וירוס מפושט במעבדה על ידי קשירה ישירה של גנום הנגיף עם מוצר PCR הנושא עמוד שדרה של פלסמיד דרך הרכבה של גיבסון13. לאחר מכן, שיטות עיכול ההגבלה והרכבת גיבסון משולבות יחד כדי להעמיס טרנסגנים לפלסמידים אדנו-ויראליים קיימים 14,15,16,17,18. מטעמי נוחות, נעשה שימוש בהרכבת הגבלה להלן כדי להתייחס לשיטה של עיכול אנזימי הגבלה משולב והרכבת גיבסון. אסטרטגיות נוספות פותחו לבניית וקטורים אדנו-ויראלים משיבוטים זיהומיים באמצעות הרכבה הגבלה19. המהות של הרכבת הגבלה היא לכלול שברים שנכרתו מפלסמידים ככל האפשר בתגובת הרכבת DNA, בעוד שמוצרי PCR קצרים משמשים כמקשרים או טלאים לשינוי פלסמיד. יחד עם זאת, מספר השברים הכלולים נשמר נמוך ככל האפשר. מאמצים כאלה משקפים את התמורה; ניתן למזער את האפשרות של מוטציות לא רצויות הנגרמות על ידי PCR או הרכבת DNA, ולשפר את שיעור ההצלחה. לסיכום, צינור מאדנו-וירוס מסוג פרא לווקטור אדנו-ויראלי הוקם במעבדה 13,14,15,16,17,18,19.

כאן, אנו מנסים להציג שיטות אלה על ידי מתן דוגמאות לבניית שיבוט זיהומי HAdV-7 וקטור HAdV-7 בעל יכולת שכפול שנמחק E3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: אדנו-וירוסים מסווגים כרמת בטיחות ביולוגית 2 (BSL-2); כל השלבים לשימוש בנגיפים בוצעו במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 2. ה-HAdV-7 מסוג הבר בודד ב-2017 מדגימת האף של תינוק בן 10 חודשים שאושפז עם זיהום חריף בדרכי הנשימה בבית החולים לילדים בבייג'ינג20. מלאי הנגיף אוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

1. מיצוי DNA גנומי HAdV-7

  1. זרעים 2.0 x 106 מתאי HEK293 בבקבוק T-25 אחד המכיל 5 מ"ל של מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ותרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה בתוספת 5%CO2. התאים צריכים להיות 80%-90% מתכנסים ומוכנים לזיהום תוך 18-24 שעות.
  2. חסנו את התאים ב-HAdV-7 מסוג פרא למשך שעתיים. הסר את המדיום המכיל את הנגיף על ידי שאיפה והוסף לתאים 5 מ"ל של DMEM טרי המכיל 2% FBS.
  3. חלץ את ה-DNA הגנומי הנגיפי בשיטת Hirt ששונתה21
    1. יומיים או שלושה לאחר ההדבקה, כאשר נצפית השפעה ציטופתית (CPE) על 50%-90% מהתאים, יש להשליך את התרבית ולשטוף את התאים פעם אחת עם מי מלח חוצצים פוספט (PBS).
      הערה: אפקט ציטופתי (CPE) מוגדר כתופעה שבה התאים הנגועים בנגיף מתעגלים, מתנפחים ומתחברים או מתנתקים באופן רופף מבקבוק התרבית לאשכולות דמויי ענבים22.
    2. תאי ליז בבקבוק ב-1.0 מ"ל של מאגר ליזה המכיל 25 מ"מ Tris-HCl, 0.5 מ"מ EDTA, 50 מיקרוגרם/מ"ל פרוטאז K ו-0.8% SDS (pH7.6) למשך 5 דקות על קרח. העבירו את הליזאט לצינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ודגרו את הצינור באמבט מים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    3. הוסף 120 מיקרוליטר של מאגר משקעים לצינור. הניחו את השפופרת על הקרח למשך 30 דקות נוספות לאחר ערבוב עדין.
      הערה: מאגר המשקעים מורכב מ-3 M CsCl, 1 M אשלגן אצטט וחומצה אצטית 0.67 M. זה יעזור לזרז את הפסולת התאית ואת ה-DNA של הכרומוזום התאי לאחר צנטריפוגה תוך שמירה על גנום הנגיף בסופרנטנט.
    4. צנטריפוגה של הצינור למשך 25 דקות ב-15,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן העבירו את הסופרנטנט (כ-1.1 מ"ל) לצינור פוליפרופילן של 15 מ"ל.
    5. הוסף 2.2 מ"ל אתנול מוחלט קר כקרח לשפופרת. מערבבים בעדינות ונותנים לצינור לעמוד על קרח למשך 15 דקות. צנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 2000 x גרם בטמפרטורת החדר.
    6. שאפו את הסופרנטנט בזהירות ושטפו את המשקעים (DNA גנומי של הנגיף) פעם אחת עם 800 מיקרוליטר של 70% אתנול. צנטריפוגה את הצינור למשך 6 דקות בטמפרטורה של 15,000 x גרם בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט וייבשו באוויר את כדור הדנ"א בתחתית. אין לייבש יתר על המידה את כדור ה-DNA מכיוון שהוא עלול לגרום לקושי בהמסה מחדש.
    7. ממיסים את הגלולה ב-200 מיקרוליטר של מאגר TE (10 מ"מ Tris-HCl, pH 8.0, 0.1 מ"מ EDTA), מוסיפים 1 מיקרוליטר של RNase A (10 מ"ג/מ"ל), ומדגרים את הצינור ב-37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. טהר את ה-DNA המומס באמצעות ערכת ניקוי וריכוז DNA גנומי מסחרי (ראה טבלת חומרים).
      הערה: כמת את ה-DNA הגנומי הנגיפי בשיטה הנפוצה במעבדה. בדרך כלל, ניתן להשיג 1-5 מיקרוגרם של DNA גנומי בבקבוק T-25 של תאי HEK293 הנגועים באדנו-וירוס.

2. בניית שיבוט זיהומי של HAdV-7 על ידי הרכבת DNA

  1. תכנן פריימרים PCR כדי להגביר את עמוד השדרה של הפלסמיד (איור 1). הוסף את רצפי החפיפה הדרושים להרכבת DNA לקצוות 5' של פריימרים PCR. בנוסף, כלול אתרי הגבלה שאינם חותכים (למשל, אתר Pme I) בשני קצוות הגנום של HAdV-7 כדי לסייע בשחרור הגנום הנגיפי מהשיבוט הזיהומי.
    הערה: עמוד השדרה של הפלסמיד המכיל גן עמיד לאנטיביוטיקה ומקור שכפול מוגבר על ידי PCR ומתמזג לגנום HAdV-7. ניתן להציל אדנו-וירוסים מתאי אריזה ביעילות גבוהה יותר כאשר משתמשים בגנום וירוס ליניארי במקום פלסמיד אדנו-ויראלי מעגלי. לאחר התחשבות בגורמים שהוזכרו לעיל, פריימרים מתוכננים כפי שמוצג באיור 1.
  2. בצע PCR כדי להגביר שבר (Kan-Ori) המכיל גן עמידות לקנאמיצין (Kan) ומקור pBR322 (Ori) באמצעות pShuttle-CMV כתבנית עם פריימרים של Ad7KanF1 ו-Ad7KanR1 (טבלה S1). הגדר את תגובת ה-PCR באופן הבא: מחזור אחד ב-98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, לאחר מכן חמישה מחזורי דנטורציה ב-98 מעלות צלזיוס למשך 8 שניות, חישול ב-68 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, הארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 90 שניות, ולבסוף 25 מחזורי דנטורציה ב-98 מעלות צלזיוס למשך 8 שניות, חישול והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
  3. הפעל את מוצר ה-PCR בג'ל אגרוז 1% על ידי אלקטרופורזה, וטהר את השבר באמצעות ערכת שחזור ג'ל DNA מסחרית.
  4. הוסף את ה-Kan-Ori המשוחזר ואת ה-DNA הגנומי הנגיפי של HAdV-7 לתערובת המאסטר המסחרית של הרכבת ה-DNA. הגדר את תגובת ההרכבה בנפח כולל של 20 מיקרוליטר ויחס מולארי של וקטור ל-DNA גנומי ויראלי של 1:2. דגירה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך שעה.
    הערה: הגדר את התגובה בנפח כולל של 20 מיקרוליטר עם 1-3 מיקרוליטר של וקטור, 7-9 מיקרוליטר של DNA גנומי נגיפי ו-10 מיקרוליטר של תערובת מאסטר של הרכבת DNA.
  5. הפוך את תאי ה-TOP10 של זן E. coli המוכשרים כימית עם 10 מיקרוליטר של תוצר ההרכבה באמצעות הלם חום. מורחים את תערובת הטרנספורמציה על לוחות לוריא-ברטאני (LB-Kan) המכילים קנמיצין (50 מיקרוגרם/מ"ל). דגרו צלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות לפחות.
  6. חסנו לפחות שלושה שיבוטים כל אחד ב-5 מ"ל של מדיום LB-Kan ב-37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות עם ניעור עדין (200-250 סל"ד). חלץ DNA פלסמיד באמצעות ערכת Plasmid Miniprep מסחרית.
  7. עכל את הפלסמיד באמצעות אנדונוקלאז הגבלה, ולאחר מכן בדוק את גודל שברי ה-DNA עם אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז (איור 2A). יתר על כן, אשר את אתרי ההיתוך על ידי ריצוף. פלסמיד ההרכבה הנכון נקרא pKan-Ad7.
  8. גדל תרבית של 100 מ"ל של חיידקים מהשיבוט הנכון. חלץ תכשיר מקסי-פלסמיד באמצעות ערכת Plasmid Maxprep מסחרית.

3. בסיליקו בנייה ושינוי של פלסמיד ביניים

הערה: בדרך כלל, יש לבנות פלסמיד ביניים, וכיצד לבנות פלסמיד ביניים אידיאלי הוא שלב המפתח. תוכנת ניתוח DNA עם מודול אנזים הגבלה, כגון pDRAW32 (תוכנה חופשית, זמינה ב-www.acaclone.com), נחוצה לתכנון פלסמיד ביניים.

  1. ייבא את רצף ה-DNA של pKan-Ad7 ל-pDRAW32 כדי לצייר מפת פלסמיד. הוסף ביאורים לאזורי העניין במפה. עבור אזורי pKan-Ad7, E1, E3 ועמוד השדרה של הפלסמיד (Kan-Ori) הוערו.
  2. הפעל את תוכנית pDRAW32. לחץ תחילה על הגדרות > בחירת אנזים ולאחר מכן לחץ על חיתוכים מינימליים/מקסימליים. הזן 1 בתיבה מינימום והזן 2 בתיבה מקסימום, וסמן את התיבה לפני בכל הרצף. לבסוף, לחץ על אישור כדי להציג את אתרי אנזימי הגבלת החותך הייחודיים והכפולים על המפה.
    הערה: בדרך כלל, נבחרים רק אנזימי ההגבלה המזהים רצף של 6 bp ומעלה. כפי שמוצג באיור 3A, 17 אנזימים תואמים את קריטריוני בחירת האנזים.
  3. קחו למשל את אתר ההגבלה הראשון שמאגף את אזור E3 מכיוון ש-E3 מתוכנן להשתנות. Hpa I, Sal I, Avr II-Mlu I ו-Spe I עמדו בדרישה.
    הערה: לניסוי זה, Hpa I נבחר מכיוון שעיכול של pKan-Ad7 איתו ייצור את השבר הקצר ביותר הנושא את אזור E3, ופלסמיד ביניים קטן יותר יקל על השינוי העתידי. לבחירת אתרי Sal I יש גם יתרונות - פלסמיד ביניים כזה מתאים לשינוי של אזורי E1 ו-E3 כאחד (איור S1).
  4. צור קובץ רצף סופי המציג את שני גדילי ה-DNA של הפלסמיד הבינוני pKan-Ad7HpaI. רצף וירטואלי זה יכול לשמש כתבנית לעיצוב פריימרים חופפים.
    1. העתק את הרצף בין שני אתרי ההגבלה של Hpa I כולל אזור E3. להרכבה הבאה, יש צורך להעתיק כל רצף של ~20 bp (Tm שווה או גדול מ-48°C) מחוץ לאתר ההגבלה של Hpa I (איור 3C, חפיפה - סופי 1 וחפיפה - סופי 2).
    2. הוסף את רצף הזיהוי של Pme I (איור 3C, gtttaaac) בשני הקצוות של הרצף לעיל.
    3. הוסף את רצף הפלסמיד של עמוד השדרה המכיל גן עמיד לאנטיביוטיקה ומקור שכפול (איור 3C, Kan-Ori) מחוץ לאתר ההגבלה של Pme I.
    4. ייבא את הרצף הסופי ל-pDRAW32 כדי לצייר מפת פלסמיד. הוסף ביאורים לאזור E3 במפה.
    5. הפעל את תוכנית pDRAW32. לחץ תחילה על הגדרות > בחירת אנזים ולאחר מכן לחץ על חיתוכים מינימליים/מקסימליים. הזן 1 גם בתיבה Min וגם ב-Max, וסמן את התיבה לפני ברצף שלם. לחץ על אישור לבסוף כדי להציג את אתרי אנזימי ההגבלה הייחודיים על המפה. ניתן לראות כי הרבה חותכים ייחודיים זמינים לשינוי E3.
      הערה: עבור ניסוי זה, BstZ17 I ו-Mlu I נבחרים להחלפת E3 חלקי. חותך כפול יכול להיות שימושי גם כן. לדוגמה, ניתן לבחור חותך כפול Ssp I יחד עם חותך ייחודי BssH II להחלפת כל אזור E3 באמצעות PCR מאריך חפיפה.
  5. תכנן פריימרים תוך שימוש ברצף הווירטואלי כתבנית לבניית פלסמיד ביניים (איור 3C).
    הערה: כדי לקצר את אורכו של כל פריימר, תוכננו ארבעה פריימרים. תוצר ה-PCR, המוגבר עם פריימרים של Ad7HpaIF1 ו-Ad7HpaIR1, ישמש כתבנית להשגת מקטע ה-PCR הסופי עם פריימרים של Ad7HpaIF2 ו-Ad7HpaIR2 (איור 3C).

4. הצלה של אדנו-וירוס רקומביננטי זיהומי בתאי HEK293

הערה: שלושת האדנו-וירוסים שנוצרו במאמר זה ניצלים כולם על פי הפרוטוקול הבא.

  1. עכל 10 מיקרוגרם של פלסמיד אדנו-ויראלי רקומביננטי עם 2 מיקרוליטר של Pme I למשך 5 שעות ב-37 מעלות צלזיוס בנפח כולל של 100 מיקרוליטר כדי ליניאריזציה של פלסמיד. בדוק 1 מיקרוליטר של ה- DNA המעוכל על ג'ל אגרוז 0.8%. העיכול אמור להניב מקטע של ~34 קילו-בייט של הגנום האדנוויראלי ועמוד שדרה פלסמיד של ~2.5 קילו-בייט של קאן-אורי.
  2. טהר את שאריות הפלסמיד האדנוויראלי הליניארי באמצעות ערכת ה-DNA Clean וה-Concentrator הגנומית.
  3. תרבית תאי HEK293 ב-DMEM בתוספת 10% FBS. זרע תאי HEK293 (2 x 106 תאים) בבקבוק T-25 יום אחד לפני הטרנספקציה כך שהם מגיעים למפגש של 70%-80% למחרת. השתמש ב-5 מיקרוגרם של פלסמיד אדנו-ויראלי בעיכוב Pme I כדי להעביר תאי HEK293 על ידי שימוש בריאגנטים טרנספקטיביים זמינים מסחרית.
    הערה: יש להחליף את המדיום של התאים המועברים כל 3 ימים.
  4. בדקו את התאים כל יום, אספו את התאים ותרבו את המדיום בצינור פוליפרופילן של 15 מ"ל כאשר מוקדי השביט נוצרים (איור 2B, המציין שכפול וירוס).
  5. ליזה את התאים באמצעות שלושה מחזורי הקפאה-הפשרה. לאחר צנטריפוגה למשך 12 דקות בטמפרטורה של 1200 x גרם בטמפרטורת החדר, אספו את הסופרנטנט ואחסנו אותו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס להתפשטות הנגיף לאחר מכן.
    הערה: כאשר האדנווירוס הרקומביננטי מבטא GFP או חלבונים פלואורסצנטיים אחרים, קל יותר לזהות אם הנגיף ניצל בהצלחה, שכן ניתן לצפות במוקדים שנוצרו על ידי תאים חיוביים לחלבון פלואורסצנטי תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי באופן אינטואיטיבי.

5. בניית פלסמיד גנום HAdV-7 שנמחק E3

הערה: הגנום של HAdV-7 הוא באורך של 35,239 bp, ואזור E3 ממוקם בין 27,354 bp ל-31,057 bp של הגנום. כדי לבנות פלסמיד ביניים, מצא אנדונוקלאז עם שני אתרי חיתוך בפלסמיד השיבוט הזיהומי, או שני אנדונוקלאזות עם אתר חיתוך יחיד על הפלסמיד. יש Hpa I, Sal I, או Avr II ו-Mlu I זמינים. יש למחוק את הרצף בין BstZ17 I (28,312 bp) ל-Mlu I (30,757 bp) ולהחליפו בקלטת CMV-GFP-PA או בקלטת CMV-mCherry-PA.

  1. עכל 600 ננוגרם של pKan-Ad7 עם Hpa I. טהר את השבר הגדול pKAd7-HpaI-FL (~30 kb) ואת השבר הקטן pKAd7-HpaI-FS (~7 kb) בהתאמה, באמצעות ערכת שחזור ג'ל DNA לאחר אלקטרופורזה של ג'ל. אחסן את ה-pKAd7-HpaI-FL ב-20 מעלות צלזיוס.
  2. הגבירו את הקטע המכיל את Kan ו-Ori באמצעות pShuttle-CMV כתבנית עם פריימרים של Ad7HpaIF1 ו-Ad7HpaIR1 (טבלה S1) על ידי PCR. שחזר ודלל את תוצר ה-PCR (2541 bp) שישמש כתבנית לסבב השני של תגובת PCR כדי להגביר את Kan-Ori2 עם פריימרים של Ad7HpaIF2 ו-Ad7HpaIR2.
    1. טהר את מוצר ה-PCR (2584 bp) לאחר פירוק בג'ל אגרוז 1% על ידי אלקטרופורזה. הגדר את תגובת ה-PCR באופן הבא: מחזור אחד ב-98 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, ולאחר מכן 30 מחזורי דנטורציה ב-98 מעלות צלזיוס למשך 8 שניות, חישול והארכה ב-72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
      הערה: החלק המרכזי של Kan-Ori2 הוא המקטע המכיל Kan ו-Ori, ואחריו הרצפים של אנדונוקלאז הגבלה ייחודי שאינו קיים במקטע הקטן pKAd7-HpaI-FS (למשל, Pme I), והאזור החופף עם השבר הגדול pKAd7-HpaI-FL; הרצפים החיצוניים ביותר הם האזור החופף עם שבר קטן pKAd7-HpaI-FS.
  3. הוסף את מוצר ה-PCR Kan-Ori2 ואת ה-pKAd7-HpaI-FS המשוחזר בשלב 5.1 ל-DNA Assembly Master Mix. דגירה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך שעה. בצע את שלבים 2.4- 2.6. הפלסמיד הנכון נקרא pKan-Ad7HpaI (~10 kb).
  4. הגבירו את שבר ה-CMV-GFP-PA (~1.7 kb) המכיל מקדם CMV, GFP CDS ואות SV40 polyA (PA) באמצעות pShuttle-GFP23 כתבנית עם פריימרים של Ad7E3GFPF1 ו-Ad7E3GFPR1 (טבלה S1). טהר את מוצר ה-PCR (1650 bp) לאחר פירוק בג'ל אגרוז 1% על ידי אלקטרופורזה.
    הערה: יש לכלול בפריימרים אזורים חופפים שניתן להרכיב עם BstZ17 I ו-Mlu I מעכלים pKan-Ad7HpaI, ואתר הגבלה ייחודי (למשל, Sbf I) שאינו קיים בפלסמיד pKan-Ad7 מתווסף לפריימרים להרכבה נוספת של הגבלה.
  5. עכל 300 ננוגרם של pKan-Ad7HpaI עם BstZ17 I ו- Mlu I. טהר את השבר של 7.3 kb (רוב אזורי E3 נמחקים) לאחר פתרון בג'ל אגרוז 1% על ידי אלקטרופורזה. הוסף את המקטע המשוחזר של 7.3 kb ואת שבר ה-CMV-GFP-PA המשוחזר (~1.6 kb) ל-DNA Assembly Master Mix. בצע את שלבים 2.4-2.6. הפלסמיד הנכון נקרא pKAd7-E3GFP (~ 9 kb).
    הערה: כל הרצפים בין BstZ17 I ו-Mlu I שייכים לאזור E3.
  6. עכל 300 ננוגרם של pKAd7-HE3GFP עם Pme I. טהר את השבר הגדול (~6.4 kb) באמצעות ערכת שחזור ג'ל DNA לאחר אלקטרופורזה של ג'ל. הוסף את השבר המטוהר ואת pKAd7-HpaI-FL ששוחזר בשלב 5.1 ל-DNA Assembly Master Mix. דגירה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך שעה. בצע את שלבים 2.4- 2.6. הפלסמיד הנכון נקרא pKAd7-E3GFP.
  7. Transfect HEK293 עם pKAd7-E3GFP ליניארי Pme I, כמתואר בסעיף 3. אדנו-וירוס שניצל נקרא Ad7-E3GFP.
  8. הגבירו את שבר ה-CMV-mCherry-PA (~1.6 kb) המכיל מקדם CMV, mCherry CDS ואות SV40 polyA באמצעות pKFAV4-CX19A כתבנית עם הפריימרים של Ad7E3CHEF1 ו-Ad7E3CHER1. טהר את מוצר ה-PCR לאחר פתרונו בג'ל אגרוז 1% על ידי אלקטרופורזה.
  9. עכל 600 ננוגרם של pKAd7-E3GFP עם Sbf I, וטהר את השבר של ~35 kb. הוסף את המקטע של 35 kb ואת מקטע ה-CMV-mCherry-PA המשוחזר ל-DNA Assembly Master Mix. דגירה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך שעה. בצע את שלבים 2.4-2.6. הפלסמיד הנכון נקרא pKAd7-E3CHE.
  10. Transfect HEK293 עם pKAd7-E3CHE ליניארי Pme I כמתואר בסעיף 3. האדנו-וירוס שניצל נקרא Ad7-E3CHE.

6. הגברה וטיהור של אדנו-וירוס רקומביננטי בתאי HEK293

  1. יש לחסן שכבה חד-שכבתית של 80%-90% של תאי HEK293 הגדלים בשמונה צלחות תרבית שטופלו ב-TC בקוטר 150 מ"מ עם אדנו-וירוס. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים תחת תסיסה קלה. החלף את הסופרנטנט ב-25 מ"ל של DMEM המכיל 2% FBS.
  2. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 ימים.
    1. השליכו את רוב הסופרנטנט מבין שמונה הכלים בקוטר 150 מ"מ כאשר CPE משפיע על רוב התאים. קצור תאים נגועים באמצעות מרימי תאים בנפח פליטה סופי של ~6.0 מ"ל לתוך צינורות פוליפרופילן של 15 מ"ל.
    2. לשבש את התאים על ידי שלושה מחזורי הקפאה-הפשרה כדי לשחרר את הנגיף. נקה את הליזאט על ידי צנטריפוגה למשך 12 דקות בחום של 1200 x גרם בטמפרטורת החדר. אסוף את ה-supernatant המכיל את הנגיף.
  3. הוסף MgCl2 (0.1 מ"מ) ובנזונאז נוקלאז (50 U/mL) לסופרנטנט. מערבולת בעדינות במשך 40 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הוסיפו NaCl (600 מ"מ) לסופרנטנט ומערבלו בעדינות למשך 40 דקות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה למשך 12 דקות בחום של 1200 x גרם בטמפרטורת החדר. אסוף את הסופרנטנט המכיל וירוס לטיהור.
  4. הכן צזיום כלוריד (CsCl) בריכוזים שונים של 1.35 גרם/מ"ל, 1.30 גרם/מ"ל ו-1.25 גרם/מ"ל עם 10 מ"מ Tris-HCl.
    1. הוסף 0.8 מ"ל של תמיסת CsCl של 1.35 גרם/מ"ל לתחתית שפופרת Ultra-Clear של 5.1 מ"ל באמצעות פיפטה, ולאחר מכן הוסף לאט 0.8 מ"ל של תמיסת CsCl של 1.30 גרם/מ"ל ו-0.8 מ"ל של תמיסת CsCl של 1.25 גרם/מ"ל על גבי התמיסה הראשונה ברצף.
    2. לבסוף, שכבו בזהירות ~2.5 מ"ל של הסופרנטנט שנאסף בשלב 6.3 על גבי תמיסת CsCl של 1.25 גרם/מ"ל, ומלאו את הצינור ל-2-3 מ"מ מלמעלה באמצעות 10 מ"מ Tris-HCl.
  5. צנטריפוגה למשך שעתיים ב-200,000 x g ו-8 °C ברוטור דלי מתנדנד עם האצה והאטה איטית כדי להפריד את החלקיקים הנגיפיים השלמים מהחלקיקים הנגיפיים הפגומים.
    הערה: לאחר צנטריפוגה, ניתן לראות בבירור מספר פסים לבנים בתמיסת CsCl.
  6. הסר בזהירות את רצועות החלקיקים הריקים ואת שכבת פסולת התאים באמצעות הפיפטה, ואסוף את הרצועה הנמוכה ביותר המכילה נגיף בוגר באמצעות מזרק של 2 מ"ל.
  7. העבירו את תרחיף הנגיף שנאסף לקלטת דיאליזה של 20K MWCO, ובצעו דיאליזה במאגר דיאליזה המכיל 10 מ"מ Tris-HCl, 150 מ"מ NaCl, 1 מ"מ MgCl2 ו-2% גליצרול (pH 8.0) למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
    1. החלף את מאגר הדיאליזה המכיל 10 מ"מ Tris-Cl, 150 מ"מ NaCl, 1 מ"מ MgCl2 ו-5% גליצרול (pH 8.0) למחרת ודיאליזה 5 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.
    2. אסוף את חלקיקי הנגיף שעברו דיאליזה באמצעות מזרק של 2 מ"ל. הכן מספר מנות של נפחים קטנים רצויים (20-200 מיקרוליטר) ואחסן את הנגיף המטוהר ב-80 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן לקבוע את טיטר החלקיקים של הנגיף המטוהר על ידי מדידת תכולת ה-DNA הגנומי, וניתן לקבוע את טיטר ההדבקה בתאי HEK293 על ידי ספירת תאים חיוביים ל-GFP עם מבחן הדילול המגביל.

7. זיהוי גנום אדנו-וירוס רקומביננטי על ידי עיכול אנזימי הגבלה

  1. להדביק שכבה חד-שכבתית של 80%-90% של תאי HEK293 הגדלים בבקבוק T-25 אחד עם אדנו-וירוס רקומביננטי. יש לדגור למשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. החלף את מדיום התרבות ב-DMEM טרי המכיל 2% FBS.
  2. הסר את התרבית העל-טבעית וחלץ את ה-DNA הגנומי הנגיפי בשיטת Hirt המותאמת המתוארת בשלב 1.3 כאשר CPE מתרחש תוך 2-3 ימים.
  3. עכל את ה-DNA הגנומי של אדנו-וירוס רקומביננטי עם אנזימים שצוינו, ונתח על אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז. הפלסמיד האדנוויראלי הרקומביננטי שימש כבקרה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

האסטרטגיה לבניית שיבוט זיהומי של HAdV-7 מוצגת באיור 1 ובאיור 2. שני פלסמידים משובטים זיהומיים נבחרו באופן אקראי וזוהו על ידי BstZ17 I, BamH I ו-EcoR V, בהתאמה. התוצאות הראו שהשברים תואמים את הגודל הצפוי (איור 2A), מה שמצביע על כך שהפלסמידי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

לאדנו-וירוסים שונים יש טרופיזמים שונים של רקמות, והשכיחות של חסינות קיימת של מארח נגד אדנו-וירוסים שונים יכולה להשתנות באופן אינטנסיבי בבני אדם24, מה שמושך את העניין בבניית וקטורים אדנו-ויראליים חדשים לטיפול גנטי או לפיתוח חיסונים. עם זאת, הקמת מערכת וקטור א?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי קרן מדעי הטבע של בייג'ינג (7204258), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82161138001, 82072266), קרן החדשנות CAMS למדעי הרפואה (2019-I2M-5-026), והמחקר והיישום על מעקב מולקולרי של פתוגנים נשימתיים חיוניים בבייג'ינג, על ידי Capital Health Development and Research of Special (2021-1G-3012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL polypropylene microcentrifuge TubeAxygenMCT-150-CStorage of virus
15 mL polypropylene centrifuge tubesCorning430790Storage of virus
150 mm TC-treated culture dishesCorning430599Growth of HEK29E cells
20 K MWCO dialysis cassetteThermoFisher Scientific66005Dialysis of virus
Acetic acidAmresco714Extraction of DNA
Afl IINEBR0520Digestion
AgaroseTakara5260Electrophoresis
Age INEBR0552Digestion
Asc INEBR0558Digestion
BamH INEBR0136Digestion
Benzonase NucleaseSigmaE8263-25KUPurification of virus
BsrG INEBR0575Digestion
Cell lifterCorning3008Scrape off the cells 
CsClSigmaC3032Purification of virus
DNA gel recovery kitZymoD4045Recovery of DNA
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)CytivaSH30022.01HEK293 cells medium
E.coli TOP10 competent cellsTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.CB-104Transformation of assembly product
EcoR VNEBR3195Digestion
EDTAThermo Fisher ScientificR3104Extraction of DNA
Fetal bovine serum (FBS)CytivaSV30208.02HEK293 cells culture
Genomic DNA Clean and concentrator kitZymoD4065Purification of DNA
GlycerolShanghai Macklin Biochemical Co., LtdG810575Dialysis of virus
HEK293 cellsATCCCRL-1573Amplification of virus
High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0491PCR
Hind IIINEBR3104Digestion
Kanamycin sulfateAmresco408Selection of plasmid
Kpn INEBR3142Digestion
Lambda/HindIII DNA markerTakara3403Electrophoresis
LB brothBD240230LB plate for bacteria
LB mediumSolarbio Life ScienceL1010Medium for bacteria
MgCl2Sigma63068Dialysis of virus
MicrocentrifugeThermo Fisher ScientificSorvall Legend Micro 21RExtraction of DNA
NaClSigmaS5886Dialysis of virus
Nde INEBR0111Digestion
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621DNA assembly
Nhe INEBR0131Digestion
Phosphate Buffered SalineCytivaSH30256.01Washing of cells
PipetteThermo Fisher ScientificMatrixAspirate the medium
Plasmid Maxprep KitVigorous Biotechnology Beijing Co., Ltd.N001Extraction of DNA
Plasmid Miniprep KitTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.DP103Extraction of DNA
Pme INEBR0560Digestion
Potassium acetateAmresco698Extraction of DNA
Protease KThermo Fisher ScientificAM2542Extraction of DNA
pShuttle-CMVStratagene240007PCR template
RNaseBeyotimeD7089Extraction of DNA
Sal INEBR0138Digestion
Sbf INEBR3642Digestion
SDSAmresco227Extraction of DNA
Swinging-bucket rotorHITACHIS52STPurification of virus
T-25 cell flaskCorning430639Growth of HEK29E cells
T-75 cell flaskCorning430641Growth of HEK29E cells
Transfection reagentPolyplus-transfection114-15Transfection
Transmission electron microscopeFEITECNAI 12Obsevation of virus
Tris-HClAmresco234Dialysis of virus
UltracentrifugeHITACHIHimac CS120GXIIPurification of virus

References

  1. Lasaro, M. O., Ertl, H. C. New insights on adenovirus as vaccine vectors. Molecular Therapy. 17 (8), 1333-1339 (2009).
  2. Fuchs, J. D., et al. Safety and immunogenicity of a recombinant adenovirus serotype 35-Vectored HIV-1 vaccine in adenovirus serotype 5 seronegative and seropositive individuals. Journal of AIDS & Clinical Research. 6 (5), (2015).
  3. Milligan, I. D., et al. Safety and immunogenicity of novel adenovirus type 26- and modified vaccinia ankara-vectored ebola vaccines: a randomized clinical trial. JAMA. 315 (15), 1610-1623 (2016).
  4. Zhu, F. C., et al. Safety, tolerability, and immunogenicity of a recombinant adenovirus type-5 vectored COVID-19 vaccine: a dose-escalation, open-label, non-randomised, first-in-human trial. Lancet. 395 (10240), 1845-1854 (2020).
  5. He, T. C., et al. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2509-2514 (1998).
  6. Danthinne, X., Imperiale, M. J. Production of first generation adenovirus vectors: a review. Gene Therapy. 7 (20), 1707-1714 (2000).
  7. Guo, X., et al. Systemic and mucosal immunity in mice elicited by a single immunization with human adenovirus type 5 or 41 vector-based vaccines carrying the spike protein of Middle East respiratory syndrome coronavirus. Immunology. 145 (4), 476-484 (2015).
  8. Folegatti, P. M., et al. Safety and immunogenicity of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine against SARS-CoV-2: a preliminary report of a phase 1/2, single-blind, randomised controlled trial. Lancet. 396 (10249), 467-478 (2020).
  9. Jang, Y., Bunz, F. AdenoBuilder: A platform for the modular assembly of recombinant adenoviruses. STAR Protocols. 3 (1), 101123(2022).
  10. Zhou, X., Sena-Esteves, M., Gao, G. Construction of recombinant adenovirus genomes by direct cloning. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (5), (2019).
  11. Ruzsics, Z., Lemnitzer, F., Thirion, C. Engineering adenovirus genome by bacterial artificial chromosome (BAC) technology. Methods in Molecular Biology. 1089, 143-158 (2014).
  12. Zhou, D., et al. An efficient method of directly cloning chimpanzee adenovirus as a vaccine vector. Nature Protocols. 5 (11), 1775-1785 (2010).
  13. Zou, X. H., et al. DNA assembly technique simplifies the construction of infectious clone of fowl adenovirus. Journal of Virological Methods. 257, 85-92 (2018).
  14. Guo, X., et al. Site-directed modification of adenoviral vector with combined DNA assembly and restriction-ligation cloning. Journal of Biotechnology. 307, 193-201 (2020).
  15. Liu, H., et al. Single plasmid-based, upgradable, and backward-compatible adenoviral vector systems. Human Gene Therapy. 30 (6), 777-791 (2019).
  16. Yan, B., et al. User-friendly reverse genetics system for modification of the right end of fowl adenovirus 4 genome. Viruses. 12 (3), 301(2020).
  17. Zhang, W., et al. Fiber modifications enable fowl adenovirus 4 vectors to transduce human cells. Journal of Gene Medicine. 23 (10), 3368(2021).
  18. Zou, X., et al. Fiber1, but not fiber2, is the essential fiber gene for fowl adenovirus 4 (FAdV-4). Journal of General Virology. 102 (3), 001559(2021).
  19. Guo, X., et al. Restriction-assembly: a solution to construct novel adenovirus vector. Viruses. 14 (3), 546(2022).
  20. Duan, Y., et al. Genetic analysis of human adenovirus type 7 strains circulating in different parts of China. Virologica Sinica. 36 (3), 382-392 (2021).
  21. Arad, U. Modified Hirt procedure for rapid purification of extrachromosomal DNA from mammalian cells. Biotechniques. 24 (5), 760-762 (1998).
  22. Knipe, D. M. H. P. M. Fields' Virology. 2, 1733(2013).
  23. Liu, H. Y., Han, B. J., Zhong, Y. X., Lu, Z. Z. A three-plasmid system for construction of armed oncolytic adenovirus. Journal of Virological Methods. 162 (1-2), 8-13 (2009).
  24. Mennechet, F. J. D., et al. A review of 65 years of human adenovirus seroprevalence. Expert Review of Vaccines. 18 (6), 597-613 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

DNAHAdV 7PCRE3HEK293

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved