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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

In questo studio, è stato costruito un clone infettivo dell'adenovirus umano di tipo 7 (HAdV-7) ed è stato stabilito un sistema di vettori HAdV-7 con delezione E3 modificando il clone infettivo. Questa strategia qui utilizzata può essere generalizzata per creare vettori di trasferimento genico da altri adenovirus wild-type.

Abstract

I vettori adenovirali sono stati utilizzati come strumento di trasferimento genico nella terapia genica per più di tre decenni. Qui, introduciamo un protocollo per costruire un vettore adenovirale manipolando il DNA genomico di HAdV-7 wild-type utilizzando un metodo di assemblaggio del DNA. In primo luogo, un clone infettivo di HAdV-7, pKan-Ad7, è stato generato fondendo il DNA genomico virale con un prodotto PCR dalla spina dorsale del plasmide, comprendente il gene resistente alla kanamicina e l'origine della replicazione (Kan-Ori), attraverso l'assemblaggio del DNA. Ciò è stato fatto progettando una coppia di primer PCR, che contenevano ~25 nucleotidi della sequenza terminale della ripetizione terminale invertita (ITR) HAdV-7 all'estremità 5', un sito enzimatico di restrizione non cutter per il genoma HAdV-7 al centro e una sequenza specifica per il priming PCR all'estremità 3'. In secondo luogo, è stata impiegata una strategia intermedia basata su plasmidi per sostituire la regione E3 con elementi che esprimono transgeni nel clone infettivo per generare un vettore adenovirale. In breve, pKan-Ad7 è stato digerito con l'enzima di restrizione a doppia taglierina Hpa I, e il frammento contenente la regione E3 è stato legato a un altro prodotto PCR della spina dorsale del plasmide mediante assemblaggio di Gibson per costruire un plasmide intermedio pKan-Ad7HpaI. Per comodità, l'assemblaggio di restrizione è stato utilizzato per designare il metodo di clonazione plasmidico di digestione e assemblaggio di restrizione combinata. Utilizzando l'assemblaggio di restrizione, i geni E3 in pKan-Ad7HpaI sono stati sostituiti con una cassetta di espressione della proteina fluorescente verde (GFP) e la regione E3 modificata è stata rilasciata dal plasmide intermedio e ripristinata nel clone infettivo per generare un plasmide adenovirale pKAd7-E3GFP. Infine, pKAd7-E3GFP è stato linearizzato mediante digestione Pme I e utilizzato per trasfettare le cellule di imballaggio HEK293 per salvare il virus HAdV-7 ricombinante. Per concludere, è stata introdotta una strategia basata sull'assemblaggio del DNA per la costruzione di vettori adenovirali in laboratori generali di biologia molecolare senza la necessità di materiali e strumenti specializzati.

Introduzione

Negli ultimi tre decenni, i vettori adenovirali ricombinanti sono stati ampiamente utilizzati nello sviluppo di vaccini e nella terapia genica 1,2,3,4, nonché nella ricerca di base grazie alle loro eccezionali proprietà biologiche, come l'elevata efficienza di trasduzione genica, la non integrazione con il genoma ospite, il genoma virale manipolativo e la facilità di produzione su larga scala.

Attualmente, i vettori adenovirali più comunemente usati sono costruiti sulla base dell'adenovirus umano 5 (HAdV-5)5,6. Sebbene la trasduzione mediata dal vettore HAdV-5 fornisca risultati incoraggianti, le applicazioni precliniche e cliniche hanno rivelato diversi svantaggi (ad esempio, un'elevata immunità anti-vettore preesistente all'interno della popolazione umana e una bassa efficienza di trasduzione in cellule prive del coxsackievirus e del recettore dell'adenovirus (CAR)). Per aggirare questi problemi, c'è stato un grande interesse a costruire vettori basati su altri tipi di adenovirus umani o mammiferi 3,7,8.

Fino ad ora, il metodo più popolare per costruire un vettore adenovirale è la ricombinazione omologa nei batteri5. Tali ceppi batterici devono esprimere ricombinasi, che possono influenzare la stabilità o l'amplificazione dei plasmidi di cui sono portatori. Alcune varietà non sono nemmeno disponibili in commercio. Recentemente, metodi basati su altri principi, tra cui i cromosomi artificiali batterici, la clonazione diretta o l'assemblaggio diretto del DNA, sono stati impiegati per generare cloni infettivi di adenovirus o vettori adenovirali ricombinanti 9,10,11,12. Tuttavia, questi metodi sono in qualche modo ostili ai ricercatori con poca esperienza in questo campo.

Nel 2018, il processo di costruzione di un clone infettivo di adenovirus è stato semplificato in laboratorio legando direttamente il genoma del virus con un prodotto PCR che trasporta la spina dorsale plasmidica attraverso l'assemblaggio di Gibson13. Successivamente, i metodi di digestione per restrizione e l'assemblaggio di Gibson vengono combinati insieme per caricare i transgeni nei plasmidi adenovirali esistenti 14,15,16,17,18. Per comodità, l'assemblaggio di restrizione è usato di seguito per riferirsi al metodo di digestione enzimatica di restrizione combinata e all'assemblaggio di Gibson. Sono state ulteriormente sviluppate strategie per costruire vettori adenovirali da cloni infettivi utilizzando l'assemblaggio di restrizione19. L'essenza dell'assemblaggio di restrizione consiste nell'includere il più possibile i frammenti asportati dai plasmidi in una reazione di assemblaggio del DNA, mentre i prodotti di PCR corti fungono da linker o patch per la modifica dei plasmidi. Allo stesso tempo, il numero di frammenti inclusi viene mantenuto il più basso possibile. Tali sforzi riflettono i risultati; la possibilità di mutazioni indesiderate causate dalla PCR o dall'assemblaggio del DNA può essere ridotta al minimo e il tasso di successo può essere migliorato. In conclusione, è stata messa a punto in laboratorio una pipeline da un adenovirus wild-type a un vettore adenovirale 13,14,15,16,17,18,19.

Qui, tentiamo di introdurre questi metodi fornendo esempi di costruzione di un clone infettivo HAdV-7 e di un vettore HAdV-7 competente per la replicazione E3.

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Protocollo

NOTA: Gli adenovirus sono classificati come Livello di Biosicurezza 2 (BSL-2); Tutte le fasi per l'utilizzo dei virus sono state eseguite in un laboratorio di biosicurezza di livello 2. L'HAdV-7 wild-type è stato isolato nel 2017 dal campione di aspirato nasofaringeo di un neonato di 10 mesi ricoverato in ospedale con infezione acuta del tratto respiratorio presso l'ospedale pediatrico20 di Pechino. Le scorte di virus sono state conservate a -80 °C.

1. Estrazione del DNA genomico HAdV-7

  1. Seminare 2,0 x 106 cellule HEK293 in un pallone T-25 contenente 5 mL di terreno di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) più il 10% di siero fetale bovino (FBS) e coltura a 37 °C in atmosfera umidificata integrata con il 5% di CO2. Le cellule dovrebbero essere confluenti all'80%-90% e pronte per l'infezione in 18-24 ore.
  2. Inoculare le cellule con HAdV-7 wild-type per 2 ore. Rimuovere il terreno contenente il virus mediante aspirazione e aggiungere alle cellule 5 ml di DMEM fresco contenente il 2% di FBS.
  3. Estrarre il DNA genomico virale con il metodo di Hirt modificato21
    1. In 2 o 3 giorni dopo l'infezione, quando si osserva un effetto citopatico (CPE) sul 50%-90% delle cellule, scartare il surnatante della coltura e sciacquare le cellule una volta con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
      NOTA: L'effetto citopatico (CPE) è definito come un fenomeno in cui le cellule infettate dal virus si arrotondano, si gonfiano e si attaccano o si staccano liberamente dal pallone di coltura in grappoli simili a chicchi d'uva22.
    2. Lisi le cellule nel pallone in 1,0 mL di tampone di lisi contenente 25 mM di Tris-HCl, 0,5 mM di EDTA, 50 μg/mL di proteasi K e 0,8% di SDS (pH7,6) per 5 minuti su ghiaccio. Trasferire il lisato in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e incubare la provetta a bagnomaria a 50 °C per 30 minuti.
    3. Aggiungere 120 μl di tampone di precipitazione alla provetta. Mettere il tubo sul ghiaccio per altri 30 minuti dopo averlo mescolato delicatamente.
      NOTA: Il tampone di precipitazione è composto da 3 M di CsCl, 1 M di acetato di potassio e 0,67 M di acido acetico. Aiuterà a far precipitare i detriti cellulari e il DNA cromosomico cellulare dopo la centrifugazione, mantenendo il genoma del virus nel surnatante.
    4. Centrifugare la provetta per 25 minuti a 15.000 x g a 4 °C, quindi trasferire il surnatante (circa 1,1 mL) in una provetta di polipropilene da 15 mL.
    5. Aggiungere 2,2 mL di etanolo assoluto ghiacciato alla provetta. Mescolare delicatamente e lasciare riposare il tubo sul ghiaccio per 15 minuti. Centrifugare per 5 min a 2000 x g a temperatura ambiente.
    6. Aspirare accuratamente il surnatante e lavare una volta il precipitato (DNA genomico del virus) con 800 μl di etanolo al 70%. Centrifugare la provetta per 6 minuti a 15.000 x g a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e asciugare all'aria il pellet di DNA sul fondo. Non asciugare eccessivamente il pellet di DNA poiché potrebbe causare difficoltà nella ridissoluzione.
    7. Sciogliere il pellet in 200 μL di tampone TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM EDTA), aggiungere 1 μL di RNasi A (10 mg/mL) e incubare la provetta a 37 °C per 15 min. Purificare il DNA disciolto utilizzando un kit commerciale per la pulizia e il concentramento del DNA genomico (vedere la Tabella dei materiali).
      NOTA: Quantificare il DNA genomico virale con il metodo comunemente usato in laboratorio. Generalmente, 1-5 μg di DNA genomico possono essere ottenuti in un pallone T-25 di cellule HEK293 infettate con adenovirus.

2. Costruzione di un clone infettivo di HAdV-7 mediante assemblaggio del DNA

  1. Progettazione di primer PCR per amplificare la spina dorsale del plasmide (Figura 1). Aggiungere le sequenze di sovrapposizione necessarie per l'assemblaggio del DNA alle estremità 5' dei primer PCR. Inoltre, includere siti di restrizione non cutter (ad esempio, il sito Pme I) su entrambe le estremità del genoma HAdV-7 per aiutare a rilasciare il genoma virale dal clone infettivo.
    NOTA: La spina dorsale plasmidica contenente il gene resistente agli antibiotici e l'origine della replicazione vengono amplificati mediante PCR e fusi con il genoma HAdV-7. Gli adenovirus possono essere salvati dalle cellule di imballaggio con maggiore efficienza quando viene utilizzato il genoma virale linearizzato al posto di un plasmide adenovirale circolare. Dopo aver considerato i fattori sopra menzionati, i primer vengono progettati come mostrato nella Figura 1.
  2. Eseguire la PCR per amplificare un frammento (Kan-Ori) contenente il gene di resistenza alla kanamicina (Kan) e l'origine pBR322 (Ori) utilizzando pShuttle-CMV come stampo con primer di Ad7KanF1 e Ad7KanR1 (Tabella S1). Impostare la reazione PCR come segue: un ciclo a 98 °C per 30 s, poi cinque cicli di denaturazione a 98 °C per 8 s, ricottura a 68 °C per 30 s, estensione a 72 °C per 90 s e infine 25 cicli di denaturazione a 98 °C per 8 s, ricottura e prolungamento a 72 °C per 2 min.
  3. Eseguire il prodotto PCR in un gel di agarosio all'1% mediante elettroforesi e purificare il frammento utilizzando un kit di recupero del gel di DNA commerciale.
  4. Aggiungere il Kan-Ori recuperato e il DNA genomico virale di HAdV-7 al DNA Assembly Master Mix commerciale. Impostare la reazione di assemblaggio in un volume totale di 20 μl e un rapporto molare tra vettore e DNA genomico virale di 1:2. Incubare a 50 °C per 1 ora.
    NOTA: Impostare la reazione in un volume totale di 20 μl con 1-3 μl di vettore, 7-9 μl di DNA genomico virale e 10 μl di DNA Assembly Master Mix.
  5. Trasformare le cellule TOP10 del ceppo di E. coli chimicamente competenti con 10 μl di prodotto di assemblaggio utilizzando lo shock termico. Distribuire la miscela di trasformazione su piastre Luria-Bertani (LB-Kan) contenenti kanamicina (50 μg/mL). Incubare le piastre a 37 °C per almeno 12 ore.
  6. Inoculare almeno tre cloni ciascuno in 5 mL di terreno LB-Kan a 37 °C per 12 ore agitando delicatamente (200-250 giri/min). Estrai il DNA plasmidico utilizzando un kit di minipreparazione plasmidico commerciale.
  7. Digerire il plasmide utilizzando l'endonucleasi di restrizione, quindi controllare le dimensioni dei frammenti di DNA con l'elettroforesi su gel di agarosio (Figura 2A). Inoltre, confermare i siti di fusione mediante sequenziamento. Il plasmide di assemblaggio corretto è chiamato pKan-Ad7.
  8. Coltiva una coltura di batteri da 100 ml dal clone corretto. Estrarre un preparato di maxi-plasmidi utilizzando un kit Plasmid Maxprep in commercio.

3. Costruzione e modifica in silico di un plasmide intermedio

NOTA: In generale, un plasmide intermedio dovrebbe essere costruito e come costruire un plasmide intermedio ideale è il passaggio chiave. Per la progettazione di un plasmide intermedio è necessario un software di analisi del DNA con un modulo di enzima di restrizione, come pDRAW32 (un software gratuito, disponibile all'indirizzo www.acaclone.com).

  1. Importa la sequenza di DNA di pKan-Ad7 in pDRAW32 per disegnare una mappa plasmidica. Annota le regioni di interesse sulla mappa. Per pKan-Ad7, sono state annotate le regioni E1, E3 e la dorsale plasmidica (Kan-Ori).
  2. Azionare il programma pDRAW32. Fare clic su Impostazioni > selezione enzimatica , quindi su Tagli min/max. Immettere 1 nella casella Min e 2 nella casella Max, quindi selezionare la casella prima nell'intera sequenza. Infine, fare clic su OK per visualizzare i siti dell'enzima di restrizione univoca e doppia taglierina sulla mappa.
    NOTA: Generalmente, vengono selezionati solo gli enzimi di restrizione che riconoscono una sequenza di 6 bp o più. Come mostrato nella Figura 3A, 17 enzimi soddisfano i criteri di selezione degli enzimi.
  3. Si consideri il primo sito di restrizione che fiancheggia la regione E3 poiché è prevista la modifica dell'E3. Hpa I, Sal I, Avr II-Mlu I e Spe I soddisfacevano il requisito.
    NOTA: Per questo esperimento, Hpa I è stato selezionato perché la digestione di pKan-Ad7 con esso genererebbe il frammento più corto che trasporta la regione E3, e un plasmide intermedio più piccolo renderebbe più facile la futura modifica. La selezione dei siti Sal I ha anche dei vantaggi: un plasmide intermedio è adatto per la modifica di entrambe le regioni E1 ed E3 (Figura S1).
  4. Creare un file di sequenza finale che mostri entrambi i filamenti di DNA del plasmide intermedio pKan-Ad7HpaI. Questa sequenza virtuale può essere utilizzata come modello per progettare primer sovrapposti.
    1. Copiare la sequenza tra i due siti di restrizione Hpa I, inclusa la regione E3. Per il successivo assemblaggio, è necessario copiare ogni sequenza di ~20 bp (Tm uguale o superiore a 48°C) al di fuori del sito di restrizione Hpa I (Figura 3C, sovrapposizione-Finale 1 e sovrapposizione-Finale2).
    2. Aggiungere la sequenza di riconoscimento di Pme I (Figura 3C, gtttaaac) ad entrambe le estremità della sequenza precedente.
    3. Aggiungere la sequenza del plasmide principale contenente il gene resistente agli antibiotici e l'origine della replicazione (Figura 3C, Kan-Ori) al di fuori del sito di restrizione Pme I.
    4. Importa la sequenza finale in pDRAW32 per disegnare una mappa plasmidica. Annota la regione E3 sulla mappa.
    5. Azionare il programma pDRAW32. Fare clic su Impostazioni > selezione enzimatica , quindi su Tagli min/max. Immettere 1 in entrambe le caselle Min e Max e spuntare la casella prima nell'intera sequenza. Fare clic su OK per visualizzare i siti degli enzimi di restrizione univoci sulla mappa. Si può vedere che sono disponibili molte frese uniche per la modifica E3.
      NOTA: Per questo esperimento, BstZ17 I e Mlu I sono selezionati per la sostituzione di E3 parziale. Anche una doppia taglierina può essere utile. Ad esempio, la doppia taglierina Ssp I insieme all'esclusiva taglierina BssH II possono essere selezionate per la sostituzione dell'intera regione E3 utilizzando la PCR con estensione sovrapposta.
  5. Progettazione di primer utilizzando la sequenza virtuale come modello per la costruzione di plasmidi intermedi (Figura 3C).
    NOTA: Per accorciare la lunghezza di ciascun innesco, sono stati progettati quattro innesco. Il prodotto della PCR, che viene amplificato con primer di Ad7HpaIF1 e Ad7HpaIR1, verrebbe utilizzato come modello per ottenere il frammento finale di PCR con primer di Ad7HpaIF2 e Ad7HpaIR2 (Figura 3C).

4. Salvataggio di adenovirus ricombinante infettivo in cellule HEK293

NOTA: I tre adenovirus generati in questo articolo sono tutti salvati secondo il seguente protocollo.

  1. Digerire 10 μg di plasmide adenovirale ricombinante con 2 μL di Pme I per 5 ore a 37 °C in un volume totale di 100 μL per linearizzare il plasmide. Controllare 1 μL di DNA digerito su un gel di agarosio allo 0,8%. La digestione dovrebbe produrre un frammento di ~34 kb del genoma adenovirale e una spina dorsale plasmidica di ~2,5 kb di Kan-Ori.
  2. Purificare il plasmide adenovirale linearizzato residuo utilizzando il kit genomico DNA Clean and Concentrator.
  3. Coltura di cellule HEK293 in DMEM più il 10% di FBS. Seminare le cellule HEK293 (2 x 106 cellule) in un pallone T-25 1 giorno prima della trasfezione in modo che raggiungano il 70%-80% di confluenza il giorno successivo. Utilizzare 5 μg di plasmide adenovirale digerito Pme I per trasfettare le cellule HEK293 utilizzando reagenti di trasfezione disponibili in commercio.
    NOTA: Il mezzo delle cellule trasfettate deve essere sostituito ogni 3 giorni.
  4. Controllare le cellule ogni giorno, raccogliere le cellule e il terreno di coltura in una provetta di polipropilene da 15 mL quando si formano i focolai di cometa (Figura 2B, che indica la replicazione del virus).
  5. Lisi le cellule attraverso tre cicli di congelamento-scongelamento. Dopo la centrifugazione per 12 minuti a 1200 x g a temperatura ambiente, raccogliere il surnatante e conservarlo a -80 °C per la successiva propagazione del virus.
    NOTA: Quando l'adenovirus ricombinante esprime GFP o altre proteine fluorescenti, è più facile identificare se il virus viene salvato con successo, poiché i focolai formati da cellule fluorescenti positive alle proteine possono essere osservati in modo intuitivo al microscopio a fluorescenza.

5. Costruzione del plasmide genomico HAdV-7 con delezione E3

NOTA: Il genoma di HAdV-7 è lungo 35.239 bp e la regione E3 si trova tra 27.354 bp e 31.057 bp del genoma. Per costruire un plasmide intermedio, trovare un'endonucleasi con due siti di taglio sul plasmide clone infettivo, o due endonucleasi con un singolo sito di taglio sul plasmide. Sono disponibili Hpa I, Sal I, o Avr II e Mlu I. La sequenza tra BstZ17 I (28.312 bp) e Mlu I (30.757 bp) deve essere eliminata e sostituita con la cassetta CMV-GFP-PA o la cassetta CMV-mCherry-PA.

  1. Digerire 600 ng di pKan-Ad7 con Hpa I. Purificare rispettivamente il frammento grande pKAd7-HpaI-FL (~30 kb) e il frammento piccolo pKAd7-HpaI-FS (~7 kb), utilizzando un kit di recupero su gel di DNA dopo l'elettroforesi su gel. Conservare il pKAd7-HpaI-FL a -20 °C.
  2. Amplificare il frammento contenente Kan e Ori utilizzando pShuttle-CMV come stampo con i primer di Ad7HpaIF1 e Ad7HpaIR1 (Tabella S1) mediante PCR. Recuperare e diluire il prodotto della PCR (2541 bp) da utilizzare come modello per il secondo ciclo di reazione PCR per amplificare Kan-Ori2 con i primer di Ad7HpaIF2 e Ad7HpaIR2.
    1. Purificare il prodotto della PCR (2584 bp) dopo averlo risolto in un gel di agarosio all'1% mediante elettroforesi. Impostare la reazione PCR come segue: un ciclo a 98 °C per 30 s, poi 30 cicli di denaturazione a 98 °C per 8 s, ricottura e prolungamento a 72 °C per 2 min.
      NOTA: La parte centrale di Kan-Ori2 è il frammento contenente Kan e Ori, seguito dalle sequenze di un'unica endonucleasi di restrizione che non esiste nel piccolo frammento pKAd7-HpaI-FS (ad esempio, Pme I), e dalla regione sovrapposta con il grande frammento pKAd7-HpaI-FL; la sequenza più esterna è la regione sovrapposta con il piccolo frammento pKAd7-HpaI-FS.
  3. Aggiungere il prodotto PCR Kan-Ori2 e il pKAd7-HpaI-FS recuperato nel passaggio 5.1 a DNA Assembly Master Mix. Incubare a 50 °C per 1 ora. Seguire i passaggi 2.4- 2.6. Il plasmide corretto si chiama pKan-Ad7HpaI (~10 kb).
  4. Amplificare il frammento CMV-GFP-PA (~1,7 kb) contenente il promotore CMV, GFP CDS e il segnale SV40 polyA (PA) utilizzando pShuttle-GFP23 come modello con i primer di Ad7E3GFPF1 e Ad7E3GFPR1 (Tabella S1). Purificare il prodotto della PCR (1650 bp) dopo averlo risolto in un gel di agarosio all'1% mediante elettroforesi.
    NOTA: Le regioni sovrapposte che possono essere assemblate con pKan-Ad7HpaI digerito con BstZ17 I e Mlu I dovrebbero essere incluse nei primer e un sito di restrizione unico (ad esempio, Sbf I) che non esiste nel plasmide pKan-Ad7 viene aggiunto ai primer per un ulteriore assemblaggio di restrizioni.
  5. Digerire 300 ng di pKan-Ad7HpaI con BstZ17 I e Mlu I. Purificare il frammento di 7,3 kb (la maggior parte delle regioni E3 viene eliminata) dopo averlo risolto in un gel di agarosio all'1% mediante elettroforesi. Aggiungere il frammento recuperato da 7,3 kb e il frammento CMV-GFP-PA recuperato (~1,6 kb) al DNA Assembly Master Mix. Seguire i passaggi 2.4-2.6. Il plasmide corretto si chiama pKAd7-E3GFP (~9 kb).
    NOTA: Tutte le sequenze tra BstZ17 I e Mlu I appartengono alla regione E3.
  6. Digerire 300 ng di pKAd7-HE3GFP con Pme I. Purificare il frammento grande (~6,4 kb) utilizzando un kit di recupero su gel di DNA dopo l'elettroforesi su gel. Aggiungere il frammento purificato e il pKAd7-HpaI-FL recuperato nel passaggio 5.1 al DNA Assembly Master Mix. Incubare a 50 °C per 1 ora. Seguire i passaggi 2.4- 2.6. Il plasmide corretto è chiamato pKAd7-E3GFP.
  7. Trasfettare le cellule HEK293 con pKAd7-E3GFP linearizzato Pme I come descritto nella sezione 3. L'adenovirus recuperato si chiama Ad7-E3GFP.
  8. Amplificare il frammento CMV-mCherry-PA (~1,6 kb) contenente il promotore CMV, mCherry CDS e il segnale SV40 polyA utilizzando pKFAV4-CX19A come modello con i primer di Ad7E3CHEF1 e Ad7E3CHER1. Purificare il prodotto della PCR dopo averlo risolto in un gel di agarosio all'1% mediante elettroforesi.
  9. Digerire 600 ng di pKAd7-E3GFP con Sbf I, e purificare il frammento di ~35 kb. Aggiungere il frammento da 35 kb e il frammento CMV-mCherry-PA recuperato al DNA Assembly Master Mix. Incubare a 50 °C per 1 ora. Seguire i passaggi 2.4-2.6. Il plasmide corretto si chiama pKAd7-E3CHE.
  10. Trasfettare le cellule HEK293 con pKAd7-E3CHE linearizzato Pme I, come descritto nella sezione 3. L'adenovirus salvato è chiamato Ad7-E3CHE.

6. Amplificazione e purificazione dell'adenovirus ricombinante in cellule HEK293

  1. Inoculare un monostrato confluente all'80%-90% di cellule HEK293 coltivate in otto piastre di coltura trattate con TC di 150 mm di diametro con adenovirus. Incubare a 37 °C per 2 ore in leggera agitazione. Sostituire il surnatante con 25 ml di DMEM contenente il 2% di FBS.
  2. Incubare le cellule a 37 °C per 2-3 giorni.
    1. Scartare la maggior parte del surnatante delle otto piastre da 150 mm di diametro quando un CPE colpisce la maggior parte delle cellule. Raccogliere le cellule infette utilizzando sollevatori cellulari con un volume di eluizione finale di ~6,0 mL in provette di polipropilene da 15 mL.
    2. Distruggi le cellule con tre cicli di congelamento-scongelamento per rilasciare il virus. Eliminare il lisato mediante centrifugazione per 12 minuti a 1200 x g a temperatura ambiente. Raccogliere il surnatante contenente virus.
  3. Aggiungere MgCl2 (0,1 mM) e benzonasi nucleasi (50 U/mL) al surnatante. Agitare delicatamente per 40 minuti a 37 °C. Aggiungere NaCl (600 mM) al surnatante e agitare delicatamente per altri 40 minuti a 37 °C. Centrifugare per 12 min a 1200 x g a temperatura ambiente. Raccogliere il surnatante contenente virus per la purificazione.
  4. Preparare il cloruro di cesio (CsCl) con diverse concentrazioni di 1,35 g/mL, 1,30 g/mL e 1,25 g/mL con 10 mM di Tris-HCl.
    1. Aggiungere 0,8 mL di soluzione di CsCl da 1,35 g/mL sul fondo di una provetta Ultra-Clear da 5,1 mL utilizzando una pipetta, quindi aggiungere lentamente 0,8 mL di soluzione di CsCl da 1,30 g/mL e 0,8 mL di soluzione di CsCl da 1,25 g/mL sopra la prima soluzione in sequenza.
    2. Infine, sovrapporre con cura ~2,5 mL del surnatante raccolto al passaggio 6.3 sulla parte superiore di 1,25 g/mL di soluzione di CsCl e riempire la provetta a 2-3 mm dall'alto utilizzando 10 mM di Tris-HCl.
  5. Centrifugare per 2 ore a 200.000 x g e 8 °C in un rotore a secchiello oscillante con accelerazione e decelerazione lente per separare le particelle virali intatte dalle particelle virali difettose.
    NOTA: Dopo la centrifugazione, si possono vedere chiaramente diverse bande bianche nella soluzione di CsCl.
  6. Rimuovere con cautela le bande delle particelle vuote e lo strato di detriti cellulari utilizzando la pipetta e raccogliere la banda più bassa contenente il virus maturo utilizzando una siringa da 2 ml.
  7. Trasferire la sospensione virale raccolta in una cassetta per dialisi MWCO da 20 K e dializzarla in un tampone per dialisi contenente 10 mM di Tris-HCl, 150 mM di NaCl, 1 mM di MgCl2 e glicerolo al 2% (pH 8,0) per una notte a 4 °C.
    1. Il giorno successivo sostituire il tampone per dialisi contenente 10 mM di Tris-Cl, 150 mM di NaCl, 1 mM di MgCl2 e glicerolo al 5% (pH 8,0) e dializzare per 5 ore a 4 °C.
    2. Raccogliere le particelle virali dializzate utilizzando una siringa da 2 ml. Preparare aliquote multiple dei piccoli volumi desiderati (20-200 μL) e conservare il virus purificato a -80 °C.
      NOTA: Il titolo di particelle del virus purificato può essere determinato misurando il contenuto di DNA genomico e il titolo di infettività può essere determinato sulle cellule HEK293 contando le cellule GFP-positive con il saggio di diluizione limitante.

7. Identificazione del genoma dell'adenovirus ricombinante mediante digestione enzimatica di restrizione

  1. Infettare un monostrato confluente all'80%-90% di cellule HEK293 coltivate in una fiaschetta T-25 con adenovirus ricombinante. Incubare per 2 ore a 37 °C. Sostituire il terreno di coltura con DMEM fresco contenente il 2% di FBS.
  2. Rimuovere il surnatante di coltura ed estrarre il DNA genomico virale con il metodo di Hirt modificato descritto nella fase 1.3 quando la CPE si verifica entro 2-3 giorni.
  3. Digerire il DNA genomico dell'adenovirus ricombinante con gli enzimi indicati e analizzarlo su elettroforesi su gel di agarosio. Il plasmide adenovirale ricombinante è servito come controllo.

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Risultati

La strategia per la costruzione di un clone infettivo di HAdV-7 è mostrata in Figura 1 e Figura 2. Due plasmidi cloni infettivi sono stati selezionati casualmente e identificati rispettivamente da BstZ17 I, BamH I ed EcoR V. I risultati hanno mostrato che i frammenti erano coerenti con le dimensioni previste (Figura 2A), indicando che i plasmidi erano costruiti correttamente. I focolai di cometa so...

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Discussione

Diversi adenovirus hanno vari tropismi tissutali e la prevalenza dell'immunità preesistente dell'ospite contro diversi adenovirus può fluttuare intensamente negli esseri umani24, il che attira l'interesse nella costruzione di nuovi vettori adenovirali per la terapia genica o lo sviluppo di vaccini. Tuttavia, la creazione di un nuovo sistema di vettori adenovirali rimane ingombrante per i laboratori generici di biologia molecolare.

Qui...

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Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Riconoscimenti

Questa ricerca è stata finanziata dalla Beijing Natural Science Foundation (7204258), dalla National Natural Science Foundation of China (82161138001, 82072266), dal CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026) e dalla ricerca e dall'applicazione sulla tracciabilità molecolare di agenti patogeni respiratori essenziali a Pechino, dalla Capital Health Development and Research of Special (2021-1G-3012).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL polypropylene microcentrifuge TubeAxygenMCT-150-CStorage of virus
15 mL polypropylene centrifuge tubesCorning430790Storage of virus
150 mm TC-treated culture dishesCorning430599Growth of HEK29E cells
20 K MWCO dialysis cassetteThermoFisher Scientific66005Dialysis of virus
Acetic acidAmresco714Extraction of DNA
Afl IINEBR0520Digestion
AgaroseTakara5260Electrophoresis
Age INEBR0552Digestion
Asc INEBR0558Digestion
BamH INEBR0136Digestion
Benzonase NucleaseSigmaE8263-25KUPurification of virus
BsrG INEBR0575Digestion
Cell lifterCorning3008Scrape off the cells 
CsClSigmaC3032Purification of virus
DNA gel recovery kitZymoD4045Recovery of DNA
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)CytivaSH30022.01HEK293 cells medium
E.coli TOP10 competent cellsTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.CB-104Transformation of assembly product
EcoR VNEBR3195Digestion
EDTAThermo Fisher ScientificR3104Extraction of DNA
Fetal bovine serum (FBS)CytivaSV30208.02HEK293 cells culture
Genomic DNA Clean and concentrator kitZymoD4065Purification of DNA
GlycerolShanghai Macklin Biochemical Co., LtdG810575Dialysis of virus
HEK293 cellsATCCCRL-1573Amplification of virus
High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0491PCR
Hind IIINEBR3104Digestion
Kanamycin sulfateAmresco408Selection of plasmid
Kpn INEBR3142Digestion
Lambda/HindIII DNA markerTakara3403Electrophoresis
LB brothBD240230LB plate for bacteria
LB mediumSolarbio Life ScienceL1010Medium for bacteria
MgCl2Sigma63068Dialysis of virus
MicrocentrifugeThermo Fisher ScientificSorvall Legend Micro 21RExtraction of DNA
NaClSigmaS5886Dialysis of virus
Nde INEBR0111Digestion
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621DNA assembly
Nhe INEBR0131Digestion
Phosphate Buffered SalineCytivaSH30256.01Washing of cells
PipetteThermo Fisher ScientificMatrixAspirate the medium
Plasmid Maxprep KitVigorous Biotechnology Beijing Co., Ltd.N001Extraction of DNA
Plasmid Miniprep KitTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.DP103Extraction of DNA
Pme INEBR0560Digestion
Potassium acetateAmresco698Extraction of DNA
Protease KThermo Fisher ScientificAM2542Extraction of DNA
pShuttle-CMVStratagene240007PCR template
RNaseBeyotimeD7089Extraction of DNA
Sal INEBR0138Digestion
Sbf INEBR3642Digestion
SDSAmresco227Extraction of DNA
Swinging-bucket rotorHITACHIS52STPurification of virus
T-25 cell flaskCorning430639Growth of HEK29E cells
T-75 cell flaskCorning430641Growth of HEK29E cells
Transfection reagentPolyplus-transfection114-15Transfection
Transmission electron microscopeFEITECNAI 12Obsevation of virus
Tris-HClAmresco234Dialysis of virus
UltracentrifugeHITACHIHimac CS120GXIIPurification of virus

Riferimenti

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