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摘要

本研究构建了人腺病毒 7 型 （HAdV-7） 的感染性克隆，并通过修饰感染性克隆建立了 E3 缺失的 HAdV-7 载体系统。此处使用的这种策略可以推广为从其他野生型腺病毒制备基因转移载体。

摘要

腺病毒载体被用作基因治疗中的基因转移工具已有三十多年的历史。在这里，我们介绍了一种通过使用 DNA 组装方法纵野生型 HAdV-7 的基因组 DNA 来构建腺病毒载体的方案。首先，通过将病毒基因组 DNA 与质粒骨架的 PCR 产物融合，通过 DNA 组装产生 HAdV-7 的感染性克隆 pKan-Ad7，该质粒骨架由卡那霉素抗性基因和复制起点 （Kan-Ori） 组成。这是通过设计一对 PCR 引物来完成的，该引物在 5' 端包含 HAdV-7 反向末端重复序列 （ITR） 末端序列的 ~25 个核苷酸，中间包含一个用于 HAdV-7 基因组的非切割限制性内切酶位点，以及一个用于 PCR 引发的模板特异性序列在 3' 端。其次，采用基于质粒的中间体策略，用感染性克隆中的转基因表达元件替换 E3 区域，以生成腺病毒载体。简而言之，用双切割限制性内切酶 Hpa I 消化 pKan-Ad7，并通过 Gibson 组装将含有 E3 区的片段连接到质粒骨架的另一个 PCR 产物上，构建中间质粒 pKan-Ad7HpaI。为方便起见，采用限制性组装来指定限制性消化和组装相结合的质粒克隆方法。使用限制性组装，pKan-Ad7HpaI 中的 E3 基因被绿色荧光蛋白 （GFP） 表达盒取代，修饰的 E3 区从中间质粒中释放并恢复到感染性克隆中，生成腺病毒质粒 pKAd7-E3GFP。最后，pKAd7-E3GFP 通过 Pme I 消化线性化，用于转染 HEK293 包装细胞以挽救重组 HAdV-7 病毒。总而言之，这里介绍了一种基于 DNA 组装的策略，用于在分子生物学的一般实验室中构建腺病毒载体，而无需专门的材料和仪器。

引言

在过去的三十年里，重组腺病毒载体因其出色的生物学特性（如基因转导效率高、不整合到宿主基因组、纵病毒基因组和易于大规模生产）而被广泛用于疫苗开发和基因治疗 1,2,3,4 以及基础研究。

目前，最常用的腺病毒载体是基于人腺病毒 5 （HAdV-5） 构建的5,6。尽管 HAdV-5 载体介导的转导提供了令人鼓舞的结果，但临床前和临床应用揭示了几个缺点（例如，人类群体中预先存在的抗载体免疫力高，而在缺乏柯萨奇病毒和腺病毒受体 （CAR） 的细胞中转导效率低）。为了规避这些问题，人们非常感兴趣于构建基于其他人类或哺乳动物腺病毒类型的载体 3,7,8。

到目前为止，构建腺病毒载体最流行的方法是细菌中的同源重组5。这种细菌菌株必须表达重组酶，这会影响它们携带的质粒的稳定性或扩增。有些菌株甚至在市场上无法买到。最近，基于其他原理的方法，包括细菌人工染色体、直接克隆或直接 DNA 组装，已被用于生成腺病毒或重组腺病毒载体的感染性克隆 9,10,11,12。然而，这些方法对于在该领域经验不足的研究人员来说有些不友好。

2018 年，通过 Gibson 组装13 将病毒基因组与携带质粒骨架的 PCR 产物直接连接，简化了在实验室构建腺病毒感染性克隆的过程。之后，将限制性消化和 Gibson 组装的方法结合在一起，将转基因加载到现有的腺病毒质粒14、15、16、17、18 中。为方便起见，以下使用限制性组装来指限制性内切酶消化和 Gibson 组装的组合方法。通过使用限制性组装19 进一步开发从感染性克隆构建腺病毒载体的策略。限制性组装的本质是在 DNA 组装反应中尽可能多地包含从质粒中切除的片段，而短 PCR 产物用作质粒修饰的接头或贴片。同时，包含的片段数量尽可能少。这些努力反映了回报;可以最大限度地减少 PCR 或 DNA 组装引起的不需要的突变的可能性，并提高成功率。总之，在实验室 13,14,15,16,17,18,19 中建立了从野生型腺病毒到腺病毒载体的管道。

在这里，我们试图通过提供构建 HAdV-7 感染性克隆和 E3 缺失复制能力 HAdV-7 载体的示例来介绍这些方法。

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研究方案

注：腺病毒被归类为生物安全 2 级 （BSL-2）;使用病毒的所有步骤均在生物安全 2 级实验室中进行。野生型 HAdV-7 于 2017 年从北京儿童医院20 医院因急性呼吸道感染住院的 10 个月大婴儿的鼻咽抽吸物标本中分离出来。将病毒原液储存在 -80 °C 下。

1. HAdV-7 基因组 DNA 的提取

  1. 将 2.0 x 106 个 HEK293 细胞接种在一个 T-25 培养瓶中，该培养瓶含有 5 mL Dulbecco 改良的 Eagle 培养基 （DMEM） 和 10% 胎牛血清 （FBS），并在 37 °C 下在补充 5% CO2 的潮湿气氛中培养。细胞应达到 80%-90% 汇合，并在 18-24 小时内准备好感染。
  2. 用野生型 HAdV-7 接种细胞 2 小时。通过抽吸去除含病毒的培养基，并向细胞中加入 5 mL 含有 2% FBS 的新鲜 DMEM。
  3. 使用改良的 Hirt 方法提取病毒基因组 DNA21
    1. 在感染后 2 或 3 天内，当在 50%-90% 的细胞上观察到细胞病变效应 （CPE） 时，弃去培养上清液并用磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 冲洗细胞一次。
      注：细胞病变效应 （CPE） 定义为病毒感染的细胞聚集、膨胀、松散地附着或从培养瓶中分离成葡萄状簇22 的现象。
    2. 在含有 25 mM Tris-HCl、0.5 mM EDTA、50 μg/mL 蛋白酶 K 和 0.8% SDS （pH7.6） 的 1.0 mL 裂解缓冲液中，在冰上裂解培养瓶中的细胞 5 分钟。将裂解物转移至 1.5 mL 微量离心管中，并在 50 °C 的水浴中孵育管 30 分钟。
    3. 向试管中加入 120 μL 沉淀缓冲液。轻轻混合后，将试管再放在冰上 30 分钟。
      注：沉淀缓冲液由 3 M CsCl、1 M 乙酸钾和 0.67 M 乙酸组成。它将有助于离心后沉淀细胞碎片和细胞染色体 DNA，同时将病毒基因组保留在上清液中。
    4. 在 4 °C 下以 15,000 x g 的速度离心管 25 分钟，然后将上清液（约 1.1 mL）转移到 15 mL 聚丙烯管中。
    5. 向试管中加入 2.2 mL 冰冷的无水乙醇。轻轻混匀，让试管在冰上静置 15 分钟。在室温下以 2000 x g 离心 5 分钟。
    6. 小心吸出上清液，并用 800 μL 70% 乙醇洗涤沉淀物（病毒基因组 DNA）一次。在室温下以 15,000 x g 离心管 6 分钟。弃去上清液，将底部的 DNA 沉淀风干。不要过度干燥 DNA 沉淀，因为它可能会导致难以再溶解。
    7. 将沉淀溶解在 200 μL TE 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.0,0.1 mM EDTA）中，加入 1 μL RNase A （10 mg/mL），并将试管在 37 °C 下孵育 15 分钟。使用市售基因组 DNA 纯化和浓缩试剂盒纯化溶解的 DNA（参见 材料表）。
      注：使用实验室常用的方法定量病毒基因组 DNA。通常，在腺病毒感染的 HEK293 细胞的 T-25 培养瓶中可以获得 1-5 μg 基因组 DNA。

2. 通过 DNA 组装构建 HAdV-7 感染性克隆

  1. 设计 PCR 引物以扩增质粒骨架（图 1）。将 DNA 组装所需的重叠序列添加到 PCR 引物的 5' 末端。此外，在 HAdV-7 基因组的两端包括非切割限制性位点（例如，Pme I 位点），以帮助从感染性克隆中释放病毒基因组。
    注：含有抗生素抗性基因和复制起点的质粒骨架通过 PCR 扩增并与 HAdV-7 基因组融合。当使用线性化病毒基因组代替环状腺病毒质粒时，可以更高效地从包装细胞中拯救腺病毒。在考虑了上述因素后，如图 1 所示设计引物。
  2. 使用 pShuttle-CMV 作为模板，以 Ad7KanF1 和 Ad7KanR1 的引物（表 S1）进行 PCR 以扩增含有卡那霉素抗性基因 （Kan） 和 pBR322 起点 （Ori） 的片段 （Kan-Ori）。将PCR反应设置如下：在98°C下1个循环30秒，然后在98°C下变性8秒，在68°C下退火30秒，在72°C下延伸90秒，最后在98°C下变性25个循环8秒，在72°C下退火和延伸2分钟。
  3. 通过电泳在 1% 琼脂糖凝胶中运行 PCR 产物，并使用市售 DNA 凝胶回收试剂盒纯化片段。
  4. 将回收的 HAdV-7 的 Kan-Ori 和病毒基因组 DNA 添加到市售 DNA 组装预混液中。构建总体积为 20 μL 且载体与病毒基因组 DNA 的摩尔比为 1：2 的组装反应物。在 50 °C 下孵育 1 小时。
    注：将反应体积定为 20 μL，加入 1-3 μL 载体、7-9 μL 病毒基因组 DNA 和 10 μL DNA 组装预混液。
  5. 使用热休克技术，用 10 μL 组装产物转化化学感受态 大肠 杆菌菌株 TOP10 细胞。将转化混合物涂在含卡那霉素 （50 μg/mL） 的 Luria-Bertani （LB-Kan） 平板上。将板在 37 °C 下孵育至少 12 小时。
  6. 在 37 °C 下，将至少三个克隆分别接种在 5 mL LB-Kan 培养基中 12 小时，同时轻轻摇动 （200-250 rpm）。使用市售质粒小量制备试剂盒提取质粒 DNA。
  7. 使用限制性核酸内切酶消化质粒，然后用琼脂糖凝胶电泳检查 DNA 片段的大小（图 2A）。此外，通过测序确认融合位点。正确的组装质粒命名为 pKan-Ad7。
  8. 从正确的克隆中培养 100 mL 细菌培养物。使用市售质粒 Maxprep 试剂盒提取 maxi 质粒制备物。

3. 中间质粒 的计算机构建 和修饰

注意：通常应构建中间质粒，如何构建理想的中间质粒是关键步骤。设计中间质粒需要带有限制性内切酶模块的 DNA 分析软件，例如 pDRAW32（免费软件，可在 www.acaclone.com 获得）。

  1. 将 pKan-Ad7 的 DNA 序列导入 pDRAW32 以绘制质粒图谱。在地图上注释感兴趣的区域。对于 pKan-Ad7，E1 、 E3 区域和质粒骨架 （Kan-Ori） 被注释。
  2. 作 pDRAW32 程序。点击 个人设置 > 酶选择 首先，然后单击 最小/最大切割.在 Min 框中输入 1，在 Max 框中输入 2，然后勾选整个序列中前面的框。最后，单击 OK （ 确定 ） 在地图上显示独特的双切割限制性内切酶位点。
    注：通常，仅选择识别 6 bp 或更长序列的限制性内切酶。如图 3A 所示，17 种酶符合酶选择标准。
  3. 考虑 E3 区域两侧的第一个限制位点，因为 E3 计划进行修改。Hpa I、Sal I、Avr II-Mlu I 和 Spe I 满足要求。
    注意：对于本实验，选择 Hpa I，因为用它消化 pKan-Ad7 会产生携带 E3 区域的最短片段，而较小的中间质粒将使未来的修饰更容易。Sal I 位点的选择也有优点——这种中间质粒适用于 E1 和 E3 区域的修饰（图 S1）。
  4. 创建一个最终序列文件，显示中间质粒 pKan-Ad7HpaI 的两条 DNA 链。该虚拟序列可用作设计重叠引物的模板。
    1. 复制两个 Hpa I 限制性位点之间的序列，包括 E3 区域。对于后续组装，有必要在 Hpa I 限制性位点之外复制每个 ~20 bp 序列（Tm 等于或大于 48°C）（图 3C，重叠-Final 1 和重叠-Final2）。
    2. 在上述序列的两端添加 Pme I 的识别序列（图 3C，gtttaaac）。
    3. 在 Pme I 限制性位点之外添加含有抗生素抗性基因和复制起点（图 3C，Kan-Ori）的骨架质粒序列。
    4. 将最终序列导入 pDRAW32 以绘制质粒图。在地图上注释 E3 区域。
    5. 作 pDRAW32 程序。首先点击 个人设置 > 酶选择 ，然后点击 最小/最大切割.在 Min 和 Max 框中输入 1，然后在整个序列中勾选前面的框。最后单击 OK 以在地图上显示独特的限制性内切酶位点。可以看出，有很多独特的刀具可用于 E3 修改。
      注意：在本实验中，选择 BstZ17 I 和 Mlu I 来替代部分 E3。双切割器也很有用。例如，通过使用重叠延伸 PCR，可以选择双切割仪 Ssp I 和独特的切割仪 BssH II 来替换整个 E3 区域。
  5. 使用虚拟序列作为构建中间质粒的模板设计引物（图 3C）。
    注：为了缩短每个引物的长度，设计了四种引物。用 Ad7HpaIF1 和 Ad7HpaIR1 引物扩增的 PCR 产物将用作模板，以获得带有 Ad7HpaIF2 和 Ad7HpaIR2 引物的最终 PCR 片段（图 3C）。

4. HEK293 细胞中感染性重组腺病毒的拯救

注意：本文生成的三种腺病毒均按照以下方案进行挽救。

  1. 在 37 °C 下用 2 μL Pme I 消化 10 μg 重组腺病毒质粒 5 小时，总体积为 100 μL，以线性化质粒。在 0.8% 琼脂糖凝胶上检查 1 μL 消化的 DNA。消化应产生腺病毒基因组的 ~34 kb 片段和 Kan-Ori 的 ~2.5 kb 质粒骨架。
  2. 使用基因组 DNA Clean and Concentrator 试剂盒纯化残余线性化腺病毒质粒。
  3. 在 DMEM 加 10% FBS 中培养 HEK293 细胞。转染前 1 天将 HEK293 细胞（2 x 106 个细胞）接种到 T-25 培养瓶中，以便它们在第二天达到 70%-80% 的汇合度。使用 5 μg Pme I 消化的腺病毒质粒，使用市售转染试剂转染 HEK293 细胞。
    注：转染细胞的培养基应每 3 天更换一次。
  4. 当彗星病灶形成时，每天检查细胞，收集细胞，并在 15 mL 聚丙烯管中培养培养基（图 2B，表明病毒复制）。
  5. 通过三个冻融循环裂解细胞。在室温下以 1200 x g 离心 12 分钟后，收集上清液并将其储存在 -80 °C 以用于后续病毒繁殖。
    注意：当重组腺病毒表达 GFP 或其他荧光蛋白时，更容易识别病毒是否被成功挽救，因为可以在荧光显微镜下直观地观察到荧光蛋白阳性细胞形成的病灶。

5. 构建 E3 缺失的 HAdV-7 基因组质粒

注：HAdV-7 的基因组长度为 35,239 bp，E3 区域位于基因组的 27,354 bp 和 31,057 bp 之间。要构建中间质粒，请在感染性克隆质粒上找到一个具有两个切割位点的核酸内切酶，或在质粒上找到两个具有单个切割位点的核酸内切酶。有 Hpa I、Sal I 或 Avr II 和 Mlu I 可用。BstZ17 I （28,312 bp） 和 Mlu I （30,757 bp） 之间的序列将被删除并替换为 CMV-GFP-PA 盒或 CMV-mCherry-PA 盒。

  1. 用 Hpa I 消化 600 ng pKan-Ad7。凝胶电泳后，使用 DNA 凝胶回收试剂盒分别纯化大片段 pKAd7-HpaI-FL （~30 kb） 和小片段 pKAd7-HpaI-FS （~7 kb）。将pKAd7-HpaI-FL储存在-20°C。
  2. 使用 pShuttle-CMV 作为模板，用 Ad7HpaIF1 和 Ad7HpaIR1 的引物（表 S1）通过 PCR 扩增含有 Kan 和 Ori 的片段。回收并稀释 PCR 产物 （2541 bp），用作第二轮 PCR 反应的模板，用 Ad7HpaIF2 和 Ad7HpaIR2 的引物扩增 Kan-Ori2。
    1. 通过电泳在 1% 琼脂糖凝胶中分离后纯化 PCR 产物 （2584 bp）。将PCR反应设置如下：在98°C下循环30秒，然后在98°C下变性30秒，在72°C下退火和延伸2分钟。
      注：Kan-Ori2 的中心部分是含有 Kan 和 Ori 的片段，然后是小片段 pKAd7-HpaI-FS 中不存在的独特限制性核酸内切酶的序列（例如，Pme I），以及与大片段 pKAd7-HpaI-FL 的重叠区域;最外层序列是与小片段 pKAd7-HpaI-FS 的重叠区域。
  3. 在步骤 5.1 中将 PCR 产物 Kan-Ori2 和回收的 pKAd7-HpaI-FS 添加到 DNA 组装预混液中。在 50 °C 下孵育 1 小时。请遵循步骤 2.4 - 2.6。正确的质粒命名为 pKan-Ad7HpaI （~10 kb）。
  4. 使用 pShuttle-GFP23 作为模板，以 Ad7E3GFPF1 和 Ad7E3GFPR1 引物扩增含有 CMV 启动子、GFP CDS 和 SV40 polyA 信号 （PA） 的 CMV-GFP-PA 片段 （~1.7 kb）（表 S1）。通过电泳在 1% 琼脂糖凝胶中分离后纯化 PCR 产物 （1650 bp）。
    注：引物中应包含可与 BstZ17 I 和 Mlu I 消化的 pKan-Ad7HpaI 组装的重叠区域，并将质粒 pKan-Ad7 中不存在的独特限制性位点（例如，Sbf I）添加到引物中，以便进一步限制性组装。
  5. 用 BstZ17 I 和 Mlu I 消化 300 ng pKan-Ad7HpaI。通过电泳在 1% 琼脂糖凝胶中分离后，纯化 7.3 kb 的片段（大部分 E3 区域被删除）。将回收的 7.3 kb 片段和回收的 CMV-GFP-PA 片段 （~1.6 kb） 添加到 DNA 组装预混液中。按照步骤 2.4-2.6 进行作。正确的质粒命名为 pKAd7-E3GFP （~9 kb）。
    注意：BstZ17 I 和 Mlu I 之间的所有序列都属于 E3 区域。
  6. 用 Pme I 消化 300 ng pKAd7-HE3GFP。凝胶电泳后，使用 DNA 凝胶回收试剂盒纯化大片段 （~6.4 kb）。将步骤 5.1 中回收的纯化片段和 pKAd7-HpaI-FL 添加到 DNA 组装预混液中。在 50 °C 下孵育 1 小时。请遵循步骤 2.4 - 2.6。正确的质粒命名为 pKAd7-E3GFP。
  7. 如第 3 节所述，用 Pme I 线性化 pKAd7-E3GFP 转染 HEK293 细胞。获救的腺病毒被命名为 Ad7-E3GFP。
  8. 以 pKFAV4-CX19A 为模板，以 Ad7E3CHEF1 和 Ad7E3CHER1 的引物扩增含有 CMV 启动子、mCherry CDS 和 SV40 polyA 信号的 CMV-mCherry-PA 片段 （~1.6 kb）。通过电泳在 1% 琼脂糖凝胶中分离后纯化 PCR 产物。
  9. 用 Sbf I 消化 600 ng pKAd7-E3GFP，并纯化 ~35 kb 的片段。将 35 kb 片段和回收的 CMV-mCherry-PA 片段添加到 DNA 组装预混液中。在 50 °C 下孵育 1 小时。按照步骤 2.4-2.6 进行作。正确的质粒命名为 pKAd7-E3CHE。
  10. 如第 3 节所述，用 Pme I 线性化 pKAd7-E3CHE 转染 HEK293 细胞。获救的腺病毒被命名为 Ad7-E3CHE。

6. 重组腺病毒在 HEK293 细胞中的扩增和纯化

  1. 用腺病毒接种在 8 个 150 mm 直径的 TC 处理培养皿中生长的 80%-90% 汇合单层 HEK293 细胞。在37°C下温和搅拌孵育2小时。用 25 mL 含有 2% FBS 的 DMEM 替换上清液。
  2. 将细胞在 37 °C 下孵育 2-3 天。
    1. 当 CPE 影响大多数细胞时，丢弃 8 个 150 mm 直径培养皿的大部分上清液。使用细胞提升器将感染的细胞收获，最终洗脱体积为 ~6.0 mL 到 15 mL 聚丙烯管中。
    2. 通过三个冻融循环破坏细胞以释放病毒。在室温下以 1200 x g 离心 12 分钟，以澄清裂解物。收集含有病毒的上清液。
  3. 向上清液中加入 MgCl2 （0.1 mM） 和苯并酶核酸酶 （50 U/mL）。在 37 °C 下轻轻涡旋 40 分钟。 向上清液中加入NaCl（600mM），并在37°C下轻轻涡旋40分钟。 在室温下以 1200 x g 离心 12 分钟。收集含有病毒的上清液进行纯化。
  4. 用 10 mM Tris-HCl 制备不同浓度的 1.35 g/mL、1.30 g/mL 和 1.25 g/mL 的氯化铯 （CsCl）。
    1. 使用移液管将 0.8 mL 1.35 g/mL CsCl 溶液添加到 5.1 mL 超透明管的底部，然后依次在第一种溶液上缓慢加入 0.8 mL 1.30 g/mL CsCl 溶液和 0.8 mL 1.25 g/mL CsCl 溶液。
    2. 最后，小心地将步骤 6.3 中收集的 ~2.5 mL 上清液覆盖在 1.25 g/mL CsCl 溶液的顶部，并使用 10 mM Tris-HCl 将试管从顶部填充至 2-3 mm。
  5. 在水平转子中以 200,000 x g 和 8 °C 离心 2 小时，缓慢加速和减速，以分离完整的病毒颗粒和有缺陷的病毒颗粒。
    注：离心后，在 CsCl 溶液中可以清楚地看到几个白色条带。
  6. 使用移液管小心去除空颗粒的条带和细胞碎片层，并使用 2 mL 注射器收集含有成熟病毒的最低条带。
  7. 将收集的病毒悬液转移到 20 K MWCO 透析盒中，并在含有 10 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1 mM MgCl2 和 2% 甘油 （pH 8.0） 的透析缓冲液中透析，在 4 °C 下过夜。
    1. 第二天更换含有 10 mM Tris-Cl、150 mM NaCl、1 mM MgCl2 和 5% 甘油 （pH 8.0） 的透析缓冲液，并在 4 °C 下透析 5 小时。
    2. 使用 2 mL 注射器收集透析的病毒颗粒。制备多个所需小体积 （20-200 μL） 的等分试样，并将纯化的病毒储存在 -80 °C。
      注：纯化病毒的颗粒滴度可通过测量基因组 DNA 的含量来确定，并且可以通过用有限稀释测定法计数 GFP 阳性细胞来确定 HEK293 细胞的感染性滴度。

7. 通过限制性内切酶消化鉴定重组腺病毒基因组

  1. 用重组腺病毒感染在一个 T-25 培养瓶中生长的 80%-90% 汇合单层 HEK293 细胞。在 37 °C 下孵育 2 小时。 用含有 2% FBS 的新鲜 DMEM 替换培养基。
  2. 当 CPE 在 2-3 天内发生时，去除培养上清液并使用步骤 1.3 中描述的改良 Hirt 方法提取病毒基因组 DNA。
  3. 用指定的酶消化重组腺病毒的基因组 DNA，并在琼脂糖凝胶电泳上进行分析。重组腺病毒质粒用作对照。

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结果

构建 HAdV-7 感染性克隆的策略如图 1 和 图 2 所示。随机选择两个感染性克隆质粒，分别通过 BstZ17 I 、 BamH I 和 EcoR V 进行鉴定。结果表明，片段与预期大小一致（图 2A），表明质粒构建正确。将 Pme I 线性化质粒转染到 HEK293 细胞中 12 天后，可以在细胞中看到彗星病灶（图 2B），表明...

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讨论

不同的腺病毒具有不同的组织嗜性，宿主对不同腺病毒的预先存在的免疫力的流行率在人类中可以剧烈波动24，这引起了构建用于基因治疗或疫苗开发的新型腺病毒载体的兴趣。然而，对于分子生物学的通用实验室来说，建立新的腺病毒载体系统仍然很麻烦。

在这里，我们介绍了一种通过使用限制性消化和 Gibson 组装技术从野生型腺...

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披露声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究由北京市自然科学基金 （7204258）、国家自然科学基金 （82161138001， 82072266）、中国医学科学院医学创新基金 （2019-I2M-5-026） 资助，首都卫生发展与研究专项 （2021-1G-3012） 资助北京市必需呼吸道病原体分子示踪研究与应用。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL polypropylene microcentrifuge TubeAxygenMCT-150-CStorage of virus
15 mL polypropylene centrifuge tubesCorning430790Storage of virus
150 mm TC-treated culture dishesCorning430599Growth of HEK29E cells
20 K MWCO dialysis cassetteThermoFisher Scientific66005Dialysis of virus
Acetic acidAmresco714Extraction of DNA
Afl IINEBR0520Digestion
AgaroseTakara5260Electrophoresis
Age INEBR0552Digestion
Asc INEBR0558Digestion
BamH INEBR0136Digestion
Benzonase NucleaseSigmaE8263-25KUPurification of virus
BsrG INEBR0575Digestion
Cell lifterCorning3008Scrape off the cells 
CsClSigmaC3032Purification of virus
DNA gel recovery kitZymoD4045Recovery of DNA
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)CytivaSH30022.01HEK293 cells medium
E.coli TOP10 competent cellsTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.CB-104Transformation of assembly product
EcoR VNEBR3195Digestion
EDTAThermo Fisher ScientificR3104Extraction of DNA
Fetal bovine serum (FBS)CytivaSV30208.02HEK293 cells culture
Genomic DNA Clean and concentrator kitZymoD4065Purification of DNA
GlycerolShanghai Macklin Biochemical Co., LtdG810575Dialysis of virus
HEK293 cellsATCCCRL-1573Amplification of virus
High-Fidelity DNA PolymeraseNEBM0491PCR
Hind IIINEBR3104Digestion
Kanamycin sulfateAmresco408Selection of plasmid
Kpn INEBR3142Digestion
Lambda/HindIII DNA markerTakara3403Electrophoresis
LB brothBD240230LB plate for bacteria
LB mediumSolarbio Life ScienceL1010Medium for bacteria
MgCl2Sigma63068Dialysis of virus
MicrocentrifugeThermo Fisher ScientificSorvall Legend Micro 21RExtraction of DNA
NaClSigmaS5886Dialysis of virus
Nde INEBR0111Digestion
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNEBE2621DNA assembly
Nhe INEBR0131Digestion
Phosphate Buffered SalineCytivaSH30256.01Washing of cells
PipetteThermo Fisher ScientificMatrixAspirate the medium
Plasmid Maxprep KitVigorous Biotechnology Beijing Co., Ltd.N001Extraction of DNA
Plasmid Miniprep KitTIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD.DP103Extraction of DNA
Pme INEBR0560Digestion
Potassium acetateAmresco698Extraction of DNA
Protease KThermo Fisher ScientificAM2542Extraction of DNA
pShuttle-CMVStratagene240007PCR template
RNaseBeyotimeD7089Extraction of DNA
Sal INEBR0138Digestion
Sbf INEBR3642Digestion
SDSAmresco227Extraction of DNA
Swinging-bucket rotorHITACHIS52STPurification of virus
T-25 cell flaskCorning430639Growth of HEK29E cells
T-75 cell flaskCorning430641Growth of HEK29E cells
Transfection reagentPolyplus-transfection114-15Transfection
Transmission electron microscopeFEITECNAI 12Obsevation of virus
Tris-HClAmresco234Dialysis of virus
UltracentrifugeHITACHIHimac CS120GXIIPurification of virus

参考文献

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