تحليل ضعف انقباض القلب و Ca2+ عابر في الخلايا العضلية القوارض

Summary

يتم تقديم مجموعة من البروتوكولات التي تصف قياس وظيفة الانقباض عن طريق الكشف عن طول القطعة العضلية جنبا إلى جنب مع قياس الكالسيوم (Ca²⁺) العابر في الخلايا العضلية للفئران المعزولة. كما يتم تضمين تطبيق هذا النهج للدراسات في النماذج الحيوانية لفشل القلب.

Abstract

غالبا ما يتم تحليل ضعف الانقباض و Ca²⁺ العابر على المستوى الخلوي كجزء من تقييم شامل للإصابة الناجمة عن القلب و / أو إعادة البناء. يستخدم أحد الأساليب لتقييم هذه التعديلات الوظيفية تقصير غير محمل وتحليلات عابرة Ca²⁺ في الخلايا العضلية القلبية الأولية للبالغين. لهذا النهج ، يتم عزل الخلايا العضلية البالغة عن طريق هضم الكولاجيناز ، وجعلها متسامحة مع Ca²⁺ ، ثم تلتصق بأغطية مغلفة باللامينين ، تليها سرعة كهربائية في وسائط خالية من المصل. يستخدم البروتوكول العام الخلايا العضلية القلبية للفئران البالغة ولكن يمكن تعديلها بسهولة للخلايا العضلية الأولية من الأنواع الأخرى. يمكن مقارنة التغيرات الوظيفية في الخلايا العضلية من القلوب المصابة بالخلايا العضلية الوهمية و / أو العلاجات العلاجية في المختبر . تتضمن المنهجية العناصر الأساسية اللازمة لسرعة الخلايا العضلية ، جنبا إلى جنب مع غرفة الخلية ومكونات المنصة. يتضمن البروتوكول التفصيلي لهذا النهج خطوات قياس التقصير غير المحمل عن طريق الكشف عن طول القطعة العضلية وعابرات Ca²⁺ الخلوية المقاسة بمؤشر القياس النسبي Fura-2 AM ، وكذلك لتحليل البيانات الأولية.

Introduction

غالبا ما يتطلب تحليل وظيفة مضخة القلب مجموعة من الأساليب لاكتساب رؤية كافية ، خاصة بالنسبة للنماذج الحيوانية لفشل القلب (HF). يوفر تخطيط صدى القلب أو قياسات الدورة الدموية نظرة ثاقبة على الخلل الوظيفي القلبي في الجسم الحي ¹ ، بينما غالبا ما يتم استخدام الأساليب في المختبر لتحديد ما إذا كان الخلل الوظيفي ينشأ عن التغيرات في الخيوط العضلية و / أو Ca²⁺ العابر المسؤول عن إثارة الاقتران ، أو جهد الفعل ، مع وظيفة انقباض (على سبيل المثال ، اقتران الإثارة والانكماش [E-C]). توفر الأساليب في المختبر أيضا فرصة لفحص الاستجابة الوظيفية للهرمونات العصبية ، والتغيرات الجينية التي يسببها النواقل ، بالإضافة إلى العوامل العلاجية المحتملة² قبل متابعة استراتيجيات العلاج المكلفة و / أو الشاقة في الجسم الحي.

تتوفر عدة طرق للتحقيق في وظيفة الانقباض في المختبر ، بما في ذلك قياسات القوة في الترابيق السليم 3 أو الخلايا العضلية⁴ ، بالإضافة إلى التقصير غير المحمل و Ca²⁺ العابر في الخلايا^{العضلية} السليمة في وجود وغياب HF ^5,6. يركز كل من هذه الأساليب على وظيفة انقباض الخلايا العضلية القلبية ، المسؤولة مباشرة عن وظيفة مضخة القلب ^2,7. ومع ذلك ، غالبا ما يتم إجراء تحليل كل من الانكماش واقتران E-C معا عن طريق قياس تقصير طول العضلات و Ca 2+ عابرة في الخلايا العضلية البالغة المعزولة والمتسامحة مع Ca²⁺. يستخدم المختبر بروتوكولا منشورا مفصلا لعزل الخلايا العضلية من قلوب الفئران لهذه الخطوة⁸.

يساهم كل من Ca²⁺ العابر والخيوط العضلية في تقصير وإعادة إطالة الخلايا العضلية السليمة ويمكن أن يساهم في اختلال وظيفي مقلص ^2,7. وبالتالي ، يوصى بهذا النهج عندما يتطلب التحليل الوظيفي في المختبر خلية عضلية سليمة تحتوي على آلات ركوب الدراجات Ca²⁺ بالإضافة إلى خيوط العضلات. على سبيل المثال ، الخلايا العضلية المعزولة السليمة مرغوبة لدراسة وظيفة الانقباض بعد تعديل الخيوط العضلية أو وظيفة ركوب الدراجات Ca²⁺ عبر نقل الجينات⁹. بالإضافة إلى ذلك ، يقترح نهج الخلايا العضلية السليمة لتحليل التأثير الوظيفي للهرمونات العصبية عند دراسة تأثير مسارات إشارات المصب الثاني و / أو الاستجابة للعوامل العلاجية². غالبا ما يتم إجراء قياس بديل للقوة المعتمدة على الحمل في الخلايا العضلية المفردة بعد نفاذية الغشاء (أو السلخ) في درجات حرارة منخفضة (≤15 درجة مئوية) لإزالة المساهمة العابرة Ca²⁺ والتركيز على وظيفة الخيوط العضلية¹⁰. يعد قياس القوة المعتمدة على الحمل بالإضافة إلى Ca²⁺ العابرة في الخلايا العضلية السليمة أمرا نادرا إلى حد كبير بسبب التحدي المعقد والتقني للنهج¹¹ ، خاصة عند الحاجة إلى إنتاجية أعلى ، مثل قياس الاستجابات لإشارات الهرمونات العصبية أو كشاشة للعوامل العلاجية. يتغلب تحليل التربيق القلبي على هذه التحديات التقنية ولكنه قد يتأثر أيضا بالخلايا غير العضلية والتليف و / أو إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية². يتطلب كل نهج من الأساليب الموضحة أعلاه إعدادا يحتوي على خلايا عضلية بالغة لأن الخلايا العضلية الوليدية والخلايا العضلية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) لا تعبر بعد عن المكمل الكامل لبروتينات الخيوط العضلية البالغة وعادة ما تفتقر إلى مستوى تنظيم الخيوط العضلية الموجودة في الخلية العضلية البالغة على شكل قضيب². حتى الآن ، تشير الأدلة في iPSCs إلى أن الانتقال الكامل إلى الأشكال المتساوية للبالغين يتجاوز أكثر من 134 يوما في الثقافة¹².

بالنظر إلى تركيز هذه المجموعة على HF ، تتضمن البروتوكولات مناهج وتحليلات للتمييز بين وظيفة الانقباض في الخلايا العضلية السليمة الفاشلة مقابل الخلايا العضلية السليمة غير الفاشلة. يتم تقديم أمثلة تمثيلية من الخلايا العضلية للفئران التي تمت دراستها بعد 18-20 أسبوعا من التضيق فوق الكلوي ، الموصوف سابقا^5،13. ثم يتم إجراء مقارنات مع الخلايا العضلية من الفئران المعالجة بالخداع.

يتم استخدام البروتوكول ومنصة التصوير الموصوفة هنا لتحليل ومراقبة التغيرات في التقصير و Ca²⁺ العابرة في الخلايا العضلية القلبية على شكل قضيب أثناء تطور HF. لهذا التحليل ، يتم طلاء الخلايا العضلية على شكل قضيب 2 × 10⁴ Ca 2⁺ على شكل قضيب على أغطية زجاجية مطلية بالصفيحة مقاس 22 مم² (CSs) ويتم زراعتها طوال الليل ، كما هو موضح سابقا⁸. يتم توفير المكونات المجمعة لمنصة التصوير هذه ، جنبا إلى جنب مع الوسائط والمخازن المؤقتة المستخدمة للتصوير الأمثل ، في جدول المواد. يتم أيضا توفير دليل لتحليل البيانات باستخدام برنامج والنتائج التمثيلية هنا. يتم تقسيم البروتوكول العام إلى أقسام فرعية منفصلة ، حيث تركز الأقسام الثلاثة الأولى على الخلايا العضلية للفئران المعزولة وتحليل البيانات ، تليها تجارب Ca²⁺ الخلوية العابرة وتحليل البيانات في الخلايا العضلية.

Protocol

اتبعت الدراسات التي أجريت على القوارض سياسة خدمة الصحة العامة بشأن الرعاية الإنسانية واستخدام المختبر وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة ميشيغان. في هذه الدراسة ، تم عزل الخلايا العضلية من الفئران Sprague-Dawley و F344BN البالغة من العمر 3-34 شهرا والتي تزن ≥ 200 جم⁵. تم استخدام كل من معدلات الذكور والإناث.

1. سرعة الخلايا العضلية لدراسات وظيفة انقباض

1. اصنع وسائط جديدة قائمة على M199 لكل مجموعة من الخلايا العضلية المعزولة (جدول المواد). 1 يوم قبل السرعة ، لوحة 2 × 10⁴ Ca 2⁺ - خلايا عضلية على شكل قضيب على 22 مم² أغطية زجاجية مطلية باللامينين (CSs) ، كما هو موضح سابقا⁸.
2. لتحضير الغرف ، انقع كل غرفة في مبيض 10٪ لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، اغسل الغرف بماء الصنبور الجاري لمدة 30-45 دقيقة ، متبوعا بالماء المقطر الذي يتم استبداله كل 5 دقائق لمدة 30 دقيقة ، يليه الماء منزوع الأيونات الذي يتم استبداله كل 5 دقائق لمدة 30 دقيقة ، والشطف النهائي بالماء منزوع الأيونات.
3. جفف الغرف على سطح نظيف لمدة 20-30 دقيقة (الشكل التكميلي 1A-C). بعد ذلك ، عالج الأشعة فوق البنفسجية الغرف في خزانة السلامة الحيوية لمدة 5 دقائق في كل اتجاه (المجموع = 20 دقيقة). ليست هناك حاجة لهذه الخطوة للغرف المعقمة مسبقا.
   تنبيه: اترك المنطقة لتقليل التعرض للأشعة فوق البنفسجية.
4. قم بإزالة الغطاء من الغرفة ، وأضف 3 مل من الوسائط القائمة على M199 (انظر جدول المواد) إلى كل بئر (الشكل التكميلي 1B) ، واستبدل الغطاء ، وقم بتسخين الغرفة مسبقا في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 و 20٪ O₂.
5. تعقيم ملقط في معقم حبة ساخنة على حرارة 250 درجة مئوية لمدة 20-25 ثانية. انقل غرفة التحفيز المسخنة مسبقا من الحاضنة إلى خزانة السلامة البيولوجية.
6. انقل كل غطاء (CS) يحتوي على خلايا عضلية قلبية إلى آبار فردية في غرفة التحفيز باستخدام ملقط معقم. انقل CSs أربعة في كل مرة ، متبوعا بالتسخين لمدة 10 دقائق قبل نقل CSs الأربعة المتبقية للحفاظ على درجة حرارة الوسائط.
7. قم بتوصيل رافعات الموز بغرفة التحفيز من أحد طرفيها (الشكل التكميلي 1C) وبالمحفز على الطرف الآخر (الشكل التكميلي 1D).
8. اضبط تردد المحفز على 0.2 هرتز واضبط الجهد (~ 12 فولت) لتحقيق الانكماش في ~ 10٪ -20٪ من جميع الخلايا العضلية القلبية على شكل قضيب داخل البئر. لتحديد عدد الخلايا العضلية المتعاقدة، ضع الغرفة تحت مجهر مقلوب مع تكبير من 4x إلى 10x.
9. ضع غرفة التحفيز في حاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂ (الشكل التكميلي 1E). قم بتغيير الوسائط كل 12 ساعة باستخدام وسائط مسخنة مسبقا في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO₂ لمدة 20-25 دقيقة. استمر في التحفيز الكهربائي لمدة تصل إلى 3 أيام مع تغيير الوسائط كل 12 ساعة.

2. تحليل وظيفة انقباض الخلايا العضلية القلبية الفئران البالغة

1. سخن عبوة جل ووسائط في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة قبل التجربة.
2. قم بتشغيل مكونات منصة وظيفة الانقباض المدرجة في جدول المواد والموضحة في الشكل التكميلي 2 ، مع إيلاء اهتمام خاص للمكونات الرئيسية ، والتي تشمل جدولا مضادا للاهتزاز (الشكل التكميلي 2A-1) مع مجهر مقلوب مع مرشح أحمر غامق (590 نانومتر) (الشكل التكميلي 2A-2,3) وكاميرا CCD (الشكل التكميلي 2A-4) متصلة بوحدة تحكم CCD (الشكل التكميلي 2A-5 و الشكل التكميلي 2C-5) ومتكامل مع جهاز كمبيوتر (الشكل التكميلي 2B-14).
3. تجميع الأنابيب في المضخة التمعجية (الشكل التكميلي 2A-8 ؛ الشكل التكميلي 2A-8) ، انقل عبوة الجل المسخنة مسبقا إلى حامل الأنبوب (الشكل التكميلي 2A-9) ، وقم بتشغيل الفراغ (الشكل التكميلي 2A-11) والطاقة إلى محفز الخلية (الشكل التكميلي 2B-13).
4. ضع أنبوبا سعة 50 مل مع وسائط في حامل الأنبوب المعزول (الشكل التكميلي 2A-9) وابدأ التروية عند ~ 0.5 مل / دقيقة من خلال أنبوب المضخة التمعجية (الشكل التكميلي 2E-8).
5. أضف كمية صغيرة من الوسائط المسخنة مسبقا إلى قارب وزن صغير (~ 2 مل). انقل CS واحدا يحتوي على خلايا عضلية من غرفة التحفيز إلى قارب الوزن. أعد غرفة التحفيز إلى 37 درجة مئوية في حاضنة CO₂ بنسبة 5٪.
6. قم بإزالة CS من وعاء الوزن وامسح الجانب السفلي برفق. انقل CS إلى غرفة CS مدهونة حديثا (الشكل التكميلي 2A ، F-10 ؛ السهم الأسود) وأضف قطرة من الوسائط برفق (~ 200 ميكرولتر) إلى CS.
7. ضع حامل قطب كهربائي بلاتيني فوق CS (الشكل التكميلي 2F ؛ سهم رمادي) وضع CS جديدا فوق الجزء العلوي باستخدام ملقط. ضع حاملا علويا (الشكل التكميلي 2F ؛ السهم الأبيض) فوق شطيرة CS ثم قم بتثبيت اثنين أو أربعة مسامير # 0 ذات رأس عموم لإنهاء تجميع الغرفة.
8. بمجرد وجود الوسائط في جميع أنحاء أنبوب المضخة ، قم بتوصيل الأنبوب بالتسخين المسبق ، ثم قم بتوصيل التسخين الأولي بغرفة CS المجمعة في الخطوة 2.7. ابدأ التروية بمعدل 0.5 مل / دقيقة وضع منديل منديل أسفل الحجرة للتأكد من عدم وجود تسرب.
9. ضع حجرة CS في محول المسرح. يتم جمع الوسائط المتدفقة في الطرف الآخر من الغرفة مع أنابيب متصلة بنظام فراغ. قم بتشغيل نظام التسخين (الشكل التكميلي 2A ، D-7) وقم بموازنة الغرفة والهدف والتسخين المسبق لمدة ~ 5-10 دقائق لتحقيق درجة حرارة وسائط ثابتة تبلغ 37 درجة مئوية. تصور الخلايا العضلية مع هدف الغمر في الماء 40x على المجهر خلال وقت التوازن هذا.
10. قم بتنشيط محفز السرعة (الشكل التكميلي 2B-13) عن طريق ضبط الجهد على 1.5x الإعداد اللازم لتقلص 80٪ من الخلايا على شكل قضيب ، والتي عادة ما تكون 35-40 فولت. اضبط تردد التحفيز على 0.2 هرتز لتحسين وظيفة الانقباض وبقاء الخلايا العضلية.
11. جمع آثار تقصير مقلص وإعادة إطالة من الخلايا العضلية المنتشرة والمتقلبة باستمرار. لجمع قياسات التقصير ، استخدم كاميرا CCD (الشكل التكميلي 2A-4) متصلة بوحدة تحكم CCD (الشكل التكميلي 2B-5 ، C) وجهاز كمبيوتر مخصص مع لوحة تحكم إدخال / إخراج (الشكل التكميلي 2B-14 ؛ انظر جدول المواد). تقيس المنصة تقصير القطعة العضلية في الخلايا العضلية للفئران ، على الرغم من الحصول على نتائج مماثلة من قياسات الخلايا العضلية التي تم جمعها من الحواف الطولية للخلايا العضلية (انظر Ecklerle et ^al.14).
12. لجمع آثار تقصير القطعة العضلية، افتح البرنامج على الكمبيوتر، وحدد موافق، ثم قم بتقديم ملف > جديد. قم بإعداد قالب شاشة عن طريق تحديد عمليات التتبع > تحرير حدود المستخدم > طول القطعة العضلية ثم تعيين القيم القصوى والدنيا ، والتي تتراوح عادة بين 2.0 ميكرومتر و 1.5 ميكرومتر. قم بمعايرة كاميرا CCD ب 0.01 مم graticule قبل إجراء القياسات في الخلايا العضلية (الشكل 1D).
13. لتسجيل آثار طول القطعة العضلية، اختر ملف > جديد. حدد الخلية العضلية المنقبضة وضع الخلية العضلية على طول المحور الطولي للكاميرا بحيث يكون نمط التشقق رأسيا (الشكل 1 ب).
14. استخدم فأرة الكمبيوتر لوضع مربع منطقة الاهتمام (ROI) (المربع الوردي) فوق الخلية العضلية (الشكل 1C). حدد تجميع وابدأ لتسجيل وظيفة الانقباض. سجل تقصيرا لمدة 60 ثانية من كل خلية عضلية بترددات تحفيز منخفضة (≤0.5 هرتز).
15. سجل تقصير القطعة العضلية من 5-10 خلايا لكل CS. قم بإجراء القياسات في 1 خلية / CS إذا كانت الدراسات تشمل العلاج بمنبهات / مضادات. قم بإعداد وسائط منفصلة مسبقة التسخين وقطعة مختلفة ومخصصة من أنابيب التروية المحملة في مضخة تمعجية متعددة القنوات واتبع الخطوات 2.9.-2.14. لقياس تأثير توصيل الدواء أو الهرمونات العصبية على وظيفة انقباض الخلايا العضلية.
16. لقياس التقصير على نطاق من الترددات ، قم بتسريع الخلايا العضلية عند كل تردد للحصول على تقصير الحالة المستقرة قبل التسجيل⁵. بالنسبة لهذه الدراسات ، ضاعف معدل التروية وابدأ في تسجيل 15-20 ثانية بعد التحفيز بتردد جديد للحصول على استجابات انقباضية ثابتة الحالة للترددات في نطاق 0.2 هرتز و 2 هرتز. عادة ، لا تسجل أكثر من 2 خلية عضلية / CS للتقصير عبر نطاق معين من ترددات التحفيز.
17. سجل ما لا يقل عن 7 انقباضات / خلية للحصول على بيانات موثوقة بمتوسط الإشارة عند تحليل التسجيلات (انظر الخطوة 3.).

3. تحليل بيانات وظيفة انقباض في الخلايا العضلية المعزولة

1. للبدء، حدد ملف، واختر تتبعا مسجلا، ثم حدد فتح. حدد علامة التبويب 1 (الجانب الأيسر) من التتبع الأساسي ثم اضبط اللوحة الصفراء في أعلى التتبع على Sarc-Length. حدد عمليات التتبع وقالب الشاشة المعد في الخطوة 2.12.
2. لإعداد قالب تحليل، حدد العمليات، خيارات التحليل العابر الأحادي، علامة حدث TTL في المربع تعريف t0، بالإضافة إلى الخيارات التالية من القائمة: خط الأساس (طول القطعة العضلية أثناء الراحة) ، سرعة المغادرة بالنسبة إلى t0 (dep v) ، الذروة (ارتفاع الذروة و٪ ارتفاع الذروة / خط الأساس أو bl٪ الذروة h) ، سرعة العودة بالنسبة إلى tPeak (ret v) ، الوقت إلى الذروة 50٪ (TTP 50٪) باستخدام t0 ، والوقت إلى خط الأساس 50٪ (TTR_50٪) باستخدام tPeak. احفظ خيارات التحليل هذه عن طريق تحديد القوالب > حفظ قالب التحليل بمعرف. قم بتحميل قالب التحليل هذا قبل تحليل كل تتبع.
3. لبدء تحليل البيانات، حدد العلامات > البوابة > إضافة > عابرة تحويل من علامة الحدث > نطاق التحليل. الآن اضبط النطاق الزمني من -0.01 ثانية إلى 1.20 ثانية للخلايا العضلية التي تسير بسرعة 0.2 هرتز (الشكل 2 أ ، علامات حمراء على الجزء السفلي من التتبع الخام). حدد نطاقا زمنيا أقصر للخلايا العضلية المحفزة بترددات أعلى.
4. قم بإنشاء تتبع متوسط الإشارة عن طريق تحديد العمليات > متوسط الأحداث. يظهر تسجيل متوسط الإشارة أسفل تتبع القاعدة الأصلي.
5. حدد علامة التبويب 1 من تتبع متوسط الإشارة (الجانب الأيسر من الشاشة)، ثم حدد علامات في القائمة العلوية، متبوعة بإضافة عابر. حدد العمليات من القائمة العلوية والتحليل العابر الأحادي لعرض القيم المتوسطة للإشارة لطول القطعة العضلية الأساسية وارتفاع الذروة و bl٪ peak h و dep v و ret v و TTP_50٪ و TTR_50٪ في لوحة العرض ذات متوسط الإشارة.
6. انقل كل تحليل عابر للقطعة العضلية إلى جدول بيانات للتحليل المركب للخلايا العضلية المتعددة عن طريق تحديد تصدير > تحليل عابر أحادي > تيار الحافظة. الصق هذه البيانات في جدول البيانات لكل تتبع.
7. لنسخ تتبع متوسط الإشارة، حدد تصدير > التتبع الحالي > خيارات الحافظة > واضبط المنازل العشرية على 5، ثم حدد محدد علامات الجدولة، وانقر فوق موافق وموافق. الصق آثار متوسط الإشارة لكل تسجيل خلية عضلية في جدول بيانات ثان.

4. تسجيل Ca²⁺ عابرين في الخلايا العضلية القلبية البالغة للفئران

1. قبل قياس Ca²⁺ العابرين ، قم بتشغيل مكونات النظام الأساسي الموضحة في الخطوة 2.2 ، جنبا إلى جنب مع مكونات التصوير الفلوري الإضافية (انظر المكونات الإضافية لتحليل التصوير Ca^{2 +} في جدول المواد ؛ الشكل التكميلي 2A-5,6 ؛ 2B-12).
2. تحضير محلول مخزون Fura-2AM يحتوي على 1 mM Fura-2AM بالإضافة إلى 0.5 M بروبينسيد في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). يقلل Probenecid من تسرب Fura-2AM¹⁵.
3. قم بتخفيف محلول المخزون إلى 5 ميكرومتر Fura-2AM و 2.5 mM probenecid في 2.5 مل من الوسائط (انظر جدول المواد) في بئر واحد من لوحة 6 آبار. أضف وسائط سعة 2.5 مل وحدها (بدون Fura-2AM) إلى ثلاثة آبار إضافية في اللوحة ، وقم بتغطية اللوحة بورق الألمنيوم ، وقم بتسخين الوسائط مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
4. انقل CS الذي يحتوي على الخلايا العضلية من غرفة السرعة إلى البئر الذي يحتوي على Fura-2AM ، وقم بتغطيته ، وأعد اللوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO₂ لمدة 4 دقائق. قم بتركيب الأنابيب في مضخة التروية واستخدمها مع الوسائط أثناء فترة تحميل Fura-2AM ، كما هو موضح في الخطوة 2.4.
5. قم بإيقاف تشغيل أو تقليل مصابيح الغرفة لتقليل التبييض الضوئي الفلوري ولتحسين إشارة التألق. قم بإزالة اللوحة المكونة من 6 آبار من الحاضنة ، ثم اغسل CS لمدة 10 ثوان في كل من الآبار الثلاثة التي تحتوي على وسائط وحدها. انقل CS إلى قارب وزن صغير يحتوي على وسائط مسبقة التسخين (بدون إضافة Fura-2AM).
6. قم بتركيب CS على حجرة CS مدهونة حديثا بعد مسح الجانب السفلي من CS برفق. أضف قطرة من الوسائط برفق إلى CS ، ثم قم بتجميع حامل القطب فوق CS ، متبوعا ب CS ثان والحامل العلوي. استخدم مسامير #0 ذات الرأس لإنهاء تجميع حجرة الخلية ، كما هو موضح في الخطوات 2.6.-2.7.
7. قم بتوصيل أنبوب المضخة المملوء بالوسائط بالتسخين الأولي ، وقم بتوصيل التسخين الأولي بحجرة CS ، وضعه في محول مرحلة ، كما هو موضح في الخطوة 2.8. اجمع الوسائط باستخدام نظام الأنابيب المفرغة وقم بتشغيل نظام التسخين (الشكل التكميلي 2A ، D-7) لموازنة الغرفة إلى 37 درجة مئوية ، كما هو موضح في الخطوات 2.8.-2.9.
8. قم بتنشيط محفز السرعة (الشكل التكميلي 2B-13) المضبوط على 35-40 فولت و 0.2 هرتز ، كما هو موضح في الخطوة 2.10.
9. قبل تسجيل Ca²⁺ عابر ، قم بتشغيل مصباح يدوي صغير أو مصباح كتب مثبت بالقرب من لوحة مفاتيح الكمبيوتر للمساعدة في رؤية لوحة المفاتيح. بالإضافة إلى ذلك ، سجل خلفية مضان في منطقة خالية من الخلايا العضلية القلبية. للبدء، حدد ملف > ابدأ > جديد، كما هو موضح في الخطوة 2.12.
10. حدد عائد استثمار، وقم بتعيين علامة تبويب واحدة (أو شريط تتبع، الجانب الأيسر) للبسط الأولي وعلامة تبويب ثانية للمقام الخام، محددة في أعلى منتصف كل علامة تبويب. سجل الخلفية لمدة 10-20 ثانية. انقر بزر الماوس الأيمن فوق الماوس واسحب فوق لوحة شريط تتبع واحدة للحصول على قيم البسط والمقام بمتوسط الإشارة الأولية. أدخل هذه القيم عن طريق تحديد العمليات > الثوابت، وأدخل القيم الأولية.
11. قم بإعداد قالب شاشة جديد لجمع كل من التقصير و Ca²⁺ العابرين. بالنسبة لطول القطعة العضلية، حدد علامة التبويب 1 واستخدم العملية نفسها الموضحة في الخطوة 2.13. بالنسبة للتصوير ب Ca²⁺ ، حدد نسبة > Tab 2 (أعلى منتصف علامة التبويب) > عمليات التتبع > تحرير حدود المستخدم لتعيين الحد الأدنى والحد الأقصى لمستويات النسبة، والتي يتم تعيينها عادة بين 1 و5. استخدم نفس العملية لتحديد نطاقات البسط والمقام لعلامات التبويب 3 و 4 (الجانب الأيسر).
12. ضع مربع عائد استثمار فوق صورة خلية عضلية، كما هو موضح في الخطوة 2.14. حدد ملف > تجميع > جديد. الآن حدد ابدأ لجمع بيانات Ca²⁺ القصيرة والتناسبية. سجل ≥7 انقباضات / خلية لتحليل متوسط الإشارة.
13. كرر تسجيل تتبع الخلفية الموضح في الخطوة 4.10. بعد تسجيل 2-4 خلايا عضلية. عادة ، سجل 4-5 خلايا عضلية / CS أو عدد أقل من الخلايا العضلية إذا كانت هناك تغييرات كبيرة في قراءة الخلفية.

5. تحليل بيانات Ca²⁺ العابرين في الخلايا العضلية المعزولة.

1. افتح الملف المطلوب للتحليل وحدد قوالب > قالب الشاشة للتقصير بالإضافة إلى Ca²⁺ العابرين. بعد ذلك ، حدد علامات التبويب 1 و 2 (يسار) لإظهار طول القطعة العضلية ونسبة Ca²⁺ ، على التوالي. حدد العمليات > الثوابت وأدخل قيم البسط والمقام من تتبع الخلفية Ca²⁺ .
2. قم بإعداد قوالب التحليل لتقصير البيانات العابرة بالإضافة إلى Ca²⁺ . حدد علامة التبويب 1 (الجانب الأيسر) واستخدم نفس العملية كما هو موضح في الخطوة 3.2. لتعيين قالب تحليل طول القطعة العضلية.
3. حدد علامة التبويب 2 (الجانب الأيسر)، وحدد العمليات، وخيارات التحليل العابر الأحادي، وعلامة الحدث TTL في المربع تعريف t0، والخيارات التالية من القائمة: خط الأساس (النسبة الأساسية)، سرعة المغادرة بالنسبة إلى t0 (dep v)، الذروة (ارتفاع الذروة و٪ ارتفاع الذروة / خط الأساس أو bl٪ الذروة h) ، سرعة الاضمحلال بالنسبة إلى tPeak (ret v) ، الوقت إلى الذروة 50٪ (TTP 50٪) باستخدام t0 ، والوقت إلى خط الأساس 50٪ (TTR_50٪) باستخدام tPeak. احفظ خيارات التحليل هذه عن طريق تحديد القوالب وحفظ قالب التحليل باستخدام اسم معرف جديد. قم بتحميل قالب التحليل هذا قبل تحليل كل تتبع.
4. استخدم نفس العملية كما هو موضح في الخطوات 3.3.-3.6. لحساب متوسط الإشارة ثم تحليل طول القطعة العضلية، متبوعا بنفس الخطوات لعابري Ca²⁺ . ضع علامات منفصلة لطول القطعة العضلية ولتتبع النسبة العابرة Ca²⁺ .

النتائج

يتم إجراء دراسات وظيفة انقباض على الخلايا العضلية الفئران بدءا من اليوم التالي للعزل (اليوم 2) حتى 4 أيام بعد العزلة. على الرغم من أنه يمكن تسجيل الخلايا العضلية في اليوم التالي للعزل (أي اليوم 2) ، إلا أن أوقات الاستزراع الأطول غالبا ما تكون مطلوبة بعد نقل الجينات أو العلاجات لتعديل وظيفة ال?...

Discussion

يعمل بروتوكول السرعة المزمن الموضح في الخطوة 1 على إطالة الوقت المفيد لدراسة الخلايا العضلية المعزولة وتقييم تأثير العلاجات الأطول. في مختبرنا ، تم الحصول على نتائج متسقة تصل إلى 4 أيام بعد العزل عند قياس وظيفة الانقباض باستخدام طول القطعة العضلية على الخلايا العضلية ذات الخطى المزمنة. وم...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEDIA
Bovine serum albumin	Sigma (Roche)	3117057001	Final concentration = 0.2% (w/v)
Glutathione	Sigma	G-6529	Final concentration = 10 mM
HEPES	Sigma	H-7006	Final concentration = 15 mM
M199	Sigma	M-2520	1 bottle makes 1 L; pH 7.45
NaHCO3	Sigma	S-8875	Final concentration = 4 mM
Penicillin/streptomycin	Fisher	15140122	Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin
REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Fura-2AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	50 μg/vial;  Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;  Final Fura2-AM concentration in media is  5 μM
Probenicid	Invitrogen (Fisher)	P36400	Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM
MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING
#1 22  mm2 glass coverslips	Corning	2845-22
3 x 36 inch cables with banana jacks	Pomona Electronics	B-36-2	Supplemental Figure 1, panel C
37oC Incubator  with 95% O2:5% CO2	Forma	3110	Supplemental Figure 1, panel E.  Multiple models are appropriate
Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp	Forma	1286	Multiple models are appropriate
Forceps - Dumont #5 5/45	Fine Science Tools	11251-35
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	1800-45
Low magnification inverted microscope	Leica	DM-IL	Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes;  4X and 10X objectives recommended
Pacing chamber	Custom		Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22
Stimulator	Ionoptix	Myopacer	Supplemental Figure 1, panel D.
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS			ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options
Additional components for Ca2+ imaging analysis	Ionoptix	Essential system components: -- Photon counting system            --  Xenon power supply with dual excitation light source            --  Fluorescence interface	- The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera  (panel A #4).                                                                      - The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm  excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.                                                                                                                                 - The fluorescence interface between the computer and  light source is shown in panel B, #12.
CCD camera with image acquisition  hardware and software (240 frames/s)	Ionoptix	Myocam with CCD controller	Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4  and  panel A #5 & panel C #5 (right), respectively.  The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).
Chamber stimulator	Ionoptix	Myopacer	Panel B, #13; Alternative:  Grass model S48
Coverslip mounted perfusion chamber	Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws  (arrow, panel F)		Panel A #10 & panel F;   Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).  Commercial alternatives:  Ionoptix FHD or C-stim cell  chambers; Cell MicroControls culture stimulation system
Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients	Ionoptix	PC with Ionwizard PC board and software	Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric  Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. - A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.  The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).
Forceps - Dumont #5 TI	Fine Science Tools	11252-40	Panel F
Insulated tube holder for media	Custom		Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm
Inverted brightfield microscope	Nikon	TE-2000S	Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.   A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.
Isolator Table	TMC Vibration Control	30 x 36 inches	Panel A, #1; Desirable:  elevated shelving, Faraday shielding
Microscope eyepieces & objective	Nikon	10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective	Panel A #3; 40X objective:  n.a. 0.08; w.d. 2 mm.  A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).          NOTE:  water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls 3	Panel A #8 and panel E
small weigh boat	Fisher	08-732-112
Temperature controller	Cell MicroControls	TC2BIP	Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.    A preheater and objective heater are recommended for this platform.  A Cell MicroControls HPRE2 preheater and  HLS-1 objective heater are controlled  by the TC2BIP temperature controller for our studies.
Under cabinet LED light with motion sensor	Sylvania	#72423 LED light	Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..  Alternative:  A clip on flashlight/book light with flexible neck - multiple suppliers are available.
Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter	Fisher	Tygon tubing - E363;  polypropylene Ehrlenmeyer flask - 10-182-50B; Vacuum filter - 09-703-90	Panel A #11