Анализ сердечной сократительной дисфункции и транзиторов Ca2+ в миоцитах грызунов

Резюме

Представлен набор протоколов, которые описывают измерение сократительной функции с помощью обнаружения длины саркомера наряду с переходным измерением кальция (Ca²⁺) в изолированных миоцитах крыс. Применение этого подхода для исследований на животных моделях сердечной недостаточности также включено.

Аннотация

Сократительная дисфункция и транзиторы Ca²⁺ часто анализируются на клеточном уровне в рамках комплексной оценки сердечно-индуцированной травмы и / или ремоделирования. Один из подходов к оценке этих функциональных изменений использует ненагруженное укорочение и транзиторный анализ Ca²⁺ в первичных взрослых сердечных миоцитах. Для этого подхода взрослые миоциты выделяют путем переваривания коллагеназы, делают устойчивыми к Ca²⁺ , а затем прилипают к покрытым ламинином покровам с последующим электрическим темпом в средах, свободных от сыворотки. Общий протокол использует сердечные миоциты взрослых крыс, но может быть легко скорректирован для первичных миоцитов других видов. Функциональные изменения в миоцитах от поврежденных сердец можно сравнить с фиктивными миоцитами и / или с терапевтическим лечением in vitro . Методология включает в себя необходимые элементы, необходимые для кардиоцитарной стимуляции, а также клеточную камеру и компоненты платформы. Подробный протокол для этого подхода включает в себя этапы измерения ненагруженного укорочения путем обнаружения длины саркомера и сотовых переходных процессов Ca²⁺ , измеренных с помощью ратиометрического индикатора Fura-2 AM, а также для анализа необработанных данных.

Введение

Анализ функции сердечного насоса часто требует ряда подходов для получения адекватного понимания, особенно для животных моделей сердечной недостаточности (HF). Эхокардиография или гемодинамические измерения дают представление о сердечной дисфункции in vivo ¹, в то время как подходы in vitro часто используются для определения того, возникает ли дисфункция из-за изменений в миофиламенте и / или транзиторе Ca²⁺ , ответственном за возбуждение связи, или потенциале действия со сократительной функцией (например, связь возбуждение-сокращение [E-C]). Подходы in vitro также дают возможность скрининга функционального ответа на нейрогормоны, векторно-индуцированные генетические изменения, а также потенциальные терапевтические агенты² до проведения дорогостоящих и/или трудоемких стратегий лечения in vivo .

Существует несколько подходов к исследованию сократительной функции in vitro, включая измерения силы в интактных трабекулах³ или пермеабилизированных миоцитах⁴, а также ненагруженное укорочение и транзиторы Ca²⁺ в интактных миоцитах в присутствии и отсутствии HF ^5,6. Каждый из этих подходов фокусируется на сократительной функции сердечных миоцитов, которая непосредственно отвечает за функцию сердечного насоса ^2,7. Тем не менее, анализ как сокращения, так и связи E-C вместе чаще всего выполняется путем измерения укорочения длины мышцы и переходных процессов Ca²⁺ в изолированных, устойчивых к Ca²⁺ взрослых миоцитах. Лаборатория использует подробный опубликованный протокол для выделения миоцитов из сердец крыс для этого шага⁸.

Как транзитор Ca²⁺, так и миофиламенты способствуют укорочению и повторному удлинению в интактных миоцитах и могут способствовать сократительной дисфункции ^2,7. Таким образом, этот подход рекомендуется, когда функциональный анализ in vitro требует интактного миоцита, содержащего велосипедный механизм Ca^{2 +} плюс миофиламенты. Например, интактные изолированные миоциты желательны для изучения сократительной функции после модификации миофиламента или циклической функции Ca²⁺ посредством переноса генов⁹. Кроме того, интактный миоцитарный подход предлагается для анализа функционального воздействия нейрогормонов при изучении влияния нисходящих вторичных сигнальных путей мессенджера и/или ответа на терапевтические агенты². Альтернативное измерение нагрузочно-зависимой силы в отдельных миоцитах чаще всего выполняется после мембранной пермеабилизации (или снятия кожи) при низких температурах (≤15 °C) для удаления переходного вклада Ca²⁺ и фокусировки на функции миофиламента¹⁰. Измерение зависящей от нагрузки силы плюс переходные процессы Ca²⁺ в интактных миоцитах встречается редко из-за сложной и технической проблемы подхода¹¹, особенно когда требуется более высокая пропускная способность, например, для измерения реакций на передачу сигналов нейрогормона или в качестве экрана для терапевтических агентов. Анализ сердечных трабекул преодолевает эти технические проблемы, но также может зависеть от немиоцитов, фиброза и / или ремоделирования внеклеточного матрикса². Каждый из описанных выше подходов требует препарата, содержащего взрослые миоциты, поскольку неонатальные миоциты и миоциты, полученные из индуцируемых плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), еще не экспрессируют полный комплемент взрослых белков миофиламента и обычно не имеют уровня организации миофиламента, присутствующего во взрослом палочковидном миоците². На сегодняшний день данные в иПСК указывают на то, что полный переход к взрослым изоформам превышает более 134 дней в культуре¹².

Учитывая акцент этой коллекции на HF, протоколы включают подходы и анализ для дифференциации сократительной функции в неисправных и недееспособных интактных миоцитах. Репрезентативные примеры приведены из крысиных миоцитов, изученных через 18-20 недель после надпочечниковой коарктации, описанной ранее ^5,13. Затем проводятся сравнения с миоцитами у крыс, обработанных фикцией.

Протокол и платформа визуализации, описанные здесь, используются для анализа и мониторинга изменений укорочения и транзиторов Ca²⁺ в палочковидных сердечных миоцитах во время развития HF. Для этого анализа 2 x 10⁴ Ca²⁺ -толерантные, палочковидные миоциты покрыты 22 мм² стеклянными крышками (CSs) с покрытием ламинин и культивируются в течение ночи, как описано ранее⁸. Компоненты, собранные для этой платформы визуализации, наряду с носителями и буферами, используемыми для оптимальной визуализации, представлены в Таблице материалов. Руководство по анализу данных с использованием программного обеспечения и репрезентативные результаты также представлены здесь. Общий протокол разбит на отдельные подразделы, причем первые три раздела посвящены изолированным миоцитам крыс и анализу данных, за которыми следуют клеточные эксперименты Ca^{2 +} и анализ данных в миоцитах.

протокол

Исследования, проведенные на грызунах, проводились в соответствии с Политикой службы общественного здравоохранения в отношении гуманного ухода и использования лабораторных животных и были одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Мичиганского университета. Для этого исследования миоциты были выделены у 3-34-месячных крыс Sprague-Dawley и F344BN весом ≥ 200 г⁵. Использовались как мужские, так и женские показатели.

1. Стимуляция миоцитов для исследования сократительной функции

1. Сделайте свежие среды на основе M199 для каждого набора изолированных миоцитов (Таблица материалов). За 1 день до стимуляции, пластина 2 x 10⁴ Ca²⁺-толерантные, палочковидные миоциты на 22 мм² покрытых ламинином стеклянных покровах (CSs), как описано ранее⁸.
2. Для подготовки камер замочите каждую камеру в 10% отбеливателе в течение 1 ч. Затем промывайте камеры проточной водопроводной водой в течение 30-45 мин, затем дистиллированную воду заменяют каждые 5 мин в течение 30 мин, затем деионизированную воду заменяют каждые 5 мин в течение 30 мин, и заключительную промывку в деионизированной воде.
3. Высушите камеры на чистой поверхности в течение 20-30 мин (дополнительный рисунок 1А-С). Далее УФ обрабатывают камеры в шкафу биобезопасности в течение 5 мин в каждом направлении (итого = 20 мин). Этот шаг не нужен для предварительно стерилизованных камер.
   ВНИМАНИЕ: Покиньте область, чтобы свести к минимуму воздействие ультрафиолета.
4. Снимите крышку с камеры, добавьте 3 мл среды на основе M199 (см. Таблицу материалов) в каждую скважину (дополнительный рисунок 1B), замените крышку и предварительно разогрейте камеру в инкубаторе с температурой 37 °C с 5% CO₂ и 20% O₂.
5. Стерилизуйте щипцы в горячем стерилизаторе при 250 °C в течение 20-25 с. Перенесите предварительно нагретую стимулирующую камеру из инкубатора в шкаф биобезопасности.
6. Перенесите каждый покров (CS), содержащий сердечные миоциты, в отдельные колодцы в камере стимуляции с помощью стерильных щипцов. Передавайте КС по четыре за раз, с последующим нагревом в течение 10 мин перед передачей оставшихся четырех КС для поддержания температуры среды.
7. Прикрепите банановые домкраты к камере стимуляции на одном конце (дополнительный рисунок 1C) и к стимулятору на другом конце (дополнительный рисунок 1D).
8. Установите частоту стимулятора на 0,2 Гц и установите напряжение (~12 В) для достижения сокращения в ~10%-20% всех палочковидных сердечных миоцитов внутри лунки. Чтобы определить количество сокращающихся миоцитов, поместите камеру под инвертированный микроскоп с увеличением от 4 до 10 раз.
9. Поместите камеру стимуляции в инкубатор при 37 °C в 5% CO₂ (дополнительный рисунок 1E). Меняйте среду каждые 12 ч с помощью среды, предварительно нагретой в инкубаторе 37 °C, 5% CO₂ в течение 20-25 мин. Продолжайте электростимуляцию до 3 дней с изменением среды каждые 12 ч.

2. Анализ сократительной функции сердечных миоцитов взрослых крыс

1. Разогрейте гелевую упаковку и среду в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 30 мин перед экспериментом.
2. Включите компоненты платформы с контрактильной функцией, перечисленные в таблице материалов и показанные на дополнительном рисунке 2, с особым вниманием к ключевым компонентам, которые включают антивибрационную таблицу (дополнительный рисунок 2A-1) с инвертированным микроскопом с темно-красным (590 нм) фильтром (дополнительный рисунок 2A-2,3) и ПЗС-камеру (дополнительный рисунок 2A-4), подключенную к контроллеру CCD (дополнительный рисунок 2A-5 и Дополнительный рисунок 2C-5) и интегрированный с ПК-компьютером (Дополнительный рисунок 2В-14).
3. Вмонтируйте трубку в перистальтический насос (дополнительный рисунок 2А-8; Дополнительный рисунок 2А-8), перенесите предварительно нагретую гелевую упаковку в держатель трубки (дополнительный рисунок 2А-9) и включите вакуум (дополнительный рисунок 2А-11) и питание на клеточный стимулятор (дополнительный рисунок 2В-13).
4. Поместите трубку объемом 50 мл со средой в изолированный держатель трубки (дополнительный рисунок 2А-9) и начните перфузию со скоростью ~0,5 мл/мин через трубку перистальтического насоса (дополнительный рисунок 2E-8).
5. Добавьте небольшое количество предварительно нагретой среды в небольшую весовую лодку (~ 2 мл). Перенесите один КС, содержащий миоциты, из стимулирующей камеры в весовую лодку. Верните камеру стимуляции к 37 °C в инкубаторе с 5% CO₂ .
6. Снимите CS с весовой лодки и аккуратно протрите нижнюю часть. Переложите CS в свежесмазанную камеру CS (дополнительный рисунок 2A, F-10; черная стрелка) и осторожно добавьте каплю среды (~200 мкл) на CS.
7. Поместите платиновый электрод поверх CS (дополнительный рисунок 2F; серая стрелка) и положите новый CS сверху с помощью щипцов. Поместите верхнее крепление (дополнительный рисунок 2F; белая стрелка) над сэндвичем CS, а затем установите два или четыре винта #0, чтобы закончить сборку камеры.
8. Как только среда появится во всей трубке насоса, прикрепите трубку к предпусковому подогревателю, а затем подключите предпусковой подогреватель к камере CS, собранной на этапе 2.7. Начните перфузию со скоростью 0,5 мл / мин и поместите салфетку под камеру, чтобы убедиться в отсутствии утечек.
9. Поместите камеру CS в адаптер сцены. Перфузированная среда собирается на противоположном конце камеры с трубкой, подключенной к вакуумной системе. Включите систему отопления (дополнительный рисунок 2A, D-7) и уравновешивайте камеру, объектив и подогреватель в течение ~ 5-10 мин для достижения постоянной температуры среды 37 °C. Визуализируйте миоциты с помощью 40-кратного объекта погружения в воду на микроскопе в течение этого времени равновесия.
10. Активируйте стимулятор кардиостимулятора (дополнительный рисунок 2B-13), установив напряжение в 1,5 раза больше, чем необходимо для сокращения 80% палочковидных клеток, что обычно составляет 35-40 В. Установите частоту стимуляции на 0,2 Гц для оптимизации сократительной функции и выживаемости миоцитов.
11. Соберите сократительные укороченные и удлиняющие следы от непрерывно перфузированных и ускоренных миоцитов. Для сбора измерений сокращения используйте ПЗС-камеру (дополнительный рисунок 2A-4), подключенную к контроллеру CCD (дополнительный рисунок 2B-5, C), и специальный компьютер с платой контроллера ввода/вывода (дополнительный рисунок 2B-14; см. Таблицу материалов). Платформа измеряет укорочение саркомера в миоцитах крыс, хотя аналогичные результаты получены из измерений миоцитов, собранных из продольных краев миоцитов (см. Ecklerle et ^al.14).
12. Чтобы собрать следы сокращения саркомера, откройте программное обеспечение на компьютере, нажмите кнопку ОК, а затем Файл > Создать. Подготовьте шаблон экрана, выбрав Трассировки > Изменить ограничения пользователя > Длину саркомера , а затем установив максимальное и минимальное значения, которые обычно составляют от 2,0 мкм до 1,5 мкм. Откалибруйте ПЗС-камеру с помощью гратикулы 0,01 мм перед проведением измерений в миоцитах (рисунок 1D).
13. Чтобы записать трассировки длины саркомера, выберите Файл > Создать. Определите сокращающийся миоцит и расположите миоцит вдоль продольной оси камеры, чтобы рисунок полосы был вертикальным (рисунок 1B).
14. Используйте компьютерную мышь, чтобы поместить область интереса (ROI) (розовая коробка) над миоцитом (рисунок 1C). Выберите Собрать и Начать , чтобы записать сократительную функцию. Запись укорочения в течение 60 с с каждого миоцита на низких частотах стимуляции (≤0,5 Гц).
15. Регистрируйте укорочение саркомера от 5-10 клеток на КС. Выполняйте измерения при 1 клетке/КС, если исследования включают лечение агонистами/антагонистами. Подготовьте отдельные предварительно нагретые среды и другой специальный кусок перфузионной трубки, загруженный в многоканальный перистальтический насос, и выполните шаги 2.9.-2.14. для измерения влияния доставки препарата или нейрогормона на сократительную функцию миоцитов.
16. Чтобы измерить укорочение в диапазоне частот, разместите миоциты на каждой частоте, чтобы получить устойчивое укорочение до записи⁵. Для этих исследований удваивают скорость перфузии и начинают запись через 15-20 с после стимуляции на новой частоте для получения последовательных стационарных сократительных откликов для частот в диапазоне 0,2 Гц и 2 Гц. Как правило, регистрируют не более 2 миоцитов/КС для укорочения в заданном диапазоне частот стимуляции.
17. Запишите не менее 7 сокращений на клетку для получения надежных усредненных по сигналу данных при анализе записей (см. шаг 3.).

3. Анализ данных сократительной функции в изолированных миоцитах

1. Для начала выберите Файл, выберите записанную трассировку и нажмите кнопку Открыть. Выберите вкладку 1 (левая сторона) базовой трассировки, а затем установите для желтой панели в верхней части трассировки значение Sarc-Length. Выберите Трассировки и шаблон экрана, подготовленный на шаге 2.12.
2. Чтобы подготовить шаблон анализа, выберите Операции, Параметры монотонного анализа переходных процессов, Отметка события TTL в поле Определение t0, а также следующие опции в меню: Базовая линия (длина саркомера покоя), Скорость вылета относительно t0 (dep v), Пик (пиковая высота и %пиковая высота/базовая линия или bl%пик h), Обратная скорость относительно tPeak (ret v), Время достижения пика 50% (TTP_50%) с использованием t0 и время до базового уровня 50% (TTR_50%)) с помощью tPeak. Сохраните эти параметры анализа, выбрав Шаблоны > Сохранить шаблон анализа с идентификатором. Загрузите этот шаблон анализа перед анализом каждой трассировки.
3. Чтобы начать анализ данных, выберите Marks > Gate > Add Transient > Convert from Event Mark > Analysis Range. Теперь установите временной диапазон от -0,01 с до 1,20 с для миоцитов с частотой 0,2 Гц (рисунок 2А, красные отметки на нижней части сырого следа). Выберите более короткий временной диапазон для миоцитов, стимулируемых на более высоких частотах.
4. Создайте трассировку с усредненным сигналом, выбрав Операции > Средние события. Усредненная по сигналу запись отображается ниже исходного базового следа.
5. Выберите вкладку 1 трассировки усредненного сигнала (левая часть экрана), а затем выберите Метки в верхнем меню, а затем Добавить переходный. Выберите «Операции» в верхнем меню и «Монотонный анализ переходных процессов », чтобы отобразить усредненные по сигналу значения базовой длины саркомера, высоты пика, bl%peak h, dep v, ret v, TTP_50% и TTR_50% на панели отображения усредненного сигнала.
6. Перенесите каждый анализ переходных процессов саркомера в электронную таблицу для композитного анализа нескольких миоцитов, выбрав Экспорт > Монотонный переходный анализ > Ток буфера обмена. Вставьте эти данные в электронную таблицу для каждой трассировки.
7. Чтобы скопировать трассировку, усредненную по сигналу, выберите «Экспортировать > «Текущую трассировку» > > «Параметры буфера обмена» и установите для десятичных знаков значение 5, затем выберите «Разделитель табуляции» и нажмите кнопки «ОК» и «ОК». Вставьте усредненные по сигналу следы для каждой записи миоцитов во вторую электронную таблицу.

4. Запись транзиторов Ca²⁺ в миоцитах сердца взрослых крыс

1. Перед измерением переходных процессов Ca²⁺ включите компоненты платформы, описанные на шаге 2.2., вместе с дополнительными компонентами флуоресцентной визуализации (см. Дополнительные компоненты для анализа изображений Ca²⁺ в Таблице материалов; Дополнительный рисунок 2А-5,6; 2В-12).
2. Готовят Фура-2АМ стоковый раствор, содержащий 1 мМ Фура-2АМ плюс 0,5 М пробенецида в диметилсульфоксиде (ДМСО). Probenecid минимизирует утечку Fura-2AM¹⁵.
3. Разбавляют исходный раствор до 5 мкМ Фура-2АМ и 2,5 мМ пробенецида в 2,5 мл среды (см. Таблицу материалов) в одной скважине 6-луночной пластины. Добавьте только 2,5 мл среды (без Fura-2AM) в три дополнительные скважины в пластине, покройте пластину алюминиевой фольгой и предварительно нагрейте среду до 37 °C.
4. Перенесите CS, содержащий миоциты, из камеры кардиостимуляции в колодец, содержащий Fura-2AM, накройте крышкой и верните пластину в инкубатор 37 °C с 5% CO₂ в течение 4 мин. Установите трубку в перфузионный насос и перфьюируйте со средой в течение периода загрузки Fura-2AM, как описано в шаге 2.4.
5. Выключите или сведите к минимуму освещение помещения, чтобы уменьшить флуоресцентное фотоотбеливание и оптимизировать флуоресцентный сигнал. Извлеките 6-луночную пластину из инкубатора, а затем промывайте CS в течение 10 с в каждой из трех скважин, содержащих только среду. Переложите CS на небольшую весовую лодку, содержащую предварительно обработанные носители (без добавления Fura-2AM).
6. Установите CS в свежесмазанную камеру CS после осторожного протирания нижней стороны CS. Аккуратно добавьте каплю среды в CS, а затем соберите крепление электрода над CS, а затем второе CS и верхнее крепление. Используйте винты No0 для завершения сборки камеры ячейки, как описано в шагах 2.6.-2.7.
7. Подключите насосную трубку, заполненную средой, к предпусковому подогревателю, подключите предпусковой подогреватель к камере CS и поместите в каскадный адаптер, как описано в шаге 2.8. Соберите среду с помощью системы вакуумных трубок и включите систему отопления (дополнительный рисунок 2A, D-7), чтобы уравновесить камеру до 37°C, как описано в шагах 2.8.-2.9.
8. Активируйте стимулятор темпа (дополнительный рисунок 2B-13), установленный на 35-40 В и 0,2 Гц, как описано в шаге 2.10.
9. Перед записью переходного ca²⁺ включите небольшой фонарик или книжный фонарик, установленный рядом с клавиатурой компьютера, чтобы помочь увидеть клавиатуру. Кроме того, регистрируют фон флуоресценции в области без сердечных миоцитов. Для начала выберите Файл > Запустить > Создать, как описано в шаге 2.12.
10. Выберите рентабельность инвестиций и установите одну вкладку (или панель трассировки, слева) для необработанного числителя и вторую вкладку для необработанного знаменателя, определенного в верхнем центре каждой вкладки. Записывайте фон в течение 10-20 с. Щелкните правой кнопкой мыши и перетащите указатель мыши на одну панель трассировки, чтобы получить необработанные значения усредненного по сигналу числителя и знаменателя. Введите эти значения, выбрав Операции > Константы, и введите необработанные значения.
11. Подготовьте новый шаблон экрана, чтобы собрать как укорочение, так и переходные процессы Ca²⁺ . Для длины саркомера выберите Tab 1 и используйте тот же процесс, что описан в шаге 2.13. Для изображения Ca²⁺ выберите Tab 2 > Ratio (верхний центр вкладки) > Traces > Edit User Limits (Изменить пользовательские ограничения ), чтобы установить минимальный и максимальный уровни для соотношения, которые обычно устанавливаются между 1 и 5. Используйте тот же процесс для определения диапазонов числителя и знаменателя для вкладок 3 и 4 (левая сторона).
12. Поместите коробку ROI над изображением миоцитов, как описано в шаге 2.14. Выберите Файл > Новый сбор >. Теперь выберите Пуск , чтобы собрать укороченные и ратиометрические данные Ca²⁺ . Запись ≥7 сокращений на клетку для усредненного анализа сигнала.
13. Повторите запись фоновой трассировки, описанную в шаге 4.10. после записи 2-4 миоцитов. Как правило, регистрируют 4-5 миоцитов / CS или меньше миоцитов, если есть значительные изменения в фоновом чтении.

5. Анализ данных переходных процессов Ca²⁺ в изолированных миоцитах.

1. Откройте нужный файл для анализа и выберите Шаблоны > Шаблон экрана для сокращения плюс Ca²⁺ переходные процессы. Затем выберите вкладки 1 и 2 (слева), чтобы показать длину саркомера и соотношение Ca²⁺ соответственно. Выберите Операции > Константы и введите значения числителя и знаменателя из фоновой трассировки Ca²⁺ .
2. Подготовьте шаблоны анализа для сокращения плюс ca²⁺ переходные данные. Выберите вкладку 1 (левая сторона) и используйте тот же процесс, что описан в шаге 3.2. , чтобы задать шаблон анализа длины саркомера.
3. Выберите вкладку 2 (слева) и выберите Операции, Параметры монотонного анализа переходных процессов, Отметку события TTL в поле Определение t0 и следующие параметры в меню: Базовая линия (базальное отношение), Скорость вылета относительно t0 (dep v), Пик (пиковая высота и %пиковая высота/базовая линия или bl%пик h), Скорость распада относительно tPeak (ret v), Время достижения пика 50% (TTP_50%) с использованием t0 и время до базового уровня 50% (TTR_50%)) с помощью tPeak. Сохраните эти параметры анализа, выбрав Шаблоны и Сохранить шаблон анализа , используя новое имя идентификатора. Загрузите этот шаблон анализа перед анализом каждой трассировки.
4. Используйте тот же процесс, что описан в шагах 3.3.-3.6. , чтобы усреднить сигнал, а затем проанализировать длину саркомера, после чего следуют те же шаги для переходных процессов Ca²⁺ . Установите отдельные отметки для длины саркомера и для трассировки переходного соотношения Ca²⁺ .

Результаты

Исследования сократительной функции проводятся на миоцитах крыс, начиная со дня после выделения (день 2) до 4 дней после изоляции. Хотя миоциты могут быть зарегистрированы на следующий день после выделения (т. Е. День 2), часто требуется более длительное время культивирования после перено...

Обсуждение

Протокол хронической кардиостимуляции, описанный в шаге 1, продлевает полезное время для изучения изолированных миоцитов и оценки влияния более длительного лечения. В нашей лаборатории были получены последовательные результаты до 4 дней после изоляции при измерении сократительной фу...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEDIA
Bovine serum albumin	Sigma (Roche)	3117057001	Final concentration = 0.2% (w/v)
Glutathione	Sigma	G-6529	Final concentration = 10 mM
HEPES	Sigma	H-7006	Final concentration = 15 mM
M199	Sigma	M-2520	1 bottle makes 1 L; pH 7.45
NaHCO3	Sigma	S-8875	Final concentration = 4 mM
Penicillin/streptomycin	Fisher	15140122	Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin
REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Fura-2AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	50 μg/vial;  Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;  Final Fura2-AM concentration in media is  5 μM
Probenicid	Invitrogen (Fisher)	P36400	Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM
MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING
#1 22  mm2 glass coverslips	Corning	2845-22
3 x 36 inch cables with banana jacks	Pomona Electronics	B-36-2	Supplemental Figure 1, panel C
37oC Incubator  with 95% O2:5% CO2	Forma	3110	Supplemental Figure 1, panel E.  Multiple models are appropriate
Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp	Forma	1286	Multiple models are appropriate
Forceps - Dumont #5 5/45	Fine Science Tools	11251-35
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	1800-45
Low magnification inverted microscope	Leica	DM-IL	Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes;  4X and 10X objectives recommended
Pacing chamber	Custom		Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22
Stimulator	Ionoptix	Myopacer	Supplemental Figure 1, panel D.
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS			ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options
Additional components for Ca2+ imaging analysis	Ionoptix	Essential system components: -- Photon counting system            --  Xenon power supply with dual excitation light source            --  Fluorescence interface	- The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera  (panel A #4).                                                                      - The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm  excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.                                                                                                                                 - The fluorescence interface between the computer and  light source is shown in panel B, #12.
CCD camera with image acquisition  hardware and software (240 frames/s)	Ionoptix	Myocam with CCD controller	Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4  and  panel A #5 & panel C #5 (right), respectively.  The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).
Chamber stimulator	Ionoptix	Myopacer	Panel B, #13; Alternative:  Grass model S48
Coverslip mounted perfusion chamber	Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws  (arrow, panel F)		Panel A #10 & panel F;   Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).  Commercial alternatives:  Ionoptix FHD or C-stim cell  chambers; Cell MicroControls culture stimulation system
Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients	Ionoptix	PC with Ionwizard PC board and software	Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric  Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. - A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.  The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).
Forceps - Dumont #5 TI	Fine Science Tools	11252-40	Panel F
Insulated tube holder for media	Custom		Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm
Inverted brightfield microscope	Nikon	TE-2000S	Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.   A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.
Isolator Table	TMC Vibration Control	30 x 36 inches	Panel A, #1; Desirable:  elevated shelving, Faraday shielding
Microscope eyepieces & objective	Nikon	10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective	Panel A #3; 40X objective:  n.a. 0.08; w.d. 2 mm.  A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).          NOTE:  water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls 3	Panel A #8 and panel E
small weigh boat	Fisher	08-732-112
Temperature controller	Cell MicroControls	TC2BIP	Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.    A preheater and objective heater are recommended for this platform.  A Cell MicroControls HPRE2 preheater and  HLS-1 objective heater are controlled  by the TC2BIP temperature controller for our studies.
Under cabinet LED light with motion sensor	Sylvania	#72423 LED light	Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..  Alternative:  A clip on flashlight/book light with flexible neck - multiple suppliers are available.
Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter	Fisher	Tygon tubing - E363;  polypropylene Ehrlenmeyer flask - 10-182-50B; Vacuum filter - 09-703-90	Panel A #11