Kemirgen Miyositlerde Kardiyak Kasılma Disfonksiyonu ve Ca2+ Geçicilerinin Analizi

Özet

İzole sıçan miyositlerinde kalsiyum (Ca²⁺) geçici ölçümü ile birlikte sarkomer uzunluğu tespiti yoluyla kontraktil fonksiyonun ölçümünü tanımlayan bir dizi protokol sunulmaktadır. Bu yaklaşımın kalp yetmezliğinin hayvan modellerindeki çalışmalar için uygulanması da dahil edilmiştir.

Özet

Kontraktil disfonksiyon ve Ca²⁺ geçicileri genellikle kardiyak kaynaklı yaralanma ve / veya yeniden modellemenin kapsamlı bir değerlendirmesinin bir parçası olarak hücresel düzeyde analiz edilir. Bu fonksiyonel değişiklikleri değerlendirmek için bir yaklaşım, primer erişkin kardiyak miyositlerde yüksüz kısaltma ve Ca²⁺ geçici analizleri kullanır. Bu yaklaşım için, yetişkin miyositler kollajenaz sindirimi ile izole edilir, Ca^{2 +} toleranslı hale getirilir ve daha sonra laminin kaplı kapaklara yapıştırılır, ardından serumsuz ortamlarda elektriksel pacing yapılır. Genel protokol yetişkin sıçan kardiyak miyositlerini kullanır, ancak diğer türlerden birincil miyositler için kolayca ayarlanabilir. Yaralı kalplerden kaynaklanan miyositlerdeki fonksiyonel değişiklikler, sahte miyositler ve / veya in vitro terapötik tedavilerle karşılaştırılabilir. Metodoloji, hücre odası ve platform bileşenleri ile birlikte miyosit pacing için gerekli temel unsurları içerir. Bu yaklaşım için ayrıntılı protokol, sarkomer uzunluğu tespiti ile yüksüz kısalmayı ölçme adımlarını ve oranmetrik gösterge Fura-2 ile ölçülen hücresel Ca^{2 +} geçicileri ve ham veri analizini içerir.

Giriş

Kardiyak pompa fonksiyonunun analizi, özellikle kalp yetmezliğinin (HF) hayvan modelleri için yeterli içgörü elde etmek için genellikle bir dizi yaklaşım gerektirir. Ekokardiyografi veya hemodinamik ölçümler in vivo kardiyak disfonksiyon¹ hakkında fikir verirken, in vitro yaklaşımlar genellikle disfonksiyonun miyofilament ve / veya uyarma eşleşmesinden sorumlu Ca^{2 +} geçici veya kontraktil fonksiyonlu aksiyon potansiyelindeki değişikliklerden kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek için kullanılır (örneğin, uyarma-kasılma [E-C] bağlantısı). İn vitro yaklaşımlar ayrıca, pahalı ve / veya zahmetli in vivo tedavi stratejilerini takip etmeden önce nörohormonlara, vektör kaynaklı genetik değişikliklere ve potansiyel terapötik ajanlara² fonksiyonel yanıtı tarama fırsatı sunar.

İn vitro kontraktil fonksiyonu araştırmak için, sağlam trabekül³ veya geçirgenleştirilmiş miyositler^4'te kuvvet ölçümlerinin yanı sıra, HF ^5,6'nın varlığında ve yokluğunda sağlam miyositlerde yüksüz kısalma ve Ca^{2 +} geçicileri de dahil olmak üzere çeşitli yaklaşımlar mevcuttur. Bu yaklaşımların her biri, kardiyak pompa fonksiyonu ^2,7'den doğrudan sorumlu olan kardiyak miyosit kontraktil fonksiyonuna odaklanmaktadır. Bununla birlikte, hem kasılma hem de E-C eşleşmesinin birlikte analizi, çoğunlukla izole edilmiş, Ca 2 + toleranslı yetişkin miyositlerde kas uzunluğunun ve Ca^{2 +} geçicilerinin kısalmasını ölçerek gerçekleştirilir. Laboratuvar, bu adım⁸ için miyositleri sıçan kalplerinden izole etmek için ayrıntılı bir yayınlanmış protokol kullanmaktadır.

Hem Ca²⁺ geçici hem de miyofilamentler, sağlam miyositlerde kısalmaya ve yeniden uzamaya katkıda bulunur ve kontraktil disfonksiyona katkıda bulunabilir ^2,7. Bu nedenle, in vitro fonksiyonel analiz, Ca²⁺ bisiklet makinesini ve miyofilamentleri içeren sağlam bir miyosit gerektirdiğinde bu yaklaşım önerilir. Örneğin, bozulmamış izole miyositler, gen transferi⁹ yoluyla miyofilament veya Ca^{2 +} döngü fonksiyonunu değiştirdikten sonra kasılma fonksiyonunu incelemek için arzu edilir. Ek olarak, aşağı akış ikinci haberci sinyal yollarının ve / veya terapötik ajanlara yanıtın etkisini incelerken nörohormonların fonksiyonel etkisini analiz etmek için sağlam bir miyosit yaklaşımı önerilmektedir². Tek miyositlerde yüke bağlı kuvvetin alternatif bir ölçümü, Ca^{2 +} geçici katkısını ortadan kaldırmak ve miyofilament^fonksiyonuna odaklanmak için en sık düşük sıcaklıklarda (≤15 ° C) membran geçirgenliğinden (veya deriden kaplamadan) sonra gerçekleştirilir. Sağlam miyositlerde yüke bağımlı kuvvet artı Ca^{2 +} geçicilerinin ölçümü, özellikle nörohormon sinyallemesine verilen yanıtları ölçmek veya terapötik ajanlar için bir ekran olarak daha yüksek verime ihtiyaç duyulduğunda, yaklaşım^11'in karmaşık ve teknik zorluğu nedeniyle nadirdir. Kardiyak trabeküllerin analizi bu teknik zorlukların üstesinden gelir, ancak miyosit olmayan, fibroz ve / veya hücre dışı matriks yeniden şekillenmesinden de etkilenebilir². Yukarıda açıklanan yaklaşımların her biri, yetişkin miyositleri içeren bir preparat gerektirir, çünkü yenidoğan miyositleri ve indüklenebilir pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) türetilen miyositler, yetişkin miyofilament proteinlerinin tam tamamlayıcısını henüz ifade etmemektedir ve genellikle yetişkin çubuk şeklindeki miyosit^2'de bulunan miyofilament organizasyon seviyesinden yoksundur. Bugüne kadar, iPSC'lerdeki kanıtlar, yetişkin izoformlarına tam geçişin kültür^12'de 134 günden fazla olduğunu göstermektedir.

Bu koleksiyonun HF üzerindeki odağı göz önüne alındığında, protokoller, başarısız olan ve başarısız olmayan sağlam miyositlerdeki kontraktil fonksiyonu ayırt etmek için yaklaşımlar ve analizler içerir. Temsili örnekler, daha önce^5,13 olarak tarif edilen^, böbrek üstü koarktasyondan 18-20 hafta sonra çalışılan sıçan miyositlerinden verilmiştir. Daha sonra sahte muamele görmüş sıçanlardan miyositlerle karşılaştırmalar yapılır.

Burada tarif edilen protokol ve görüntüleme platformu, HF gelişimi sırasında çubuk şeklindeki kardiyak miyositlerde kısalma ve Ca²⁺ geçicilerindeki değişiklikleri analiz etmek ve izlemek için kullanılır. Bu analiz için, 2 x 10⁴ Ca^{2 +} toleranslı, çubuk şeklindeki miyositler, 22^mm2 laminin kaplı cam kapaklar (CSs) üzerine kaplanır ve daha önce açıklandığı gibi gece boyunca kültürlenir⁸. Bu görüntüleme platformu için monte edilen bileşenler, optimum görüntüleme için kullanılan ortam ve tamponlarla birlikte, Malzeme Tablosunda verilmiştir. Bir yazılım kullanarak veri analizi için bir kılavuz ve temsili sonuçlar da burada sağlanmaktadır. Genel protokol ayrı alt bölümlere ayrılmıştır, ilk üç bölüm izole sıçan miyositlerine ve veri analizine odaklanır, bunu miyositlerde hücresel Ca^{2 +} geçici deneyler ve veri analizi izler.

Protokol

Kemirgenler üzerinde yapılan çalışmalar, İnsancıl Bakım ve Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımına İlişkin Halk Sağlığı Hizmet Politikası'nı izlemiş ve Michigan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışma için, miyositler 3-34 aylık Sprague-Dawley ve ≥ 200 g⁵ ağırlığındaki F344BN sıçanlarından izole edildi. Hem erkek hem de kadın oranları kullanıldı.

1. Kasılma fonksiyonu çalışmaları için miyosit pacing

1. Her bir izole miyosit seti için taze M199 bazlı ortamlar yapın (Malzeme Tablosu). Tempodan 1 gün önce, plaka 2 x 10⁴ Ca 2⁺ toleranslı, çubuk şeklindeki miyositler 22 mm² laminin kaplı cam kapaklar (CSs), daha önce açıklandığı gibi⁸.
2. Odaları hazırlamak için, her odayı 1 saat boyunca% 10 ağartıcıya batırın. Daha sonra, odaları 30-45 dakika boyunca akan musluk suyuyla yıkayın, ardından 30 dakika boyunca her 5 dakikada bir değiştirilen damıtılmış su, ardından 30 dakika boyunca her 5 dakikada bir değiştirilen deiyonize su ve deiyonize suda son bir durulama.
3. Odaları temiz bir yüzeyde 20-30 dakika kurutun (Ek Şekil 1A-C). Daha sonra, UV odaları bir biyogüvenlik kabininde her yönde 5 dakika boyunca (toplam = 20 dakika) işlemden geçirir. Önceden sterilize edilmiş odalar için bu adıma gerek yoktur.
   DİKKAT: UV ışınlarına maruz kalmayı en aza indirmek için bölgeyi terk edin.
4. Kapağı hazneden çıkarın, her bir oyuğa 3 mL M199 bazlı ortam ekleyin (Ek Şekil 1B'ye bakınız), kapağı değiştirin ve odayı %5 CO 2 ve %₂₀ O₂ ile 37 °C'lik bir inkübatörde önceden ısıtın.
5. Forsepsleri sıcak boncuk sterilizatöründe 250 °C'de 20-25 s için sterilize edin. Önceden ısıtılmış stimülasyon odasını inkübatörden bir biyogüvenlik kabinine aktarın.
6. Kardiyak miyositler içeren her bir kapak kaymasını (CS), steril forseps kullanarak stimülasyon odasındaki bireysel kuyucuklara aktarın. CSs'yi bir seferde dört kez aktarın, ardından ortam sıcaklığını korumak için kalan dört CS'nin aktarılmasından önce 10 dakika ısıtılır.
7. Muz krikolarını bir ucundaki stimülasyon odasına (Ek Şekil 1C) ve diğer ucundaki uyarıcıya (Ek Şekil 1D) takın.
8. Stimülatör frekansını 0.2 Hz'e ayarlayın ve bir kuyu içindeki çubuk şeklindeki tüm kardiyak miyositlerin ~% 10 -% 20'sinde kasılma sağlamak için voltajı (~ 12 V) ayarlayın. Kasılma miyositlerinin sayısını belirlemek için, odayı 4x ila 10x büyütme ile ters çevrilmiş bir mikroskop altına yerleştirin.
9. Stimülasyon odasını 37 °C'de bir inkübatöre% 5 CO_2'ye yerleştirin (Ek Şekil 1E). 37 °C, %5 CO 2 inkübatörde_20-25 dakika önceden ısıtılmış ortam kullanarak medyayı her 12 saatte bir değiştirin. Her 12 saatte bir değiştirilen medya ile 3 güne kadar elektriksel stimülasyona devam edin.

2. Erişkin sıçan kardiyak miyositlerinin kontraktil fonksiyon analizi

1. Deneyden önce bir jel paketini ve ortamı 37 ° C'lik bir inkübatörde 30 dakika boyunca önceden ısıtın.
2. Malzeme Tablosunda listelenen ve Ek Şekil 2'de gösterilen kasılma fonksiyonu platform bileşenlerini, derin kırmızı (590 nm) filtreli ters çevrilmiş bir mikroskopla titreşim önleyici bir tablo (Ek Şekil 2A-1) ve bir CCD denetleyicisine bağlı CCD kamerayı (Ek Şekil 2A-4) içeren temel bileşenlere özel dikkat göstererek açın (Ek Şekil 2A-5 ve Ek Şekil 2C-5) ve bir PC bilgisayarla entegre edilmiştir (Ek Şekil 2B-14).
3. Boruyu peristaltik pompaya monte edin (Ek Şekil 2A-8; Ek Şekil 2A-8), önceden ısıtılmış jel paketini tüp tutucuya aktarın (Ek Şekil 2A-9) ve vakumu açın (Ek Şekil 2A-11) ve hücre uyarıcısına güç (Ek Şekil 2B-13).
4. Yalıtımlı tüp tutucusuna ortam içeren 50 mL'lik bir tüp yerleştirin (Ek Şekil 2A-9) ve peristaltik pompa borusundan ~ 0,5 mL / dak'da perfüzyona başlayın (Ek Şekil 2E-8).
5. Küçük bir tartım teknesine (~2 mL) az miktarda önceden ısıtılmış ortam ekleyin. Miyositler içeren bir CS'yi stimülasyon odasından tartım teknesine aktarın. %5 CO₂ inkübatöründe stimülasyon odasını 37 °C'ye geri döndürün.
6. CS'yi tartım teknesinden çıkarın ve alt tarafı nazikçe silin. CS'yi yeni yağlanmış bir CS odasına aktarın (Ek Şekil 2A, F-10; siyah ok) ve CS'ye nazikçe bir damla ortam (~ 200 μL) ekleyin.
7. CS'nin üzerine bir platin elektrot montajı yerleştirin (Ek Şekil 2F; gri ok) ve forseps kullanarak üstüne yeni bir CS yerleştirin. CS sandviçinin üzerine bir üst montaj (Ek Şekil 2F; beyaz ok) yerleştirin ve ardından haznenin montajını bitirmek için iki veya dört #0 pan başlı vida takın.
8. Medya pompa borusu boyunca mevcut olduğunda, boruyu ön ısıtıcıya takın ve ardından ön ısıtıcıyı adım 2.7'de monte edilen CS odasına bağlayın. Perfüzyona 0,5 mL / dak'da başlayın ve sızıntı olmadığından emin olmak için odanın altına bir mendil mendil yerleştirin.
9. CS odasını sahne alanı adaptörüne yerleştirin. Perfüze edilmiş ortam, odanın karşı ucunda, bir vakum sistemine bağlı boru ile toplanır. Isıtma sistemini açın (Ek Şekil 2A, D-7) ve 37 ° C'lik sabit bir ortam sıcaklığı elde etmek için odayı, hedefi ve ön ısıtıcıyı ~ 5-10 dakika boyunca dengeleyin. Bu denge süresi boyunca mikroskopta 40x suya daldırma hedefi ile miyositleri görselleştirin.
10. Voltajı, çubuk şeklindeki hücrelerin% 80'inin büzülmesi için gereken ayarın 1.5 katına ayarlayarak pacing stimülatörü etkinleştirin (Ek Şekil 2B-13), tipik olarak 35-40 V. Kasılma fonksiyonunu ve miyosit sağkalımını optimize etmek için stimülasyon frekansını 0.2 Hz'ye ayarlayın.
11. Sürekli perfüze edilmiş ve tempolu miyositlerden kontraktil kısalma ve yeniden uzatma izlerini toplayın. Kısaltma ölçümlerini toplamak için, bir CCD denetleyicisine bağlı bir CCD kamera (Ek Şekil 2A-4) (Ek Şekil 2B-5,C) ve G/Ç denetleyici kartına sahip özel bir bilgisayar kullanın (Ek Şekil 2B-14; bkz. Platform, sıçan miyositlerinde sarkomer kısalmasını ölçer, ancak benzer sonuçlar miyositlerin uzunlamasına kenarlarından toplanan miyosit ölçümlerinden elde edilir (^bkz.
12. Sarkomer kısaltma izlerini toplamak için, bilgisayarda yazılımı açın, Tamam'ı seçin ve ardından Dosya Yeni>. Sarcomere Uzunluğu > İzlemeler > Kullanıcı Sınırlarını Düzenle'yi seçip ardından genellikle 2,0 μm ile 1,5 μm arasında olan maksimum ve minimum değerleri ayarlayarak bir ekran şablonu hazırlayın. Miyositlerde ölçüm yapmadan önce CCD kamerayı 0,01 mm gratikül ile kalibre edin (Şekil 1D).
13. Sarkomer uzunluğu izlerini kaydetmek için Dosya > Yeni'yi seçin. Kasılma yapan bir miyositi tanımlayın ve miyositi kameranın uzunlamasına ekseni boyunca konumlandırın, böylece çizgilenme paterni dikey olur (Şekil 1B).
14. İlgi alanı (ROI) kutusunu (pembe kutu) miyositin üzerine yerleştirmek için bilgisayar faresini kullanın (Şekil 1C). Kasılma işlevini kaydetmek için Topla ve Başlat'ı seçin. Düşük stimülasyon frekanslarında (≤0.5 Hz) her miyositten 60 s kısalmayı kaydedin.
15. CS başına 5-10 hücreden sarkomer kısalmasını kaydedin. Çalışmalar agonistler / antagonistlerle tedaviyi içeriyorsa, 1 hücre / CS'de ölçümler yapın. Önceden ısıtılmış ayrı bir ortam ve çok kanallı bir peristaltik pompaya yüklenen farklı, özel bir perfüzyon borusu parçası hazırlayın ve 2.9.-2.14 adımlarını izleyin. ilaç veya nörohormon iletiminin miyosit kontraktil fonksiyonu üzerindeki etkisini ölçmek.
16. Bir frekans aralığında kısalmayı ölçmek için,^5'i kaydetmeden önce kararlı durum kısalması elde etmek için her frekansta miyositleri hızlandırın. Bu çalışmalar için, perfüzyon hızını iki katına çıkarın ve 0.2 Hz ve 2 Hz aralığındaki frekanslar için tutarlı kararlı durum kontraktil yanıtları elde etmek için yeni bir frekansta stimülasyondan sonra 15-20 s kaydetmeye başlayın. tipik olarak, verilen stimülasyon frekansları aralığında kısaltmak için en fazla 2 miyosit / CS kaydedin.
17. Kayıtları analiz ederken güvenilir sinyal ortalamalı veriler elde etmek için en az 7 kasılma/hücre kaydedin (bkz. adım 3.).

3. İzole miyositlerde kontraktil fonksiyonun veri analizi

1. Başlamak için Dosya'yı seçin, kaydedilmiş bir izleme seçin ve ardından Aç'ı seçin. Temel izlemenin Sekme 1'ini (sol taraf) seçin ve ardından izlemenin üst kısmındaki sarı paneli Sarc Uzunluğu olarak ayarlayın. İzlemeler'i ve adım 2.12'de hazırlanan ekran şablonunu seçin.
2. Bir analiz şablonu hazırlamak için, t0'ın Tanımı kutusunda İşlemler, Monotonik Geçici Analiz Seçenekleri, TTL Olay İşareti'ni ve menüden aşağıdaki seçenekleri seçin: Temel (dinlenme sarkomer uzunluğu), t0'a göre kalkış hızı (dep v), Tepe (tepe yüksekliği ve %tepe yüksekliği/taban çizgisi veya bl%peak h), tPeak'e göre dönüş hızı (ret v), t0 kullanarak Zirveye Ulaşma Süresi %50 (TTP %50) ve tPeak kullanarak Taban Çizgisine Kadar Olan Süre %50 (TTR_%50). Şablonlar > Analiz Şablonunu tanımlayıcıyla kaydet'i seçerek bu analiz seçeneklerini kaydedin. Her izlemeyi çözümlemeden önce bu çözümleme şablonunu yükleyin.
3. Veri analizine başlamak için İşaretler > Kapısı'nı seçin > Olay İşareti > Analiz Aralığından Geçici > Dönüştür Ekle'yi seçin. Şimdi 0,2 Hz'de tempolu miyositler için -0,01 s ile 1,20 s arasında zaman aralığını ayarlayın (Şekil 2A, ham izin alt kısmındaki kırmızı işaretler). Daha yüksek frekanslarda uyarılan miyositler için daha kısa bir zaman aralığı seçin.
4. İşlemler > Ortalama Olaylar'ı seçerek sinyal ortalamalı bir izleme oluşturun. Sinyal ortalamalı bir kayıt, orijinal temel izlemenin altında görünür.
5. Sinyal ortalaması alınan izlemenin (ekranın sol tarafı) Sekme 1'ini seçin ve ardından üst menüden İşaretler'i ve ardından Geçici Ekle'yi seçin. Sinyal ortalamalı görüntüleme panelinde temel sarkomer uzunluğu, tepe yüksekliği, bl%peak h, dep v, ret v, TTP %50 ve TTR_%50 için sinyal ortalaması değerlerini görüntülemek üzere üst menüden İşlemler'i ve Monotonik Geçici Analiz'i seçin.
6. Her sarkomer geçici analizini, Pano Akımı > Monotonik Geçici Analizi Dışa Aktar'ı seçerek çoklu miyositlerin kompozit analizi > bir elektronik tabloya aktarın. Her izleme için bu verileri e-tabloya yapıştırın.
7. Sinyal ortalamalı izlemeyi kopyalamak için, Geçerli İzleme > Pano > Seçenekleri> Dışa Aktar'ı seçin ve ondalık basamakları 5 olarak ayarlayın, ardından Sekmeler Sınırlayıcısı'nı seçin ve Tamam'ı ve Tamam'ı tıklatın. Her miyosit kaydı için sinyal ortalamalı izleri ikinci bir elektronik tabloya yapıştırın.

4. Sıçan yetişkin kardiyak miyositlerinde Ca²⁺ geçicilerinin kaydedilmesi

1. Ca 2+ geçicilerini ölçmeden önce, adım 2.2.'de açıklanan platform bileşenlerini ek floresan görüntüleme bileşenleriyle birlikte açın (Malzeme Tablosundaki Ca ²⁺ görüntüleme analizi için ek bileşenlere bakın; Ek Şekil 2A-5,6; 2B-12).
2. Dimetilsülfoksit (DMSO) içinde 1 mM Fura-2AM artı 0.5 M probenecid içeren Fura-2AM stok çözeltisini hazırlayın. Probenecid, Fura-2AM sızıntısı^15'i en aza indirir.
3. Stok çözeltisini, 6 delikli bir plakanın bir kuyucuğunda 2,5 mL ortamda 5 μM Fura-2AM ve 2,5 mM probenecid'e kadar seyreltin (bkz. Plakadaki üç ek kuyucuğa tek başına 2,5 mL ortam ekleyin (Fura-2AM yok), plakayı alüminyum folyo ile örtün ve ortamı önceden 37 ° C'ye ısıtın.
4. Pacing odasından Fura-2AM içeren kuyuya miyosit içeren bir CS aktarın, örtün ve plakayı 4 dakika boyunca% 5 CO₂ ile 37 ° C inkübatöre geri koyun. Perfüzyon pompasına boru monte edin ve adım 2.4'te açıklandığı gibi Fura-2AM yükleme süresi boyunca medya ile perfüze edin.
5. Floresan fotobeyazlatmayı azaltmak ve floresan sinyalini optimize etmek için oda ışıklarını kapatın veya en aza indirin. 6 delikli plakayı inkübatörden çıkarın ve ardından CS'yi yalnızca ortam içeren üç kuyucuğun her birinde 10 s yıkayın. CS'yi önceden ısıtılmış ortam içeren küçük bir tartım teknesine aktarın (Fura-2AM eklenmemiştir).
6. CS'nin alt tarafını nazikçe sildikten sonra CS'yi yeni yağlanmış CS odasına monte edin. CS'ye nazikçe bir damla ortam ekleyin ve ardından elektrot montajını CS üzerine monte edin, ardından ikinci bir CS ve üst montaj yapın. Adım 2.6.-2.7'de açıklandığı gibi, hücre odasını monte etmeyi bitirmek için #0 pan başlı vidaları kullanın.
7. Ortamla doldurulmuş pompa borusunu ön ısıtıcıya bağlayın, ön ısıtıcıyı CS odasına bağlayın ve adım 2.8'de açıklandığı gibi bir sahne adaptörüne yerleştirin. Ortamı vakum boru sistemi ile toplayın ve 2.8.-2.9 adımlarında açıklandığı gibi odayı 37 ° C'ye dengelemek için ısıtma sistemini açın (Ek Şekil 2A, D-7).
8. Adım 2.10'da açıklandığı gibi 35-40 V ve 0,2 Hz'ye ayarlanmış hız uyarıcısını (Ek Şekil 2B-13) etkinleştirin.
9. Ca²⁺ geçici kayıt yapmadan önce, klavyeyi görmenize yardımcı olması için bilgisayar klavyesinin yanına monte edilmiş küçük bir el fenerini veya kitap ışığını açın. Ek olarak, floresan arka planını kardiyak miyositlerin olmadığı bir alanda kaydedin. Başlamak için, adım 2.12'de açıklandığı gibi Dosya > Başlat > Yeni'yi seçin.
10. Bir YG seçin ve ham pay için bir sekme (veya izleme çubuğu, sol taraf) ve ham payda için her sekmenin üst merkezinde tanımlanan ikinci bir sekme ayarlayın. Arka planı 10-20 s için kaydedin. Ham sinyal ortalamasına sahip pay ve payda değerlerini elde etmek için fareyi sağ tıklatın ve bir izleme çubuğu panelinin üzerine sürükleyin. İşlemler > sabitlerini seçerek bu değerleri girin ve ham değerleri girin.
11. Hem kısaltma hem de Ca²⁺ geçicileri toplamak için yeni bir ekran şablonu hazırlayın. Sarkomer uzunluğu için Sekme 1'i seçin ve adım 2.13'te açıklandığı gibi aynı işlemi kullanın. Ca²⁺ görüntüleme için, genellikle 1 ile 5 arasında ayarlanan oran için minimum ve maksimum düzeyleri ayarlamak üzere Sekme 2 > Oranı (sekmenin üst ortası) > İzlemeler > Kullanıcı Sınırlarını Düzenle'yi seçin. 3. ve 4. sekmelerin (sol taraf) payda ve payda aralıklarını tanımlamak için aynı işlemi kullanın.
12. Adım 2.14'te açıklandığı gibi bir ROI kutusunu miyosit görüntüsünün üzerine yerleştirin. Dosya > New > Collect'i seçin. Şimdi kısaltma ve ratiometric Ca²⁺ verilerini toplamak için Başlat'ı seçin. Sinyal ortalamalı analiz için ≥7 kasılma/hücre kaydedin.
13. Adım 4.10'da açıklanan arka plan izleme kaydını yineleyin. 2-4 miyosit kaydettikten sonra. Tipik olarak, arka plan okumasında önemli değişiklikler varsa, 4-5 miyosit / CS veya daha az miyosit kaydedin.

5. İzole miyositlerde Ca²⁺ geçicilerinin veri analizi.

1. Analiz için istediğiniz dosyayı açın ve kısaltma için Şablonlar > Ekran Şablonu artı Ca²⁺ geçicileri seçin. Ardından, sırasıyla sarkomer uzunluğunu ve Ca 2+ oranını göstermek için sekme 1 ve^2'yi (solda) seçin. İşlemler > Sabitleri'ni seçin ve Ca²⁺ arka plan izlemesinden pay ve payda değerlerini girin.
2. Kısaltma için analiz şablonları ve Ca²⁺ geçici veriler hazırlayın. Sekme 1'i (sol taraf) seçin ve adım 3.2'de açıklandığı gibi aynı işlemi kullanın. Sarkomer uzunluk analizi şablonunu ayarlamak için.
3. Sekme 2'yi (sol taraf) seçin ve t0 tanımı kutusunda İşlemler, Monotonik Geçici Analiz Seçenekleri, TTL olay işaretini ve menüden aşağıdaki seçenekleri seçin: Temel (bazal oran), t0'a göre kalkış hızı (dep v), Tepe (tepe yüksekliği ve %tepe yüksekliği/taban çizgisi veya bl%peak h), tPeak'e göre bozunma hızı (ret v), t0 kullanarak Zirveye Ulaşma Süresi %50 (TTP %50) ve tPeak kullanarak Taban Çizgisine Kadar Olan Süre %50 (TTR_%50). Şablonlar ve Analiz Şablonunu yeni bir tanımlayıcı adı kullanarak Kaydet'i seçerek bu analiz seçeneklerini kaydedin. Her izlemeyi çözümlemeden önce bu çözümleme şablonunu yükleyin.
4. Adım 3.3.-3.6'da açıklandığı gibi aynı işlemi kullanın. sinyalin ortalamasını almak ve ardından sarkomer uzunluğunu analiz etmek, ardından Ca^{2 +} geçicileri için aynı adımları izlemek. Sarkomer uzunluğu ve Ca²⁺ geçici oran izi için ayrı işaretler ayarlayın.

Sonuçlar

Kontraktil fonksiyon çalışmaları, sıçan miyositleri üzerinde izolasyondan sonraki günden (2. gün) başlayarak izolasyondan 4 gün sonrasına kadar yapılır. Miyositler izolasyondan sonraki gün (yani 2. gün) kaydedilebilse de, gen transferinden veya kasılma fonksiyonunu değiştirmek için tedavilerden sonra genellikle daha uzun kültür süreleri^{gereklidir 8}. İzolasyondan sonra 18 saatten fazla kültürlenen miyositler için, bölüm 1'de açıklanan pacing protokolü, t-tübüllerin...

Tartışmalar

Adım 1'de özetlenen kronik pacing protokolü, izole miyositleri incelemek ve daha uzun tedavilerin etkisini değerlendirmek için yararlı süreyi uzatır. Laboratuvarımızda kronik tempolu miyositlerde sarkomer uzunluğu kullanılarak kontraktil fonksiyon ölçülürken izolasyondan 4 gün sonrasına kadar tutarlı sonuçlar elde edilmiştir. Bununla birlikte, miyositleri hızlandırmak için 1 haftadan daha eski medya kullanıldığında miyosit kontraktil fonksiyonu hızla bozulur.

Kası...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEDIA
Bovine serum albumin	Sigma (Roche)	3117057001	Final concentration = 0.2% (w/v)
Glutathione	Sigma	G-6529	Final concentration = 10 mM
HEPES	Sigma	H-7006	Final concentration = 15 mM
M199	Sigma	M-2520	1 bottle makes 1 L; pH 7.45
NaHCO3	Sigma	S-8875	Final concentration = 4 mM
Penicillin/streptomycin	Fisher	15140122	Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin
REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Fura-2AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	50 μg/vial;  Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;  Final Fura2-AM concentration in media is  5 μM
Probenicid	Invitrogen (Fisher)	P36400	Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM
MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING
#1 22  mm2 glass coverslips	Corning	2845-22
3 x 36 inch cables with banana jacks	Pomona Electronics	B-36-2	Supplemental Figure 1, panel C
37oC Incubator  with 95% O2:5% CO2	Forma	3110	Supplemental Figure 1, panel E.  Multiple models are appropriate
Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp	Forma	1286	Multiple models are appropriate
Forceps - Dumont #5 5/45	Fine Science Tools	11251-35
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	1800-45
Low magnification inverted microscope	Leica	DM-IL	Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes;  4X and 10X objectives recommended
Pacing chamber	Custom		Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22
Stimulator	Ionoptix	Myopacer	Supplemental Figure 1, panel D.
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS			ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options
Additional components for Ca2+ imaging analysis	Ionoptix	Essential system components: -- Photon counting system            --  Xenon power supply with dual excitation light source            --  Fluorescence interface	- The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera  (panel A #4).                                                                      - The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm  excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.                                                                                                                                 - The fluorescence interface between the computer and  light source is shown in panel B, #12.
CCD camera with image acquisition  hardware and software (240 frames/s)	Ionoptix	Myocam with CCD controller	Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4  and  panel A #5 & panel C #5 (right), respectively.  The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).
Chamber stimulator	Ionoptix	Myopacer	Panel B, #13; Alternative:  Grass model S48
Coverslip mounted perfusion chamber	Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws  (arrow, panel F)		Panel A #10 & panel F;   Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).  Commercial alternatives:  Ionoptix FHD or C-stim cell  chambers; Cell MicroControls culture stimulation system
Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients	Ionoptix	PC with Ionwizard PC board and software	Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric  Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. - A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.  The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).
Forceps - Dumont #5 TI	Fine Science Tools	11252-40	Panel F
Insulated tube holder for media	Custom		Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm
Inverted brightfield microscope	Nikon	TE-2000S	Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.   A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.
Isolator Table	TMC Vibration Control	30 x 36 inches	Panel A, #1; Desirable:  elevated shelving, Faraday shielding
Microscope eyepieces & objective	Nikon	10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective	Panel A #3; 40X objective:  n.a. 0.08; w.d. 2 mm.  A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).          NOTE:  water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls 3	Panel A #8 and panel E
small weigh boat	Fisher	08-732-112
Temperature controller	Cell MicroControls	TC2BIP	Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.    A preheater and objective heater are recommended for this platform.  A Cell MicroControls HPRE2 preheater and  HLS-1 objective heater are controlled  by the TC2BIP temperature controller for our studies.
Under cabinet LED light with motion sensor	Sylvania	#72423 LED light	Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..  Alternative:  A clip on flashlight/book light with flexible neck - multiple suppliers are available.
Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter	Fisher	Tygon tubing - E363;  polypropylene Ehrlenmeyer flask - 10-182-50B; Vacuum filter - 09-703-90	Panel A #11