啮齿动物心肌细胞心脏收缩功能障碍和Ca2+ 瞬变分析

摘要

提出了一组协议，描述了通过肌节长度检测以及钙（^{Ca 2+}）瞬时测量在分离的大鼠肌细胞中测量收缩功能。这种方法在心力衰竭动物模型中的应用也包括在内。

摘要

收缩功能障碍和Ca²⁺ 瞬变通常在细胞水平上进行分析，作为心脏诱导损伤和/或重塑综合评估的一部分。评估这些功能改变的一种方法是在原发性成人心肌细胞中使用卸载缩短和Ca²⁺ 瞬时分析。对于这种方法，通过胶原酶消化分离成体肌细胞，使其具有^{Ca 2+} 耐受性，然后粘附在层粘连蛋白包被的盖玻片上，然后在无血清培养基中进行电起搏。一般方案利用成年大鼠心肌细胞，但可以很容易地调整来自其他物种的原代肌细胞。受伤心脏肌细胞的功能改变可以与假心肌细胞和/或 体外 治疗进行比较。该方法包括肌细胞起搏所需的基本要素，以及细胞室和平台组件。这种方法的详细协议包括通过肌节长度检测测量空载缩短和使用比率指示剂Fura-2 AM测量的细胞Ca²⁺ 瞬变以及原始数据分析的步骤。

引言

心脏泵功能分析通常需要一系列方法来获得足够的洞察力，特别是对于心力衰竭（HF）的动物模型。超声心动图或血流动力学测量可深入了解体内心功能不全¹，而体外方法通常用于确定功能障碍是否由肌丝和/或负责将激发或动作电位与收缩功能偶联的 Ca²⁺ 瞬变（例如，激发-收缩 [E-C] 耦合）引起的。体外方法还提供了在寻求昂贵和/或费力的体内治疗^{策略之前筛选}对神经激素、载体诱导的遗传改变以及潜在治疗剂的功能反应的机会2。

有几种方法可用于研究体外收缩功能，包括完整小梁³ 或透化肌细胞⁴ 中的力测量，以及在存在和不存在 HF^5，6 的情况下完整肌细胞中的卸载缩短和 Ca²⁺ 瞬变。这些方法中的每一种都侧重于心肌细胞收缩功能，它直接负责心脏泵功能^2，7。然而，收缩和E-C偶联的分析最常通过测量分离的Ca 2+耐受成年肌细胞中的肌肉长度缩短和Ca²⁺瞬变来进行。实验室利用详细的已发布方案从大鼠心脏中分离出肌细胞进行此步骤⁸。

Ca²⁺ 瞬时和肌丝都有助于完整肌细胞的缩短和再延长，并可能导致收缩功能障碍^2，7。因此，当体外功能分析需要含有Ca²⁺循环机制和肌丝的完整肌细胞时，建议使用这种方法。例如，完整的分离肌细胞对于通过^{基因转移修饰}肌丝或Ca²⁺循环功能后研究收缩功能是理想的9。此外，在研究下游第二信使信号通路的影响和/或对^{治疗剂的反应}时，建议使用完整的肌细胞方法来分析神经激素的功能影响2。单个肌细胞中负荷依赖性力的替代测量最常在低温（≤15°C）膜透化（或蒙皮）后进行，以去除Ca²⁺瞬时贡献并关注肌丝功能¹⁰。完整肌细胞中负载依赖性力加上Ca²⁺瞬变的测量很少见，这主要是由于该方法¹¹的复杂性和技术挑战，特别是当需要更高的通量时，例如测量对神经激素信号的反应或作为治疗剂的筛选。心脏小梁的分析克服了这些技术挑战，但也可能受到非肌细胞、纤维化和/或细胞外基^{质重塑的影响}2。上述每种方法都需要含有成人肌细胞的制剂，因为新生儿肌细胞和来源于诱导多能干细胞（iPSC）的肌细胞尚未表达成人肌丝蛋白的全部补^体，并且通常缺乏成人杆状肌细胞中存在的肌丝组织水平2。迄今为止，iPSCs的证据表明，在培养物中，向成体亚型的完全过渡超过134天¹²。

鉴于本系列的重点是HF，这些协议包括区分衰竭与非衰竭完整肌细胞收缩功能的方法和分析。代表性的例子来自在肾上缩窄后18-20周研究的大鼠肌细胞^，如前所述5^，13。然后与假处理的大鼠的肌细胞进行比较。

此处描述的协议和成像平台用于分析和监测HF发展过程中杆状心肌细胞中缩短和Ca²⁺ 瞬变的变化。对于该分析，将2 x 10⁴ Ca 2+耐受的杆状肌细胞接种在^{22mm 2} 层粘连蛋白涂层玻璃盖玻片（CSs）上并培养过夜，^如前所述8。材料 表中提供了为该成像平台组装的组件，以及用于最佳成像的培养基和缓冲液。此处还提供了使用软件进行数据分析的指南和代表性结果。整个方案分为单独的子部分，前三个部分侧重于分离的大鼠肌细胞和数据分析，然后是细胞^{Ca 2 +} 瞬时实验和肌细胞数据分析。

研究方案

对啮齿动物进行的研究遵循公共卫生服务关于人道护理和使用实验动物的政策，并获得了密歇根大学机构动物护理和使用委员会的批准。在这项研究中，从体重≥200g⁵的3-34个月大的Sprague-Dawley和F344BN大鼠中分离出肌细胞。使用男性和女性比率。

1. 肌细胞起搏用于收缩功能研究

1. 为每组分离的肌细胞制作新鲜的基于M199的培养基（材料表）。起搏前 1 天，在 22 mm 2 层粘连蛋白涂层玻璃盖玻片 （CS） 上板² x 10^{4 Ca 2+} 耐受的杆状肌细胞，如前所述⁸.
2. 为了准备腔室，将每个腔室浸泡在10%漂白剂中1小时。然后，用自来水冲洗腔室30-45分钟，然后每5分钟更换一次蒸馏水30分钟，然后每5分钟更换一次去离子水30分钟，最后用去离子水冲洗。
3. 在干净的表面上干燥腔室20-30分钟（补充图1A-C）。接下来，在生物安全柜中对每个方向的腔室进行5分钟的紫外线处理（总= 20分钟）。预灭菌室不需要此步骤。
   注意:离开该区域以尽量减少紫外线照射。
4. 从腔室中取下盖子，向每个孔中加入3mL基于M199的培养基（参见 材料表）（补充图1B），更换盖子，并在37°C培养箱中预热腔室，其中CO₂ 和20%O₂。
5. 在250°C的热珠灭菌器中灭菌镊子20-25秒。将预热的刺激室从培养箱转移到生物安全柜。
6. 使用无菌镊子将含有心肌细胞的每个盖玻片（CS）转移到刺激室中的单个孔中。一次转移四个CS，然后在转移剩余的四个CS之前加热10分钟以保持介质温度。
7. 将香蕉千斤顶连接到一端的刺激室（补充图1C）和另一端的刺激器（补充图1D）。
8. 将刺激器频率设置为0.2 Hz并设置电压（~12 V）以实现孔内所有杆状心肌细胞的~10%-20%的收缩。要确定收缩肌细胞的数量，请将腔室置于放大倍率为4倍至10倍的倒置显微镜下。
9. 将刺激室置于37°C的5%CO₂ 培养箱中（补充图1E）。使用在37°C，5%CO₂ 培养箱中预热的培养基每12小时更换培养基20-25分钟。继续电刺激长达3天，每12小时更换一次培养基。

2.成年大鼠心肌细胞收缩功能分析

1. 实验前在37°C培养箱中预热凝胶包和培养基30分钟。
2. 打开材料表中列出的收缩功能平台组件，并显示在补充图2中，特别注意关键组件，其中包括带有倒置显微镜的防振台（补充图2A-1），带有深红色（590 nm）滤光片的倒置显微镜（补充图2A-2，3）和连接到CCD控制器的CCD相机（补充图2A-4）（补充图2A-5和 补充图2C-5）并与PC计算机集成（补充图2B-14）。
3. 将管路组装到蠕动泵中（补充图2A-8;补充图2A-8），将预热的凝胶包转移到管支架中（补充图2A-9），并打开真空（补充图2A-11）和细胞刺激器的电源（补充图2B-13）。
4. 将装有培养基的 50 mL 管放入绝缘管支架中（补充图 2A-9），并以 ~0.5 mL/min 的速度通过蠕动泵管开始灌注（补充图 2E-8）。
5. 将少量预热培养基加入小称量舟（~2 mL）中。将一个含有肌细胞的CS从刺激室转移到称重船上。将刺激室返回到5%CO₂ 培养箱中的37°C。
6. 从秤船上取下 CS，轻轻擦拭底部。将CS转移到新润滑的CS室（补充图2A，F-10;黑色箭头）中，并在CS上轻轻添加一滴培养基（~200μL）。
7. 将铂电极支架放在CS上（补充图2F;灰色箭头），并使用镊子在顶部放置一个新的CS。在CS三明治上放置一个顶部安装座（补充图2F;白色箭头），然后安装两个或四个#0盘头螺钉以完成腔室的组装。
8. 一旦介质存在于整个泵管中，将管子连接到预热器，然后将预热器连接到步骤2.7中组装的CS室。以 0.5 mL/min 的速度开始灌注，并在腔室下方放置纸巾擦拭以确保没有泄漏。
9. 将CS室放入载物台适配器中。灌注介质收集在腔室的另一端，管道连接到真空系统。打开加热系统（补充图2A，D-7）并平衡腔室，物镜和预热器~5-10分钟，以实现37°C的恒定介质温度。 在此平衡时间内，在显微镜上使用40倍水浸物镜可视化肌细胞。
10. 通过将电压设置为80%杆状细胞收缩所需设置的1.5倍（通常为35-40 V）来激活起搏刺激器（补充图2B-13）。 将刺激频率设置为0.2 Hz以优化收缩功能和肌细胞存活。
11. 从连续灌注和起搏的肌细胞中收集收缩缩短和重新延长的痕迹。要收集缩短测量值，请使用连接到CCD控制器的CCD相机（补充图2A-4）（补充图2B-5，C）和带有I / O控制器板的专用计算机（补充图2B-14;参见 材料表）。该平台测量大鼠肌细胞中的肌节缩短，尽管从肌细胞纵向边缘收集的肌细胞测量获得了类似的结果（参见Ecklerle等人¹⁴）。
12. 若要收集肌节缩短痕迹，请在计算机上打开软件，选择" 确定"，然后选择" 新建>文件"。通过选择 "跟踪>编辑用户限制">肌节长度 ，然后设置最大值和最小值（通常介于 2.0 μm 和 1.5 μm 之间）来准备屏幕模板。在对肌细胞进行测量之前，用0.01 mm刻度网校准CCD相机（图1D）。
13. 要记录肌节长度轨迹，请选择 "文件>新建"。识别收缩的肌细胞并沿相机的纵轴定位肌细胞，使条纹模式垂直（图1B）。
14. 使用计算机鼠标将感兴趣区域（ROI）框（粉红色框）放在肌细胞上（图1C）。选择收集并开始记录收缩功能。在低刺激频率（≤0.5 Hz）下记录每个肌细胞缩短60秒。
15. 记录每个CS5-10个细胞的肌节缩短。 如果研究包括激动剂/拮抗剂治疗，则在1细胞/ CS下进行测量。准备单独的预热介质和装载在多通道蠕动泵中的不同专用灌注管，并按照步骤2.9.-2.14进行操作。测量药物或神经激素递送对肌细胞收缩功能的影响。
16. 为了测量一系列频率的缩短，在每个频率下起搏肌细胞，以便在记录⁵之前获得稳态缩短。对于这些研究，将灌注速率加倍，并在刺激后 15-20 秒以新的频率开始记录，以获得 0.2 Hz 和 2 Hz 范围内频率的一致稳态收缩响应。 通常，记录不超过 2 个肌细胞/CS，以便在给定的刺激频率范围内缩短。
17. 在分析记录时，记录至少7次收缩/细胞以获得可靠的信号平均数据（参见步骤3）。

3.分离肌细胞收缩功能的数据分析

1. 若要开始，请选择" 文件"，选择记录的跟踪，然后选择" 打开"。选择基本迹线的 选项卡 1 （左侧），然后将迹线顶部的黄色面板设置为 Sarc-Length。选择 "跟踪 "和在步骤 2.12 中准备的屏幕模板。
2. 要准备分析模板，请在 t0 的定义框中选择 操作、单调瞬态分析选项、TTL 事件标记 ，以及菜单中的以下选项:基线（静息肌节长度）， 相对于 t0 的偏离速度 （dep v）， 峰值（峰高和 %峰高/基线或 bl%峰 h）， 相对于 tPeak 的返回速度 （ret v）， 使用 t0 达到峰值的时间 50% （TTP 50_%），使用 tPeak 达到基线的时间 50% （TTR_50%）。通过选择模板>使用标识符 保存分析模板 来保存这些分析选项。在分析每个跟踪之前加载此分析模板。
3. 要开始数据分析，请选择 门>标记>添加瞬态>从事件标记>分析范围转换。现在将肌细胞以0.2 Hz的速度设置为-0.01 s至1.20 s的时间范围（图2A，原始迹线下部的红色标记）。为以较高频率刺激的肌细胞选择较短的时间范围。
4. 通过选择" 操作">"平均事件"来生成信号平均跟踪。信号平均记录显示在原始基迹线下方。
5. 选择信号平均迹线的选项卡 1（屏幕左侧），然后在上方菜单中选择"标记"，然后选择"添加瞬态"。从顶部菜单中选择操作和单调瞬态分析，以在信号平均显示面板中显示基线肌节长度、峰高、bl%峰h、dep v、ret v、TTP 50%和TTR_50%的信号平均值。
6. 通过选择导出 >单调瞬态分析>剪贴板电流，将每个肌节瞬态分析传输到电子表格，以便对多个肌细胞进行复合分析。将此数据粘贴到每个跟踪的电子表格中。
7. 要复制信号平均迹线，请选择" >剪贴板>选项导出当前迹线> 并将小数位数设置为 5，然后选择 制表符分隔符 ，然后单击确定和 确定"。将每个肌细胞记录的信号平均迹线粘贴到第二个电子表格中。

4. 记录大鼠成年心肌细胞中的 Ca²⁺ 瞬变

1. 在测量Ca 2+瞬变之前，打开步骤2.2.中描述的平台组件以及其他荧光成像组件（参见材料表中用于Ca²⁺成像分析的其他组件;补充图2A-5，6; 2B-12）。
2. 制备含有 1 mM 呋喃-2AM 加 0.5 M 丙磺舒的二甲基亚砜 （DMSO） 储备溶液。丙磺舒最大限度地减少了 Fura-2AM 泄漏¹⁵.
3. 将储备溶液稀释至 5 μM Fura-2AM 和 2.5 mM 丙磺舒在 2.5 mL 培养基中（参见 材料表）在 6 孔板的一个孔中。将 2.5 mL 培养基单独（无 Fura-2AM）加入板中的另外三个孔中，用铝箔覆盖板，并将培养基预热至 37 °C。
4. 将含有肌细胞的CS从起搏室转移到含有Fura-2AM的孔中，盖上盖子，并将板返回到具有5%CO₂ 的37°C培养箱中4分钟。在Fura-2AM加载期间将管道安装在灌注泵中并灌注介质，如步骤2.4中所述。
5. 关闭或最小化室内灯，以减少荧光光漂白并优化荧光信号。从培养箱中取出6孔板，然后在仅包含培养基的三个孔中的每一个中洗涤CS10秒。将CS转移到装有预热介质的小称重船上（未添加Fura-2AM）。
6. 轻轻擦拭CS的底部后，将CS安装到刚润滑的CS室中。 轻轻地向CS中加入一滴介质，然后将电极支架组装在CS上，然后是第二个CS和顶部安装座。使用 #0 盘头螺钉完成电池室的组装，如步骤 2.6.-2.7 中所述。
7. 将装满介质的泵管连接到预热器，将预热器连接到CS室，并放入载物台适配器中，如步骤2.8中所述。用真空管系统收集介质并打开加热系统（补充图2A，D-7）以将腔室平衡至37°C，如步骤2.8.-2.9中所述。
8. 激活设置为35-40 V和0.2 Hz的起搏刺激器（补充图2B-13），如步骤2.10中所述。
9. 在记录 Ca²⁺ 瞬态之前，请打开安装在计算机键盘附近的小手电筒或书灯以帮助查看键盘。此外，在没有心肌细胞的区域记录荧光背景。若要开始，请选择" 文件>启动">"新建"，如步骤 2.12 中所述。
10. 选择一个 ROI，并为原始分子设置一个选项卡（或跟踪栏，左侧），为每个选项卡的上中心定义一个选项卡，为原始分母设置第二个选项卡。记录背景10-20秒。右键单击鼠标并在一个跟踪栏面板上拖动以获取原始信号平均分子和分母值。通过选择 "操作">"常量"来输入这些值，然后输入原始值。
11. 准备一个新的屏幕模板以收集起酥油和 Ca²⁺ 瞬态。对于肌节长度，请选择选项卡 1 并使用与步骤 2.13 中所述相同的过程。对于 Ca²⁺ 映像，请选择选项卡 2 >比率（选项卡的上中心）>跟踪>编辑用户限制"以 设置比率的最小和最大级别，通常设置在 1 到 5 之间。使用相同的过程定义选项卡 3 和 4（左侧）的分子和分母范围。
12. 将ROI框放置在肌细胞图像上，如步骤2.14中所述。选择 "文件>新建>收集"。现在选择 "开始" 以收集缩短和比率Ca²⁺ 数据。记录≥7次收缩/细胞进行信号平均分析。
13. 重复步骤 4.10 中所述的后台跟踪记录。记录2-4个肌细胞后。通常，如果背景读数有显着变化，则记录 4-5 个肌细胞/CS 或更少的肌细胞。

5.分离肌细胞中Ca²⁺瞬变的数据分析。

1. 打开所需的文件进行分析，然后选择 模板>屏幕模板 进行缩短以及Ca²⁺ 瞬变。接下来，选择选项卡 1 和 2（左）以分别显示肌节长度和 Ca²⁺ 比率。选择 "操作"> "常量"，然后输入 Ca²⁺ 背景迹线中的分子和分母值。
2. 准备用于缩短和Ca²⁺ 瞬态数据的分析模板。选择选项卡 1（左侧）并使用步骤 3.2 中所述的相同过程。以设置肌节长度分析模板。
3. 选择选项卡 2（左侧），然后在 t0 的定义框中选择 操作、单调瞬态分析选项、TTL 事件标记 以及菜单中的以下选项:基线（基础比）， 相对于 t0 的偏离速度 （dep v）， 峰值（峰高和峰高百分比/基线或 bl%峰 h）， 相对于 tPeak 的衰减速度 （ret v）， 使用 t0 达到峰值的时间 50% （TTP 50_%），使用 tPeak 达到基线的时间 50% （TTR_50%）。通过选择模板和使用新标识符名称保存分析 模板 来保存这些 分析 选项。在分析每个跟踪之前加载此分析模板。
4. 使用步骤 3.3.-3.6 中所述的相同过程。平均信号，然后分析肌节长度，然后对Ca²⁺ 瞬变执行相同的步骤。为肌节长度和 Ca²⁺ 瞬态比迹线设置单独的标记。

结果

从分离后的第二天（第2天）开始至隔离后4天对大鼠肌细胞进行收缩功能研究。虽然可以在分离后的第二天（即第2天）记录肌细胞，但在基因转移或处理后通常需要更长的培养时间以改变收缩功能⁸。对于分离后培养超过18小时的肌细胞，第1节中描述的起搏方案有助于维持T小管和一致的缩短和重新延长结果。

图 1A显示了含有用于缩短研...

讨论

步骤1中概述的慢性起搏方案延长了研究分离的肌细胞和评估长期治疗影响的有用时间。在我们的实验室中，当使用慢性起搏的肌细胞上的肌节长度测量收缩功能时，隔离后长达 4 天获得了一致的结果。然而，当使用超过 1 周的培养基来调整心肌细胞时，肌细胞收缩功能会迅速恶化。

对于收缩功能研究，数据在37°C下收集，这接近大鼠的体温。为了优化肌细胞活力并获得每个?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEDIA
Bovine serum albumin	Sigma (Roche)	3117057001	Final concentration = 0.2% (w/v)
Glutathione	Sigma	G-6529	Final concentration = 10 mM
HEPES	Sigma	H-7006	Final concentration = 15 mM
M199	Sigma	M-2520	1 bottle makes 1 L; pH 7.45
NaHCO3	Sigma	S-8875	Final concentration = 4 mM
Penicillin/streptomycin	Fisher	15140122	Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin
REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Fura-2AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	50 μg/vial;  Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;  Final Fura2-AM concentration in media is  5 μM
Probenicid	Invitrogen (Fisher)	P36400	Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM
MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING
#1 22  mm2 glass coverslips	Corning	2845-22
3 x 36 inch cables with banana jacks	Pomona Electronics	B-36-2	Supplemental Figure 1, panel C
37oC Incubator  with 95% O2:5% CO2	Forma	3110	Supplemental Figure 1, panel E.  Multiple models are appropriate
Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp	Forma	1286	Multiple models are appropriate
Forceps - Dumont #5 5/45	Fine Science Tools	11251-35
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	1800-45
Low magnification inverted microscope	Leica	DM-IL	Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes;  4X and 10X objectives recommended
Pacing chamber	Custom		Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22
Stimulator	Ionoptix	Myopacer	Supplemental Figure 1, panel D.
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS			ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options
Additional components for Ca2+ imaging analysis	Ionoptix	Essential system components: -- Photon counting system            --  Xenon power supply with dual excitation light source            --  Fluorescence interface	- The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera  (panel A #4).                                                                      - The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm  excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.                                                                                                                                 - The fluorescence interface between the computer and  light source is shown in panel B, #12.
CCD camera with image acquisition  hardware and software (240 frames/s)	Ionoptix	Myocam with CCD controller	Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4  and  panel A #5 & panel C #5 (right), respectively.  The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).
Chamber stimulator	Ionoptix	Myopacer	Panel B, #13; Alternative:  Grass model S48
Coverslip mounted perfusion chamber	Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws  (arrow, panel F)		Panel A #10 & panel F;   Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).  Commercial alternatives:  Ionoptix FHD or C-stim cell  chambers; Cell MicroControls culture stimulation system
Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients	Ionoptix	PC with Ionwizard PC board and software	Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric  Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. - A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.  The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).
Forceps - Dumont #5 TI	Fine Science Tools	11252-40	Panel F
Insulated tube holder for media	Custom		Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm
Inverted brightfield microscope	Nikon	TE-2000S	Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.   A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.
Isolator Table	TMC Vibration Control	30 x 36 inches	Panel A, #1; Desirable:  elevated shelving, Faraday shielding
Microscope eyepieces & objective	Nikon	10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective	Panel A #3; 40X objective:  n.a. 0.08; w.d. 2 mm.  A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).          NOTE:  water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls 3	Panel A #8 and panel E
small weigh boat	Fisher	08-732-112
Temperature controller	Cell MicroControls	TC2BIP	Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.    A preheater and objective heater are recommended for this platform.  A Cell MicroControls HPRE2 preheater and  HLS-1 objective heater are controlled  by the TC2BIP temperature controller for our studies.
Under cabinet LED light with motion sensor	Sylvania	#72423 LED light	Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..  Alternative:  A clip on flashlight/book light with flexible neck - multiple suppliers are available.
Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter	Fisher	Tygon tubing - E363;  polypropylene Ehrlenmeyer flask - 10-182-50B; Vacuum filter - 09-703-90	Panel A #11