Analyse der kardialen kontraktilen Dysfunktion und Ca2+ Transienten in Nagetiermyozyten

Zusammenfassung

Es wird eine Reihe von Protokollen vorgestellt, die die Messung der kontraktilen Funktion mittels Sarkomerlängendetektion zusammen mit der transienten Messung von Kalzium (Ca²⁺) in isolierten Rattenmyozyten beschreiben. Die Anwendung dieses Ansatzes für Studien in Tiermodellen der Herzinsuffizienz ist ebenfalls enthalten.

Zusammenfassung

Kontraktile Dysfunktion und Ca²⁺ Transienten werden häufig auf zellulärer Ebene als Teil einer umfassenden Bewertung von kardial-induzierten Verletzungen und / oder Umbauten analysiert. Ein Ansatz zur Beurteilung dieser funktionellen Veränderungen verwendet unbelastete Verkürzungs- und Ca²⁺ -Transientenanalysen in primären adulten kardialen Myozyten. Für diesen Ansatz werden adulte Myozyten durch Kollagenase-Verdauung isoliert, Ca²⁺ tolerant gemacht und dann an Laminin-beschichteten Deckgläsern haftet, gefolgt von elektrischem Pacing in serumfreien Medien. Das allgemeine Protokoll verwendet adulte Rattenherzmyozyten, kann aber leicht für primäre Myozyten anderer Spezies angepasst werden. Funktionelle Veränderungen in Myozyten verletzter Herzen können mit Scheinmyozyten und/oder mit In-vitro-Therapien verglichen werden. Die Methodik umfasst die wesentlichen Elemente, die für das Myozyten-Pacing benötigt werden, sowie die Zellkammer- und Plattformkomponenten. Das detaillierte Protokoll für diesen Ansatz umfasst die Schritte zur Messung der unbelasteten Verkürzung durch Sarkomerlängenerkennung und zelluläre Ca²⁺ -Transienten, die mit dem ratiometrischen Indikator Fura-2 AM gemessen wurden, sowie für die Rohdatenanalyse.

Einleitung

Die Analyse der Herzpumpenfunktion erfordert oft eine Reihe von Ansätzen, um adäquate Erkenntnisse zu gewinnen, insbesondere für Tiermodelle der Herzinsuffizienz (HF). Echokardiographie oder hämodynamische Messungen geben Einblick in die in vivo kardiale Dysfunktion¹, während häufig In-vitro-Ansätze verwendet werden, um festzustellen, ob eine Dysfunktion durch Veränderungen des Myofilaments und/oder des Ca²⁺ -Transienten, der für die Kopplung der Erregung verantwortlich ist, oder des Aktionspotentials mit kontraktiler Funktion (z. B. Anregung-Kontraktion [E-C] -Kopplung) entsteht. In-vitro-Ansätze bieten auch die Möglichkeit, die funktionelle Reaktion auf Neurohormone, vektorinduzierte genetische Veränderungen sowie potenzielle Therapeutika² zu untersuchen, bevor kostspielige und/oder mühsame In-vivo-Behandlungsstrategien verfolgt werden.

Zur Untersuchung der in vitro kontraktilen Funktion stehen mehrere Ansätze zur Verfügung, darunter Kraftmessungen in intakten Trabekeln³ oder permeabilisierten Myozyten⁴ sowie unbelastete Verkürzungen und Ca²⁺ Transienten in intakten Myozyten in Gegenwart und Abwesenheit von HF ^5,6. Jeder dieser Ansätze konzentriert sich auf die kontraktile Funktion der kardialen Myozyten, die direkt für die Herzpumpenfunktion verantwortlich ist ^2,7. Die Analyse sowohl der Kontraktion als auch der E-C-Kopplung zusammen wird jedoch am häufigsten durch Messung der Verkürzung der Muskellänge und Ca 2+ Transienten in isolierten, Ca²⁺ toleranten adulten Myozyten durchgeführt. Das Labor verwendet ein detailliertes veröffentlichtes Protokoll, um Myozyten aus Rattenherzen für diesen Schritt⁸ zu isolieren.

Sowohl die transienten Ca²⁺ als auch die Myofilamente tragen zur Verkürzung und Wiederverlängerung intakter Myozyten bei und können zur kontraktilen Dysfunktion beitragen ^2,7. Daher wird dieser Ansatz empfohlen, wenn die In-vitro-Funktionsanalyse einen intakten Myozyten erfordert, der die Ca²⁺ Zyklusmaschinerie plus die Myofilamente enthält. Zum Beispiel sind intakte isolierte Myozyten wünschenswert, um die kontraktile Funktion nach Modifizierung der Myofilament- oder Ca²⁺-Zyklusfunktion durch Gentransfer^{zu untersuchen 9}. Darüber hinaus wird ein intakter Myozytenansatz vorgeschlagen, um den funktionellen Einfluss von Neurohormonen zu analysieren, wenn der Einfluss von nachgeschalteten Second-Messenger-Signalwegen und/oder das Ansprechen auf therapeutische Wirkstoffe untersucht^{wird 2}. Eine alternative Messung der lastabhängigen Kraft in einzelnen Myozyten wird am häufigsten nach Membranpermeabilisierung (oder Häutung) bei niedrigen Temperaturen (≤15 °C) durchgeführt, um den transienten Beitrag von Ca²⁺ zu entfernen und sich auf die myofilamente Funktion¹⁰ zu konzentrieren. Die Messung von lastabhängigen Kraft- plus Ca²⁺-Transienten in intakten Myozyten ist vor allem aufgrund der komplexen und technischen Herausforderung des Ansatzes¹¹ selten, insbesondere wenn ein höherer Durchsatz erforderlich ist, z. B. zur Messung von Reaktionen auf Neurohormonsignale oder als Screening für Therapeutika. Die Analyse von Herztrabekeln überwindet diese technischen Herausforderungen, kann aber auch durch Nicht-Myozyten, Fibrose und/oder extrazellulären Matrixumbau beeinflusst werden². Jeder der oben beschriebenen Ansätze erfordert ein Präparat, das adulte Myozyten enthält, da neonatale Myozyten und Myozyten, die von induzierbaren pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) abgeleitet sind, noch nicht das vollständige Komplement adulter Myofilamentproteine exprimieren und normalerweise nicht das Niveau der myofilamenten Organisation aufweisen, das in den adulten stäbchenförmigen Myozyten² vorhanden ist. Bisher deuten Hinweise auf iPSCs darauf hin, dass der vollständige Übergang zu adulten Isoformen in Kultur mehr als 134 Tage überschreitet¹².

Angesichts des Schwerpunkts dieser Sammlung auf HF enthalten die Protokolle Ansätze und Analysen zur Unterscheidung der kontraktilen Funktion bei versagenden und nicht versagenden intakten Myozyten. Repräsentative Beispiele sind Rattenmyozyten, die 18-20 Wochen nach einer suprarenalen Coarctation untersucht wurden, die zuvor^{beschrieben wurde 5,13}. Anschließend werden Vergleiche mit Myozyten von scheinbehandelten Ratten angestellt.

Das hier beschriebene Protokoll und die Bildgebungsplattform werden verwendet, um Veränderungen der Verkürzung und Ca²⁺ Transienten in stäbchenförmigen kardialen Myozyten während der Entwicklung von HF zu analysieren und zu überwachen. Für diese Analyse werden 2 x 10⁴ Ca 2+-tolerante, stäbchenförmige Myozyten auf²² mm² lamininbeschichtete Glasdeckgläser (CSs) plattiert und über Nacht kultiviert, wie zuvor beschrieben⁸. Die für diese Bildgebungsplattform zusammengebauten Komponenten sowie die Medien und Puffer, die für eine optimale Bildgebung verwendet werden, sind in der Materialtabelle aufgeführt. Eine Anleitung zur Datenanalyse mittels Software und die repräsentativen Ergebnisse werden hier ebenfalls bereitgestellt. Das Gesamtprotokoll ist in separate Unterabschnitte unterteilt, wobei sich die ersten drei Abschnitte auf isolierte Rattenmyozyten und Datenanalyse konzentrieren, gefolgt von zellulären Ca²⁺ transienten Experimenten und Datenanalysen in Myozyten.

Protokoll

Studien, die an Nagetieren durchgeführt wurden, folgten der Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals und wurden vom University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Für diese Studie wurden Myozyten von 3-34 Monate alten Sprague-Dawley- und F344BN-Ratten mit einem Gewicht von ≥ 200 g⁵ isoliert. Es wurden sowohl männliche als auch weibliche Raten verwendet.

1. Myozyten-Pacing für kontraktile Funktionsstudien

1. Stellen Sie frische M199-basierte Medien für jeden Satz isolierter Myozyten her (Table of Materials). 1 Tag vor dem Schritt, Platte 2 x 10⁴ Ca 2+-tolerante, stäbchenförmige Myozyten auf²² mm² lamininbeschichteten Glasdeckgläsern (CSs), wie zuvor beschrieben⁸.
2. Um die Kammern vorzubereiten, weichen Sie jede Kammer 1 h lang in 10% Bleichmittel ein. Dann spülen Sie die Kammern mit fließendem Leitungswasser für 30-45 min, gefolgt von destilliertem Wasser, das alle 5 Minuten für 30 Minuten ersetzt wird, gefolgt von entionisiertem Wasser, das alle 5 Minuten für 30 Minuten ersetzt wird, und einer abschließenden Spülung in entionisiertem Wasser.
3. Trocknen Sie die Kammern auf einer sauberen Oberfläche für 20-30 min (Ergänzende Abbildung 1A-C). Als nächstes werden die Kammern in einer Biosicherheitswerkbank für 5 min in jede Richtung UV behandelt (gesamt = 20 min). Dieser Schritt ist für vorsterilisierte Kammern nicht erforderlich.
   VORSICHT: Verlassen Sie den Bereich, um die UV-Exposition zu minimieren.
4. Entfernen Sie die Abdeckung aus der Kammer, geben Sie 3 ml M199-basierte Medien (siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung (ergänzende Abbildung 1B), ersetzen Sie die Abdeckung und heizen Sie die Kammer in einem 37-°C-Inkubator mit 5 % CO2 und 20 %_O2 vor.
5. Sterilisieren Sie die Pinzette in einem heißen Perlensterilisator bei 250 °C für 20-25 s. Die vorgewärmte Stimulationskammer wird vom Inkubator in eine Biosicherheitswerkbank überführt.
6. Jedes Deckglas (CS), das kardiale Myozyten enthält, wird mit einer sterilen Pinzette in einzelne Vertiefungen in der Stimulationskammer überführt. Übertragen Sie die CSs jeweils viermal, gefolgt von einer Erwärmung für 10 Minuten vor dem Transfer der verbleibenden vier CSs, um die Medientemperatur aufrechtzuerhalten.
7. Befestigen Sie Bananenbuchsen an der Stimulationskammer an einem Ende (ergänzende Abbildung 1C) und am anderen Ende am Stimulator (ergänzende Abbildung 1D).
8. Stellen Sie die Stimulatorfrequenz auf 0,2 Hz ein und stellen Sie die Spannung (~ 12 V) ein, um eine Kontraktion in ~ 10% -20% aller stäbchenförmigen kardialen Myozyten in einem Well zu erreichen. Um die Anzahl der kontrahierenden Myozyten zu bestimmen, platzieren Sie die Kammer unter einem inversen Mikroskop mit 4- bis 10-facher Vergrößerung.
9. Stellen Sie die Stimulationskammer in einen Inkubator bei 37 °C in 5%_CO2 (ergänzende Abbildung 1E). Wechseln Sie die Medien alle 12 h mit Medien, die in einem 37 °C, 5%_{CO2-Inkubator} für 20-25 min vorgewärmt sind. Setzen Sie die elektrische Stimulation für bis zu 3 Tage fort, wobei das Medium alle 12 h gewechselt wird.

2. Kontraktile Funktionsanalyse adulter Rattenherzmyozyten

1. Eine Gelpackung und Medien vor dem Experiment in einem 37 °C Inkubator für 30 min vorheizen.
2. Schalten Sie die Komponenten der kontraktilen Funktionsplattform ein, die in der Materialtabelle aufgeführt und in der ergänzenden Abbildung 2 dargestellt sind, mit besonderem Augenmerk auf die Schlüsselkomponenten, zu denen ein Antivibrationstisch (ergänzende Abbildung 2A-1) mit einem inversen Mikroskop mit einem tiefroten (590 nm) Filter (Supplemental Figure 2A-2,3) und einer CCD-Kamera (Supplemental Figure 2A-4) gehören, die an einen CCD-Controller angeschlossen sind (Supplemental Figure 2A-5 und Ergänzende Abbildung 2C-5) und in einen PC-Computer integriert (Zusatzfigur 2B-14).
3. Schlauch in die Schlauchpumpe einbauen (Ergänzende Abbildung 2A-8; Ergänzende Abbildung 2A-8), die vorgewärmte Gelpackung in den Tubenhalter (Ergänzende Abbildung 2A-9) und das Vakuum (Ergänzende Abbildung 2A-11) und die Stromversorgung des Zellstimulators (Ergänzende Abbildung 2B-13) einschalten.
4. Legen Sie einen 50-ml-Schlauch mit Medien in den isolierten Schlauchhalter (Zusatzabbildung 2A-9) und beginnen Sie mit der Perfusion bei ~0,5 ml/min durch den Schlauch der Schlauchpumpe (ergänzende Abbildung 2E-8).
5. Fügen Sie eine kleine Menge vorgewärmter Medien in ein kleines Wiegeboot (~ 2 ml) hinzu. Transfer eines CS mit Myozyten aus der Stimulationskammer in das Wiegeboot. Die Stimulationskammer wird im 5%_{-CO2-Inkubator} auf 37 °C zurückgesetzt.
6. Entfernen Sie das CS vom Wiegeboot und wischen Sie die Unterseite vorsichtig ab. Bringen Sie den CS in eine frisch gefettete CS-Kammer (Ergänzende Abbildung 2A, F-10; schwarzer Pfeil) und geben Sie vorsichtig einen Tropfen Medien (~200 μL) auf den CS.
7. Legen Sie eine Platin-Elektrodenhalterung über die CS (ergänzende Abbildung 2F; grauer Pfeil) und legen Sie eine neue CS mit einer Pinzette darüber. Legen Sie eine obere Halterung (ergänzende Abbildung 2F; weißer Pfeil) über das CS-Sandwich und installieren Sie dann zwei oder vier #0-Schwenkkopfschrauben, um die Montage der Kammer abzuschließen.
8. Sobald das Medium im gesamten Pumpenschlauch vorhanden ist, befestigen Sie den Schlauch am Vorwärmer und verbinden Sie den Vorwärmer dann mit der CS-Kammer, die in Schritt 2.7 montiert wurde. Beginnen Sie mit der Perfusion bei 0,5 ml / min und legen Sie ein Taschentuchtuch unter die Kammer, um sicherzustellen, dass keine Lecks vorhanden sind.
9. Setzen Sie die CS-Kammer in den Bühnenadapter ein. Das perfundierte Medium wird am gegenüberliegenden Ende der Kammer mit Schläuchen gesammelt, die mit einem Vakuumsystem verbunden sind. Schalten Sie das Heizsystem ein (ergänzende Abbildung 2A,D-7) und gleichen Sie die Kammer, das Objektiv und den Vorwärmer für ~5-10 min aus, um eine konstante Medientemperatur von 37 °C zu erreichen. Visualisieren Sie Myozyten mit dem 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv am Mikroskop während dieser Gleichgewichtszeit.
10. Aktivieren Sie den Schrittmacherstimulator (ergänzende Abbildung 2B-13), indem Sie die Spannung auf das 1,5-fache der Einstellung einstellen, die für die Kontraktion von 80% der stäbchenförmigen Zellen erforderlich ist, was typischerweise 35-40 V entspricht. Stellen Sie die Stimulationsfrequenz auf 0,2 Hz ein, um die kontraktile Funktion und das Überleben der Myozyten zu optimieren.
11. Sammeln Sie kontraktile Verkürzungs- und Wiederverlängerungsspuren von kontinuierlich durchbluteten und beschleunigten Myozyten. Um Verkürzungsmessungen zu erfassen, verwenden Sie eine CCD-Kamera (ergänzende Abbildung 2A-4), die an einen CCD-Controller angeschlossen ist (ergänzende Abbildung 2B-5,C) und einen dedizierten Computer mit einer E/A-Controllerplatine (ergänzende Abbildung 2B-14; siehe Materialtabelle). Die Plattform misst die Sarkomerverkürzung in Rattenmyozyten, obwohl ähnliche Ergebnisse aus Myozytenmessungen an den Längskanten von Myozyten erhalten werden (siehe Ecklerle et ^al.14).
12. Um Sarkomer-Verkürzungsspuren zu sammeln, öffnen Sie die Software auf dem Computer, wählen Sie OK und dann Datei > Neu aus. Bereiten Sie eine Bildschirmvorlage vor, indem Sie Traces > Edit User Limits > Sarcomere Length auswählen und dann Maximal- und Minimalwerte festlegen, die normalerweise zwischen 2,0 μm und 1,5 μm liegen. Kalibrieren Sie die CCD-Kamera mit einem 0,01-mm-Gitternetz, bevor Sie Messungen in den Myozyten durchführen (Abbildung 1D).
13. Um Sarkomerlängenspuren aufzuzeichnen, wählen Sie Datei > Neu aus. Identifizieren Sie einen kontrahierenden Myozyten, und positionieren Sie den Myozyten entlang der Längsachse der Kamera, sodass das Streifenmuster vertikal ist (Abbildung 1B).
14. Verwenden Sie die Computermaus, um das ROI-Feld (Region of Interest) (rosa Feld) über dem Myozyten zu platzieren (Abbildung 1C). Wählen Sie Sammeln und Starten aus, um die kontraktile Funktion aufzuzeichnen. Rekordverkürzung für 60 s von jedem Myozyten bei niedrigen Stimulationsfrequenzen (≤0,5 Hz).
15. Aufzeichnung der Sarkomerverkürzung von 5-10 Zellen pro CS. Führen Sie Messungen an 1 Zelle/CS durch, wenn Studien eine Behandlung mit Agonisten/Antagonisten beinhalten. Bereiten Sie separate vorgewärmte Medien und einen anderen, speziellen Perfusionsschlauch vor, der in eine Mehrkanal-Schlauchpumpe geladen ist, und befolgen Sie die Schritte 2.9.-2.14. Messung des Einflusses der Medikamenten- oder Neurohormonabgabe auf die kontraktile Funktion der Myozyten.
16. Um die Verkürzung über einen Frequenzbereich zu messen, gehen Sie die Myozyten bei jeder Frequenz voran, um vor der Aufnahme eine stationäre Verkürzung zu erhalten⁵. Verdoppeln Sie für diese Studien die Perfusionsrate und beginnen Sie 15-20 s nach der Stimulation mit einer neuen Frequenz, um konsistente stationäre kontraktile Reaktionen für Frequenzen im Bereich von 0,2 Hz und 2 Hz zu erhalten. Typischerweise werden nicht mehr als 2 Myozyten / CS zur Verkürzung über den angegebenen Bereich der Stimulationsfrequenzen aufgezeichnet.
17. Zeichnen Sie mindestens 7 Kontraktionen/Zelle auf, um bei der Analyse der Aufzeichnungen zuverlässige signalgemittelte Daten zu erhalten (siehe Schritt 3.).

3. Datenanalyse der kontraktilen Funktion in isolierten Myozyten

1. Wählen Sie zunächst Datei aus, wählen Sie eine aufgezeichnete Ablaufverfolgung aus, und wählen Sie dann Öffnen aus. Wählen Sie Registerkarte 1 (linke Seite) der Basisablaufverfolgung und setzen Sie dann das gelbe Feld oben in der Ablaufverfolgung auf Sarc-Länge. Wählen Sie Ablaufverfolgungen und die in Schritt 2.12 vorbereitete Bildschirmvorlage aus.
2. Um eine Analysevorlage vorzubereiten, wählen Sie im Feld Definition von t0 die Option Operationen, Optionen für monotone transiente Analysen, TTL-Ereignismarkierung sowie die folgenden Optionen aus dem Menü: Basislinie (Ruhesarkomerlänge), Abfahrtsgeschwindigkeit relativ zu t0 (dep v), Spitze (Peakhöhe und %Peakhöhe/Baseline oder bl%peak h), Rückkehrgeschwindigkeit relativ zu tPeak (ret v), Time to Peak 50% (TTP 50%) mit t0 und Time to Baseline 50% (TTR_50%) mit tPeak. Speichern Sie diese Analyseoptionen, indem Sie Vorlagen > Analysevorlage mit Bezeichner speichern auswählen. Laden Sie diese Analysevorlage, bevor Sie die einzelnen Ablaufverfolgungen analysieren.
3. Um mit der Datenanalyse zu beginnen, wählen Sie Markierungen > Tor > Transienten > Konvertieren aus Ereignismarkierung > Analysebereich hinzufügen aus. Stellen Sie nun den Zeitbereich von -0,01 s bis 1,20 s für Myozyten bei 0,2 Hz ein (Abbildung 2A, rote Markierungen auf dem unteren Teil der Rohspur). Wählen Sie einen kürzeren Zeitraum für Myozyten, die bei höheren Frequenzen stimuliert werden.
4. Erstellen Sie eine signalgemittelte Ablaufverfolgung, indem Sie Vorgänge > Durchschnittliche Ereignisse auswählen. Eine signalgemittelte Aufzeichnung wird unterhalb der ursprünglichen Basisspur angezeigt.
5. Wählen Sie Registerkarte 1 der signalgemittelten Ablaufverfolgung (linke Seite des Bildschirms) aus, und wählen Sie dann im oberen Menü Markierungen aus, gefolgt von Transient hinzufügen. Wählen Sie Operationen aus dem oberen Menü und Monotone Transientenanalyse, um die signalgemittelten Werte für Baseline-Sarkomerlänge, Peakhöhe, bl%peak h, dep v, ret v, TTP 50% und TTR_50% im signalgemittelten Anzeigefeld anzuzeigen.
6. Übertragen Sie jede transiente Sarkomeranalyse in eine Tabelle für die zusammengesetzte Analyse mehrerer Myozyten, indem Sie Export > Monotone Transientenanalyse > Zwischenablagestrom auswählen. Fügen Sie diese Daten für jede Ablaufverfolgung in die Tabelle ein.
7. Um die signalgemittelte Ablaufverfolgung zu kopieren, wählen Sie > aktuelle Ablaufverfolgung > Zwischenablage exportieren > Optionen und legen Sie die Dezimalstellen auf 5 fest, wählen Sie dann Tabulatortrennzeichen und klicken Sie auf OK und OK. Fügen Sie die signalgemittelten Spuren für jede Myozytenaufzeichnung in eine zweite Tabelle ein.

4. Aufzeichnung von Ca²⁺ Transienten in adulten kardialen Myozyten der Ratte

1. Schalten Sie vor der Messung von Ca 2+-Transienten die in Schritt 2.2 beschriebenen Plattformkomponenten zusammen mit zusätzlichen Fluoreszenzbildgebungskomponenten ein (siehe zusätzliche Komponenten für die Ca²⁺-Bildgebungsanalyse in der Materialtabelle; Ergänzende Abbildung 2A-5,6; 2B-12).
2. Fura-2AM-Stammlösung mit 1 mM Fura-2AM plus 0,5 M Probenecid in Dimethylsulfoxid (DMSO) herstellen. Probenecid minimiert Fura-2AM-Leckage¹⁵.
3. Die Stammlösung wird auf 5 μM Fura-2AM und 2,5 mM Probenecid in 2,5 ml Medien (siehe Materialtabelle) in einer Vertiefung einer 6-Well-Platte verdünnt. Geben Sie 2,5 ml Medien allein (kein Fura-2AM) in drei zusätzliche Vertiefungen in der Platte, bedecken Sie die Platte mit Aluminiumfolie und heizen Sie die Medien auf 37 °C vor.
4. Eine CS-haltige Myozyten aus der Schrittkammer in die Vertiefung mit Fura-2AM überführen, abdecken und die Platte mit 5%_CO2 für 4 min in den 37 °C-Inkubator zurückgeben. Montieren Sie die Schläuche in der Perfusionspumpe und perzitieren Sie während der Fura-2AM-Ladeperiode mit Medien, wie in Schritt 2.4 beschrieben.
5. Schalten Sie die Raumbeleuchtung aus oder minimieren Sie sie, um die Fluoreszenzphotobleiche zu reduzieren und das Fluoreszenzsignal zu optimieren. Nehmen Sie die 6-Well-Platte aus dem Inkubator und waschen Sie dann den CS für 10 s in jeder der drei Vertiefungen, die nur Medien enthalten. Bringen Sie die CS in ein kleines Wiegeboot mit vorgewärmten Medien (keine Fura-2AM).
6. Montieren Sie den CS an der frisch gefetteten CS-Kammer, nachdem Sie die Unterseite des CS vorsichtig abgewischt haben. Fügen Sie vorsichtig einen Tropfen Medien in den CS hinzu und montieren Sie dann die Elektrodenhalterung über dem CS, gefolgt von einer zweiten CS und der oberen Halterung. Verwenden Sie #0 Schwenkkopfschrauben, um die Montage der Zellkammer abzuschließen, wie in den Schritten 2.6.-2.7 beschrieben.
7. Schließen Sie den mit Medien gefüllten Pumpenschlauch an den Vorwärmer an, verbinden Sie den Vorwärmer mit der CS-Kammer und legen Sie ihn in einen Stufenadapter, wie in Schritt 2.8 beschrieben. Sammeln Sie die Medien mit dem Vakuumschlauchsystem und schalten Sie das Heizsystem ein (Zusatzabbildung 2A, D-7), um die Kammer auf 37 °C auszugleichen, wie in den Schritten 2.8.-2.9 beschrieben.
8. Aktivieren Sie den Schrittmacherstimulator (Zusatzabbildung 2B-13), der auf 35-40 V und 0,2 Hz eingestellt ist, wie in Schritt 2.10 beschrieben.
9. Schalten Sie vor der Aufnahme eines Ca²⁺ Transienten eine kleine Taschenlampe oder Buchlampe ein, die in der Nähe der Computertastatur angebracht ist, um die Tastatur zu sehen. Erfassen Sie außerdem den Fluoreszenzhintergrund in einem Bereich ohne Herzmyozyten. Wählen Sie zunächst Datei > >Neu starten aus, wie in Schritt 2.12 beschrieben.
10. Wählen Sie einen ROI aus und legen Sie eine Registerkarte (oder Ablaufbahnleiste, linke Seite) für den unformatierten Zähler und eine zweite Registerkarte für den unformatierten Nenner fest, die in der oberen Mitte jeder Registerkarte definiert sind. Notieren Sie den Hintergrund für 10-20 s. Klicken Sie mit der rechten Maustaste, und ziehen Sie den Mauszeiger über einen Ablaufbahnbalken, um die gemittelten Zähler- und Nennerwerte für das Rohsignal zu erhalten. Geben Sie diese Werte ein, indem Sie die Konstanten Operationen > und die Rohwerte eingeben.
11. Bereiten Sie eine neue Bildschirmvorlage vor, um sowohl Verkürzungen als auch Ca²⁺ -Transienten zu erfassen. Wählen Sie für Sarkomerlänge Registerkarte 1 und verwenden Sie dasselbe Verfahren wie in Schritt 2.13 beschrieben. Wählen Sie für die Ca²⁺ -Bildgebung Tab 2 > Ratio (obere Mitte der Registerkarte) > Traces > Edit User Limits aus, um die minimalen und maximalen Pegel für das Verhältnis festzulegen, die normalerweise zwischen 1 und 5 liegen. Verwenden Sie denselben Prozess, um den Zähler- und Nennerbereich für die Registerkarten 3 und 4 (linke Seite) zu definieren.
12. Positionieren Sie eine ROI-Box über einem Myozytenbild, wie in Schritt 2.14 beschrieben. Wählen Sie Datei > neu > sammeln. Wählen Sie nun Start , um Verkürzungs- und ratiometrische Ca²⁺ -Daten zu sammeln. Zeichnen Sie ≥7 Kontraktionen/Zelle für eine signalgemittelte Analyse auf.
13. Wiederholen Sie die in Schritt 4.10 beschriebene Hintergrundablaufverfolgungsaufzeichnung. nach Aufnahme von 2-4 Myozyten. Typischerweise 4-5 Myozyten / CS oder weniger Myozyten aufzeichnen, wenn es signifikante Änderungen in der Hintergrundmessung gibt.

5. Datenanalyse von Ca²⁺ Transienten in isolierten Myozyten.

1. Öffnen Sie die gewünschte Datei zur Analyse und wählen Sie Vorlagen > Bildschirmvorlage zum Kürzen plus Ca²⁺ Transienten. Als nächstes wählen Sie die Registerkarten 1 und 2 (links), um die Sarkomerlänge bzw. das Ca²⁺ -Verhältnis anzuzeigen. Wählen Sie Operationen > Konstanten und geben Sie die Zähler- und Nennerwerte aus der Hintergrundspur Ca²⁺ ein.
2. Bereiten Sie Analysevorlagen für die Verkürzung sowie transiente Ca²⁺ -Daten vor. Wählen Sie Registerkarte 1 (linke Seite) und verwenden Sie den gleichen Prozess wie in Schritt 3.2 beschrieben. , um die Vorlage für die Sarkomerlängenanalyse festzulegen.
3. Wählen Sie Registerkarte 2 (linke Seite) und wählen Sie Operationen, Monotone Transientenanalyseoptionen, TTL-Ereignismarkierung im Feld Definition von t0 und die folgenden Optionen aus dem Menü: Basislinie (Basalverhältnis), Abfahrtsgeschwindigkeit relativ zu t0 (dep v), Peak (Peakhöhe und %Peakhöhe/Basislinie oder bl%peak h), Zerfallsgeschwindigkeit relativ zu tPeak (ret v), Time to Peak 50% (TTP 50%) mit t0 und Time to Baseline 50% (TTR_50%) mit tPeak. Speichern Sie diese Analyseoptionen, indem Sie Vorlagen auswählen und Analysevorlage mit einem neuen Bezeichnernamen speichern. Laden Sie diese Analysevorlage, bevor Sie die einzelnen Ablaufverfolgungen analysieren.
4. Verwenden Sie den gleichen Prozess wie in den Schritten 3.3.-3.6 beschrieben. , um das Signal zu mitteln, und dann die Sarkomerlänge zu analysieren, gefolgt von den gleichen Schritten für Ca²⁺ Transienten. Setzen Sie separate Markierungen für die Sarkomerlänge und für die Ca²⁺ Transientenverhältnis-Spur.

Ergebnisse

Kontraktile Funktionsstudien werden an Rattenmyozyten durchgeführt, beginnend am Tag nach der Isolierung (Tag 2) bis zu 4 Tage nach der Isolierung. Obwohl Myozyten am Tag nach der Isolierung (d. h. Tag 2) aufgezeichnet werden können, sind nach Gentransfer oder Behandlungen zur Veränderung der kontraktilen Funktion oft längere Kulturzeiten erforderlich⁸. Bei Myozyten, die nach der Isolierung länger als 18 Stunden kultiviert wurden, hilft das in Abschnitt 1 beschriebene Stimulierungsprotokoll b...

Diskussion

Das in Schritt 1 beschriebene Protokoll zur chronischen Stimulation verlängert die nützliche Zeit für die Untersuchung isolierter Myozyten und die Bewertung der Auswirkungen längerer Behandlungen. In unserem Labor wurden bis zu 4 Tage nach der Isolierung konsistente Ergebnisse erzielt, wenn die kontraktile Funktion anhand der Sarkomerlänge an chronisch schrittweisen Myozyten gemessen wurde. Die kontraktile Funktion der Myozyten verschlechtert sich jedoch schnell, wenn Medien verwendet werden, die älter als 1 Woche ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEDIA
Bovine serum albumin	Sigma (Roche)	3117057001	Final concentration = 0.2% (w/v)
Glutathione	Sigma	G-6529	Final concentration = 10 mM
HEPES	Sigma	H-7006	Final concentration = 15 mM
M199	Sigma	M-2520	1 bottle makes 1 L; pH 7.45
NaHCO3	Sigma	S-8875	Final concentration = 4 mM
Penicillin/streptomycin	Fisher	15140122	Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin
REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Fura-2AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	50 μg/vial;  Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;  Final Fura2-AM concentration in media is  5 μM
Probenicid	Invitrogen (Fisher)	P36400	Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM
MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING
#1 22  mm2 glass coverslips	Corning	2845-22
3 x 36 inch cables with banana jacks	Pomona Electronics	B-36-2	Supplemental Figure 1, panel C
37oC Incubator  with 95% O2:5% CO2	Forma	3110	Supplemental Figure 1, panel E.  Multiple models are appropriate
Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp	Forma	1286	Multiple models are appropriate
Forceps - Dumont #5 5/45	Fine Science Tools	11251-35
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	1800-45
Low magnification inverted microscope	Leica	DM-IL	Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes;  4X and 10X objectives recommended
Pacing chamber	Custom		Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22
Stimulator	Ionoptix	Myopacer	Supplemental Figure 1, panel D.
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS			ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options
Additional components for Ca2+ imaging analysis	Ionoptix	Essential system components: -- Photon counting system            --  Xenon power supply with dual excitation light source            --  Fluorescence interface	- The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera  (panel A #4).                                                                      - The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm  excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.                                                                                                                                 - The fluorescence interface between the computer and  light source is shown in panel B, #12.
CCD camera with image acquisition  hardware and software (240 frames/s)	Ionoptix	Myocam with CCD controller	Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4  and  panel A #5 & panel C #5 (right), respectively.  The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).
Chamber stimulator	Ionoptix	Myopacer	Panel B, #13; Alternative:  Grass model S48
Coverslip mounted perfusion chamber	Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws  (arrow, panel F)		Panel A #10 & panel F;   Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).  Commercial alternatives:  Ionoptix FHD or C-stim cell  chambers; Cell MicroControls culture stimulation system
Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients	Ionoptix	PC with Ionwizard PC board and software	Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric  Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. - A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.  The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).
Forceps - Dumont #5 TI	Fine Science Tools	11252-40	Panel F
Insulated tube holder for media	Custom		Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm
Inverted brightfield microscope	Nikon	TE-2000S	Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.   A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.
Isolator Table	TMC Vibration Control	30 x 36 inches	Panel A, #1; Desirable:  elevated shelving, Faraday shielding
Microscope eyepieces & objective	Nikon	10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective	Panel A #3; 40X objective:  n.a. 0.08; w.d. 2 mm.  A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).          NOTE:  water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls 3	Panel A #8 and panel E
small weigh boat	Fisher	08-732-112
Temperature controller	Cell MicroControls	TC2BIP	Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.    A preheater and objective heater are recommended for this platform.  A Cell MicroControls HPRE2 preheater and  HLS-1 objective heater are controlled  by the TC2BIP temperature controller for our studies.
Under cabinet LED light with motion sensor	Sylvania	#72423 LED light	Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..  Alternative:  A clip on flashlight/book light with flexible neck - multiple suppliers are available.
Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter	Fisher	Tygon tubing - E363;  polypropylene Ehrlenmeyer flask - 10-182-50B; Vacuum filter - 09-703-90	Panel A #11