Analisi della disfunzione contrattile cardiaca e dei transitori Ca2+ nei miociti dei roditori

Riepilogo

Viene presentata una serie di protocolli che descrivono la misurazione della funzione contrattile tramite il rilevamento della lunghezza del sarcomero insieme alla misurazione transitoria del calcio (Ca²⁺) nei miociti isolati di ratto. È inclusa anche l'applicazione di questo approccio per studi su modelli animali di insufficienza cardiaca.

Abstract

La disfunzione contrattile e i transitori di Ca²⁺ sono spesso analizzati a livello cellulare come parte di una valutazione completa della lesione indotta da cuore e / o del rimodellamento. Un approccio per valutare queste alterazioni funzionali utilizza l'accorciamento a vuoto e le analisi transitorie di Ca²⁺ nei miociti cardiaci primari adulti. Per questo approccio, i miociti adulti vengono isolati dalla digestione della collagenasi, resi tolleranti al Ca²⁺ e quindi aderenti a vetrini di copertura rivestiti di laminina, seguiti da stimolazione elettrica in mezzi privi di siero. Il protocollo generale utilizza miociti cardiaci di ratto adulto, ma può essere facilmente adattato per miociti primari di altre specie. Le alterazioni funzionali nei miociti da cuori feriti possono essere paragonate a miociti fittizi e/o a trattamenti terapeutici in vitro . La metodologia include gli elementi essenziali necessari per la stimolazione dei miociti, insieme alla camera cellulare e ai componenti della piattaforma. Il protocollo dettagliato per questo approccio incorpora le fasi per misurare l'accorciamento a vuoto mediante rilevamento della lunghezza del sarcomero e transitori cellulari Ca²⁺ misurati con l'indicatore raziometrico Fura-2 AM, nonché per l'analisi dei dati grezzi.

Introduzione

L'analisi della funzione della pompa cardiaca richiede spesso una serie di approcci per ottenere una visione adeguata, in particolare per i modelli animali di insufficienza cardiaca (HF). L'ecocardiografia o le misurazioni emodinamiche forniscono informazioni sulla disfunzione cardiaca in vivo ¹, mentre gli approcci in vitro sono spesso impiegati per identificare se la disfunzione deriva da cambiamenti nel miofilamento e / o nel transitorio Ca²⁺ responsabile dell'eccitazione dell'accoppiamento, o del potenziale d'azione, con la funzione contrattile (ad esempio, accoppiamento eccitazione-contrazione [E-C]). Gli approcci in vitro offrono anche l'opportunità di esaminare la risposta funzionale ai neuroormoni, alle alterazioni genetiche indotte da vettori e ai potenziali agenti terapeutici² prima di perseguire strategie di trattamento in vivo costose e/o laboriose.

Sono disponibili diversi approcci per studiare la funzione contrattile in vitro, comprese le misurazioni della forza nelle trabecole intatte³ o nei miociti permeabilizzati⁴, nonché l'accorciamento a vuoto e i transitori di Ca²⁺ in miociti intatti in presenza e assenza di HF ^5,6. Ciascuno di questi approcci si concentra sulla funzione contrattile dei miociti cardiaci, che è direttamente responsabile della funzione della pompa cardiaca ^2,7. Tuttavia, l'analisi sia della contrazione che dell'accoppiamento E-C insieme viene spesso eseguita misurando l'accorciamento della lunghezza muscolare e dei transitori di Ca 2+ in miociti adulti isolati e tolleranti a Ca²⁺. Il laboratorio utilizza un protocollo dettagliato pubblicato per isolare i miociti dai cuori di ratto per questa fase⁸.

Sia il Ca²⁺ transitorio che i miofilamenti contribuiscono ad accorciare e riallungare i miociti intatti e possono contribuire alla disfunzione contrattile ^2,7. Pertanto, questo approccio è raccomandato quando l'analisi funzionale in vitro richiede un miocita intatto contenente il meccanismo ciclico Ca²⁺ più i miofilamenti. Ad esempio, miociti isolati intatti sono desiderabili per studiare la funzione contrattile dopo aver modificato il miofilamento o la funzione ciclica di Ca²⁺ tramite trasferimento genico⁹. Inoltre, viene suggerito un approccio miocitario intatto per analizzare l'impatto funzionale dei neuroormoni quando si studia l'impatto delle vie di segnalazione del secondo messaggero a valle e/o della risposta agli agenti terapeutici². Una misura alternativa della forza dipendente dal carico nei singoli miociti viene spesso eseguita dopo la permeabilizzazione della membrana (o scuoiatura) a basse temperature (≤15 °C) per rimuovere il contributo transitorio di Ca²⁺ e concentrarsi sulla funzione del miofilamento¹⁰. La misurazione della forza dipendente dal carico più transitori Ca²⁺ nei miociti intatti è rara a causa in gran parte della sfida complessa e tecnica dell'approccio¹¹, specialmente quando è necessaria una maggiore produttività, come per misurare le risposte alla segnalazione neuroormonale o come schermo per agenti terapeutici. L'analisi delle trabecole cardiache supera queste sfide tecniche, ma può anche essere influenzata da non-miociti, fibrosi e/o rimodellamento della matrice extracellulare². Ciascuno degli approcci sopra descritti richiede una preparazione contenente miociti adulti perché i miociti neonatali e i miociti derivati da cellule staminali pluripotenti inducibili (iPSC) non esprimono ancora l'intero complemento delle proteine del miofilamento adulto e di solito mancano del livello di organizzazione del miofilamento presente nel miocita adulto a forma di bastoncello². Ad oggi, l'evidenza nelle iPSC indica che la transizione completa alle isoforme adulte supera più di 134 giorni nella coltura¹².

Dato il focus di questa raccolta sull'HF, i protocolli includono approcci e analisi per differenziare la funzione contrattile nei miociti intatti in fallimento rispetto a quelli non falliti. Esempi rappresentativi sono forniti da miociti di ratto studiati 18-20 settimane dopo una coartazione surrenale, descritta in precedenza ^5,13. Vengono quindi effettuati confronti con miociti di ratti trattati con finzione.

Il protocollo e la piattaforma di imaging qui descritti sono utilizzati per analizzare e monitorare i cambiamenti nell'accorciamento e nei transitori Ca²⁺ nei miociti cardiaci a forma di bastoncello durante lo sviluppo di HF. Per questa analisi, 2 x 10 miociti tolleranti a forma di bastoncello^{tolleranti a} 4 Ca 2+ sono placcati su vetrini (CS) rivestiti di laminina da^{22 mm e} coltivati durante la notte, come descritto in precedenza⁸. I componenti assemblati per questa piattaforma di imaging, insieme ai supporti e ai buffer utilizzati per l'imaging ottimale, sono forniti nella tabella dei materiali. Qui viene fornita anche una guida per l'analisi dei dati utilizzando un software e i risultati rappresentativi. Il protocollo generale è suddiviso in sottosezioni separate, con le prime tre sezioni incentrate sui miociti isolati di ratto e sull'analisi dei dati, seguite da esperimenti transitori cellulari di Ca²⁺ e analisi dei dati nei miociti.

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Protocollo

Gli studi condotti sui roditori hanno seguito la politica del servizio sanitario pubblico sulla cura umana e l'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Michigan. Per questo studio, i miociti sono stati isolati da ratti Sprague-Dawley di 3-34 mesi e F344BN del peso ≥ 200 g⁵. Sono stati utilizzati sia i tassi maschili che quelli femminili.

1. Stimolazione miocitaria per studi sulla funzionalità contrattile

1. Crea nuovi supporti basati su M199 per ogni set di miociti isolati (Tabella dei materiali). 1 giorno prima della stimolazione, placcare 2 x 10^{miociti tolleranti a forma} di bastoncino 4 Ca 2+ su vetrini (CS) rivestiti di laminina da^{22 mm,} come descritto in precedenza⁸.
2. Per preparare le camere, immergere ogni camera in candeggina al 10% per 1 ora. Quindi, sciacquare le camere con acqua corrente del rubinetto per 30-45 minuti, seguita da acqua distillata sostituita ogni 5 minuti per 30 minuti, seguita da acqua deionizzata sostituita ogni 5 minuti per 30 minuti e un risciacquo finale in acqua deionizzata.
3. Asciugare le camere su una superficie pulita per 20-30 minuti (Figura supplementare 1A-C). Successivamente, i raggi UV trattano le camere in un armadio di biosicurezza per 5 minuti in ciascuna direzione (totale = 20 min). Questo passaggio non è necessario per le camere pre-sterilizzate.
   ATTENZIONE: Lasciare l'area per ridurre al minimo l'esposizione ai raggi UV.
4. Rimuovere il coperchio dalla camera, aggiungere 3 mL di materiale a base di M199 (vedere Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto (Figura supplementare 1B), sostituire il coperchio e preriscaldare la camera in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO 2 e il 20% di O₂.
5. Sterilizzare la pinza in uno sterilizzatore a perline calde a 250 °C per 20-25 s. Trasferire la camera di stimolazione preriscaldata dall'incubatore a un armadio di biosicurezza.
6. Trasferire ogni coprislip (CS) contenente miociti cardiaci ai singoli pozzetti nella camera di stimolazione usando una pinza sterile. Trasferire i CS quattro alla volta, seguito dal riscaldamento per 10 minuti prima del trasferimento dei restanti quattro CS per mantenere la temperatura del fluido.
7. Attaccare i banana jack alla camera di stimolazione su un'estremità (Figura supplementare 1C) e allo stimolatore all'altra estremità (Figura supplementare 1D).
8. Impostare la frequenza dello stimolatore su 0,2 Hz e impostare la tensione (~12 V) per ottenere la contrazione in ~10%-20% di tutti i miociti cardiaci a forma di bastoncello all'interno di un pozzetto. Per determinare il numero di miociti contratti, posizionare la camera sotto un microscopio invertito con ingrandimento da 4x a 10x.
9. Posizionare la camera di stimolazione in un'incubatrice a 37 °C in 5% di CO₂ (Figura supplementare 1E). Cambiare il fluido ogni 12 h utilizzando un fluido preriscaldato in un incubatore a 37 °C, 5% CO₂ per 20-25 minuti. Continuare la stimolazione elettrica per un massimo di 3 giorni con il mezzo cambiato ogni 12 ore.

2. Analisi della funzione contrattile di miociti cardiaci di ratto adulto

1. Preriscaldare un impacco di gel e un fluido in un'incubatrice a 37 °C per 30 minuti prima dell'esperimento.
2. Accendere i componenti della piattaforma funzionale contrattile elencati nella Tabella dei Materiali e mostrati nella Figura Supplementare 2, con particolare attenzione ai componenti chiave, che includono una tabella antivibrante (Figura supplementare 2A-1) con un microscopio invertito con un filtro rosso intenso (590 nm) (Figura supplementare 2A-2,3) e una camera CCD (Figura supplementare 2A-4) collegata a un controller CCD (Figura supplementare 2A-5 e Figura supplementare 2C-5) e integrato con un computer PC (Figura supplementare 2B-14).
3. Assemblare i tubi nella pompa peristaltica (Figura supplementare 2A-8; Figura supplementare 2A-8), trasferire il pacchetto di gel preriscaldato nel supporto del tubo (Figura supplementare 2A-9) e accendere il vuoto (Figura supplementare 2A-11) e l'alimentazione allo stimolatore cellulare (Figura supplementare 2B-13).
4. Posizionare un tubo da 50 mL con il fluido nel supporto del tubo isolato (Figura supplementare 2A-9) e iniziare la perfusione a ~0,5 mL/min attraverso il tubo della pompa peristaltica (Figura supplementare 2E-8).
5. Aggiungere una piccola quantità di fluido preriscaldato a una piccola barca di pesatura (~2 ml). Trasferire un CS contenente miociti dalla camera di stimolazione alla barca di pesatura. Riportare la camera di stimolazione a 37 °C nell'incubatore al 5% di CO₂ .
6. Rimuovere il CS dal contenitore di pesatura e pulire delicatamente la parte inferiore. Trasferire il CS in una camera CS appena unta (Figura supplementare 2A,F-10; freccia nera) e aggiungere delicatamente una goccia di supporto (~200 μL) sul CS.
7. Posizionare un supporto per elettrodo di platino sopra il CS (Figura supplementare 2F; freccia grigia) e posare un nuovo CS sopra la parte superiore usando una pinza. Posizionare un supporto superiore (Figura supplementare 2F; freccia bianca) sopra il sandwich CS e quindi installare due o quattro viti a testa panoramica #0 per completare l'assemblaggio della camera.
8. Una volta che il fluido è presente in tutto il tubo della pompa, collegare il tubo al preriscaldatore, quindi collegare il preriscaldatore alla camera CS assemblata nel punto 2.7. Iniziare la perfusione a 0,5 ml/min e posizionare una salvietta di tessuto sotto la camera per assicurarsi che non ci siano perdite.
9. Posizionare la camera CS nell'adattatore di scena. Il mezzo perfuso viene raccolto all'estremità opposta della camera con tubi collegati a un sistema di vuoto. Accendere il sistema di riscaldamento (Figura supplementare 2A, D-7) ed equilibrare la camera, l'obiettivo e il preriscaldatore per ~5-10 minuti per ottenere una temperatura costante del fluido di 37 °C. Visualizza i miociti con l'obiettivo di immersione in acqua 40x sul microscopio durante questo tempo di equilibrio.
10. Attivare lo stimolatore di stimolazione (Figura supplementare 2B-13) impostando la tensione a 1,5 volte l'impostazione necessaria per la contrazione dell'80% delle cellule a forma di bastoncello, che è tipicamente 35-40 V. Impostare la frequenza di stimolazione su 0,2 Hz per ottimizzare la funzione contrattile e la sopravvivenza dei miociti.
11. Raccogliere tracce contrattili di accorciamento e ri-allungamento da miociti continuamente perfusi e stimolati. Per raccogliere le misure di accorciamento, utilizzare una telecamera CCD (Figura supplementare 2A-4) collegata a un controller CCD (Figura supplementare 2B-5,C) e un computer dedicato con una scheda controller I/O (Figura supplementare 2B-14; vedere Tabella dei materiali). La piattaforma misura l'accorciamento del sarcomero nei miociti di ratto, sebbene risultati simili siano ottenuti dalle misurazioni dei miociti raccolte dai bordi longitudinali dei miociti (vedi Ecklerle et ^al.14).
12. Per raccogliere le tracce di accorciamento del sarcomero, aprire il software sul computer, selezionare OK, quindi File > nuovo. Preparare un modello di schermata selezionando Tracce > Modifica limiti utente > Lunghezza sarcomero e quindi impostando valori massimi e minimi, che in genere sono compresi tra 2,0 μm e 1,5 μm. Calibrare la telecamera CCD con un reticolo di 0,01 mm prima di effettuare misurazioni nei miociti (Figura 1D).
13. Per registrare le tracce della lunghezza del sarcomero, selezionare File > Nuovo. Identificare un miocita in contrazione e posizionarlo lungo l'asse longitudinale della telecamera in modo che il modello di striatura sia verticale (Figura 1B).
14. Utilizzare il mouse del computer per posizionare la casella della regione di interesse (ROI) (riquadro rosa) sul miocita (Figura 1C). Selezionare Raccogli e inizia per registrare la funzione contrattile. Accorciamento record per 60 s da ciascun miocita a basse frequenze di stimolazione (≤0,5 Hz).
15. Registrare l'accorciamento del sarcomero da 5-10 cellule per CS. Eseguire misurazioni a 1 cellula/CS se gli studi includono il trattamento con agonisti/antagonisti. Preparare un fluido preriscaldato separato e un diverso tubo di perfusione dedicato caricato in una pompa peristaltica multicanale e seguire i passaggi 2.9.-2.14. misurare l'impatto della somministrazione di farmaci o neuroormoni sulla funzione contrattile dei miociti.
16. Per misurare l'accorciamento su un intervallo di frequenze, accelerare i miociti a ciascuna frequenza per ottenere un accorciamento allo stato stazionario prima della registrazione⁵. Per questi studi, raddoppiare la velocità di perfusione e iniziare a registrare 15-20 s dopo la stimolazione a una nuova frequenza per ottenere risposte contrattili stazionarie coerenti per frequenze nell'intervallo di 0,2 Hz e 2 Hz. In genere, registrare non più di 2 miociti / CS per accorciare attraverso l'intervallo dato di frequenze di stimolazione.
17. Registrare almeno 7 contrazioni/cella per ottenere dati mediati dal segnale affidabili durante l'analisi delle registrazioni (vedere il passaggio 3.).

3. Analisi dei dati della funzione contrattile in miociti isolati

1. Per iniziare, selezionare File, scegliere una traccia registrata e quindi fare clic su Apri. Selezionare la scheda 1 (lato sinistro) della traccia di base, quindi impostare il pannello giallo nella parte superiore della traccia su Sarc-Length. Selezionare Tracce e il modello di schermata preparato nel passaggio 2.12.
2. Per preparare un modello di analisi, selezionare Operazioni, Opzioni di analisi transitoria monotona, Indicatore evento TTL nella casella Definizione di t0 e le seguenti opzioni dal menu: Linea di base (lunghezza del sarcomero a riposo), Velocità di partenza relativa a t0 (dep v), Picco (altezza del picco e %altezza del picco/linea di base o bl%picco h), Velocità di ritorno relativa a tPeak (ret v), Time to Peak 50% (TTP 50%) utilizzando t0 e Time to Baseline 50% (TTR_50%) utilizzando tPeak. Salvare queste opzioni di analisi selezionando Modelli > Salva modello di analisi con un identificatore. Caricare questo modello di analisi prima di analizzare ogni traccia.
3. Per iniziare l'analisi dei dati, selezionare Contrassegna > gate > Aggiungi > transitori Converti da indicatore di evento > intervallo di analisi. Ora imposta l'intervallo di tempo da -0,01 s a 1,20 s per i miociti a 0,2 Hz (Figura 2A, segni rossi sulla parte inferiore della traccia grezza). Selezionare un intervallo di tempo più breve per i miociti stimolati a frequenze più elevate.
4. Produrre una traccia mediata dal segnale selezionando Operazioni > Eventi medi. Una registrazione mediata dal segnale viene visualizzata sotto la traccia di base originale.
5. Selezionare la scheda 1 della traccia media del segnale (lato sinistro dello schermo), quindi selezionare Indicatori nel menu superiore, quindi Aggiungi temporaneo. Selezionare Operazioni dal menu superiore e Analisi transitoria monotona per visualizzare i valori mediati dal segnale per la lunghezza del sarcomero basale, l'altezza del picco, bl%picco h, dep v, ret v, TTP 50% e TTR_50% nel pannello di visualizzazione mediato del segnale.
6. Trasferire ogni analisi dei transienti del sarcomero in un foglio di calcolo per l'analisi composita di più miociti selezionando Esporta > Analisi transitoria monotona > Corrente degli appunti. Incolla questi dati nel foglio di calcolo per ogni traccia.
7. Per copiare la traccia media del segnale, selezionare Esporta > traccia corrente > Appunti > Opzioni e impostare le posizioni decimali su 5, quindi selezionare Delimitatore tabulazioni e fare clic su OK e OK. Incolla le tracce mediate dal segnale per ogni registrazione dei miociti in un secondo foglio di calcolo.

4. Registrazione di transitori Ca²⁺ in miociti cardiaci adulti di ratto

1. Prima di misurare i transitori Ca 2+, accendere i componenti della piattaforma descritti nel passaggio 2.2., insieme ad altri componenti di imaging a fluorescenza (vedere componenti aggiuntivi per l'analisi di imaging Ca²⁺ nella tabella dei materiali; Figura supplementare 2A-5,6; 2B-12).
2. Preparare la soluzione madre di Fura-2AM contenente 1 mM di Fura-2AM più 0,5 M di probenecid in dimetilsolfossido (DMSO). Probenecid riduce al minimo la perdita di Fura-2AM¹⁵.
3. Diluire la soluzione madre a 5 μM di Fura-2AM e 2,5 mM di probenecid in 2,5 mL di terreno (vedere Tabella dei materiali) in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Aggiungere 2,5 mL di materiale da solo (senza Fura-2AM) a tre pozzetti aggiuntivi nella piastra, coprire la piastra con un foglio di alluminio e preriscaldare il fluido a 37 °C.
4. Trasferire un CS contenente miociti dalla camera di stimolazione al pozzetto contenente Fura-2AM, coprire e riportare la piastra all'incubatore a 37 °C con il 5% di CO₂ per 4 minuti. Montare i tubi nella pompa di perfusione e perfondere con il fluido durante il periodo di caricamento Fura-2AM, come descritto al punto 2.4.
5. Spegnere o ridurre a icona le luci della stanza per ridurre il fotosbiancamento a fluorescenza e ottimizzare il segnale di fluorescenza. Rimuovere la piastra a 6 pozzetti dall'incubatore, quindi lavare il CS per 10 s in ciascuno dei tre pozzetti contenenti solo il fluido. Trasferire il CS su una piccola barca di pesatura contenente fluidi preriscaldati (senza aggiunta di Fura-2AM).
6. Montare il CS nella camera CS appena unta dopo aver pulito delicatamente la parte inferiore del CS. Aggiungere delicatamente una goccia di supporto al CS, quindi assemblare il supporto dell'elettrodo sul CS, seguito da un secondo CS e dal supporto superiore. Utilizzare viti a testa panoramica #0 per completare l'assemblaggio della camera della cella, come descritto nei passaggi 2.6.-2.7.
7. Collegare il tubo della pompa riempito di fluido al preriscaldatore, collegare il preriscaldatore alla camera CS e inserire un adattatore di fase, come descritto al punto 2.8. Raccogliere il fluido con il sistema di tubi a vuoto e accendere il sistema di riscaldamento (Figura supplementare 2A,D-7) per equilibrare la camera a 37°C, come descritto nei punti 2.8.-2.9.
8. Attivare lo stimolatore di stimolazione (Figura supplementare 2B-13) impostato su 35-40 V e 0,2 Hz, come descritto al punto 2.10.
9. Prima di registrare un transiente Ca²⁺ , accendere una piccola torcia o una luce da libro montata vicino alla tastiera del computer per facilitare la visualizzazione della tastiera. Inoltre, registrare lo sfondo di fluorescenza in un'area senza miociti cardiaci. Per iniziare, selezionare File > Avvia > Nuovo, come descritto nel passaggio 2.12.
10. Selezionare un ROI e impostare una scheda (o barra di traccia, lato sinistro) per il numeratore non elaborato e una seconda scheda per il denominatore non elaborato, definito nella parte superiore centrale di ogni scheda. Registra lo sfondo per 10-20 s. Fare clic con il pulsante destro del mouse e trascinare su un pannello della barra di traccia per ottenere i valori del numeratore e del denominatore mediati dal segnale non elaborato. Immettere questi valori selezionando Operazioni > Costanti e immettere i valori non elaborati.
11. Preparare un nuovo modello di schermata per raccogliere sia i transitori di accorciamento che quelli di Ca²⁺ . Per la lunghezza del sarcomero, selezionare la scheda 1 e utilizzare lo stesso processo descritto nel passaggio 2.13. Per la creazione di immagini Ca²⁺ , selezionare Rapporto > scheda 2 (in alto al centro della scheda) > Tracce > Modifica limiti utente per impostare i livelli minimo e massimo per il rapporto, che in genere sono impostati tra 1 e 5. Utilizzare lo stesso processo per definire gli intervalli di numeratori e denominatori per le schede 3 e 4 (lato sinistro).
12. Posizionare una casella ROI su un'immagine miocitaria, come descritto nel passaggio 2.14. Selezionare File > Nuovo > Raccogli. Ora seleziona Start per raccogliere i dati di accorciamento e raziometrici Ca²⁺ . Registrare ≥7 contrazioni/cellula per l'analisi mediata del segnale.
13. Ripetere la registrazione della traccia in background descritta al punto 4.10. dopo aver registrato 2-4 miociti. In genere, registrare 4-5 miociti / CS o meno miociti se ci sono cambiamenti significativi nella lettura dello sfondo.

5. Analisi dei dati dei transitori di Ca²⁺ in miociti isolati.

1. Aprire il file desiderato per l'analisi e selezionare Modelli > Modello schermo per accorciare più i transitori Ca²⁺ . Quindi, seleziona le schede 1 e 2 (a sinistra) per mostrare rispettivamente la lunghezza del sarcomero e il rapporto Ca²⁺ . Selezionare Operazioni > Costanti e immettere i valori del numeratore e del denominatore dalla traccia di sfondo Ca²⁺ .
2. Preparare modelli di analisi per accorciare più dati temporanei Ca²⁺ . Selezionare la scheda 1 (lato sinistro) e utilizzare lo stesso processo descritto nel passaggio 3.2. per impostare il modello di analisi della lunghezza del sarcomero.
3. Selezionare la scheda 2 (lato sinistro), quindi selezionare Operazioni, Opzioni di analisi transitoria monotona, Segno evento TTL nella casella Definizione di t0 e le seguenti opzioni dal menu: Linea di base (rapporto basale), Velocità di partenza relativa a t0 (dep v), Picco (altezza picco e %altezza picco/linea di base o bl%picco h), Velocità di decadimento relativa a tPeak (ret v), Time to Peak 50% (TTP 50%) utilizzando t0 e Time to Baseline 50% (TTR_50%) utilizzando tPeak. Salvare queste opzioni di analisi selezionando Modelli e Salva modello di analisi utilizzando un nuovo nome identificativo. Caricare questo modello di analisi prima di analizzare ogni traccia.
4. Utilizzare lo stesso processo descritto nei passaggi 3.3.-3.6. per calcolare la media del segnale e quindi analizzare la lunghezza del sarcomero, seguito dagli stessi passaggi per i transitori Ca²⁺ . Impostare segni separati per la lunghezza del sarcomero e per la traccia del rapporto transitorio Ca²⁺ .

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Risultati

Gli studi sulla funzionalità contrattile vengono eseguiti su miociti di ratto a partire dal giorno dopo l'isolamento (giorno 2) fino a 4 giorni dopo l'isolamento. Sebbene i miociti possano essere registrati il giorno dopo l'isolamento (cioè il giorno 2), sono spesso necessari tempi di coltura più lunghi dopo il trasferimento genico o i trattamenti per modificare la funzione contrattile⁸. Per i miociti coltivati per più di 18 ore dopo l'isolamento, il protocollo di stimolazione descritto nella ...

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Discussione

Il protocollo di stimolazione cronica delineato nella fase 1 estende il tempo utile per studiare miociti isolati e valutare l'impatto di trattamenti più lunghi. Nel nostro laboratorio, sono stati ottenuti risultati coerenti fino a 4 giorni dopo l'isolamento durante la misurazione della funzione contrattile utilizzando la lunghezza del sarcomero su miociti cronicamente stimolati. Tuttavia, la funzione contrattile dei miociti si deteriora rapidamente quando si utilizzano mezzi più vecchi di 1 settimana per accelerare i m...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEDIA
Bovine serum albumin	Sigma (Roche)	3117057001	Final concentration = 0.2% (w/v)
Glutathione	Sigma	G-6529	Final concentration = 10 mM
HEPES	Sigma	H-7006	Final concentration = 15 mM
M199	Sigma	M-2520	1 bottle makes 1 L; pH 7.45
NaHCO3	Sigma	S-8875	Final concentration = 4 mM
Penicillin/streptomycin	Fisher	15140122	Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin
REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Fura-2AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	50 μg/vial;  Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;  Final Fura2-AM concentration in media is  5 μM
Probenicid	Invitrogen (Fisher)	P36400	Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM
MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING
#1 22  mm2 glass coverslips	Corning	2845-22
3 x 36 inch cables with banana jacks	Pomona Electronics	B-36-2	Supplemental Figure 1, panel C
37oC Incubator  with 95% O2:5% CO2	Forma	3110	Supplemental Figure 1, panel E.  Multiple models are appropriate
Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp	Forma	1286	Multiple models are appropriate
Forceps - Dumont #5 5/45	Fine Science Tools	11251-35
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	1800-45
Low magnification inverted microscope	Leica	DM-IL	Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes;  4X and 10X objectives recommended
Pacing chamber	Custom		Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22
Stimulator	Ionoptix	Myopacer	Supplemental Figure 1, panel D.
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS			ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options
Additional components for Ca2+ imaging analysis	Ionoptix	Essential system components: -- Photon counting system            --  Xenon power supply with dual excitation light source            --  Fluorescence interface	- The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera  (panel A #4).                                                                      - The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm  excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.                                                                                                                                 - The fluorescence interface between the computer and  light source is shown in panel B, #12.
CCD camera with image acquisition  hardware and software (240 frames/s)	Ionoptix	Myocam with CCD controller	Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4  and  panel A #5 & panel C #5 (right), respectively.  The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).
Chamber stimulator	Ionoptix	Myopacer	Panel B, #13; Alternative:  Grass model S48
Coverslip mounted perfusion chamber	Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws  (arrow, panel F)		Panel A #10 & panel F;   Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).  Commercial alternatives:  Ionoptix FHD or C-stim cell  chambers; Cell MicroControls culture stimulation system
Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients	Ionoptix	PC with Ionwizard PC board and software	Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric  Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. - A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.  The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).
Forceps - Dumont #5 TI	Fine Science Tools	11252-40	Panel F
Insulated tube holder for media	Custom		Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm
Inverted brightfield microscope	Nikon	TE-2000S	Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.   A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.
Isolator Table	TMC Vibration Control	30 x 36 inches	Panel A, #1; Desirable:  elevated shelving, Faraday shielding
Microscope eyepieces & objective	Nikon	10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective	Panel A #3; 40X objective:  n.a. 0.08; w.d. 2 mm.  A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).          NOTE:  water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls 3	Panel A #8 and panel E
small weigh boat	Fisher	08-732-112
Temperature controller	Cell MicroControls	TC2BIP	Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.    A preheater and objective heater are recommended for this platform.  A Cell MicroControls HPRE2 preheater and  HLS-1 objective heater are controlled  by the TC2BIP temperature controller for our studies.
Under cabinet LED light with motion sensor	Sylvania	#72423 LED light	Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..  Alternative:  A clip on flashlight/book light with flexible neck - multiple suppliers are available.
Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter	Fisher	Tygon tubing - E363;  polypropylene Ehrlenmeyer flask - 10-182-50B; Vacuum filter - 09-703-90	Panel A #11