ניתוח של תפקוד לקוי של התכווצות הלב ו- Ca2 + טרנזיינטים במיוציטים של מכרסמים

Summary

מוצגת סדרה של פרוטוקולים המתארים את מדידת פונקציית ההתכווצות באמצעות זיהוי אורך סרקומר יחד עם מדידת סידן (Ca²⁺) במיוציטים של חולדות מבודדות. היישום של גישה זו למחקרים במודלים של בעלי חיים של אי ספיקת לב נכלל גם הוא.

Abstract

תפקוד לקוי של התכווצויות ו-Ca²⁺ מנותחים לעתים קרובות ברמה התאית כחלק מהערכה מקיפה של פגיעה הנגרמת על ידי הלב ו / או שיפוץ. גישה אחת להערכת שינויים תפקודיים אלה משתמשת בקיצור פרוק ובניתוחים חולפים של Ca²⁺ במיוציטים לבביים בוגרים ראשוניים. לצורך גישה זו, מיוציטים בוגרים מבודדים על ידי עיכול קולגן, הופכים את Ca²⁺ לסובלני, ולאחר מכן נדבקים לכיסויים מצופים למינין, ולאחר מכן לקצב חשמלי במדיה נטולת סרום. הפרוטוקול הכללי משתמש במיוציטים לבביים של חולדות בוגרות, אך ניתן להתאים אותו בקלות למיוציטים ראשוניים ממינים אחרים. ניתן להשוות שינויים תפקודיים במיוציטים מלבבות פגועים למיוציטים ו/או לטיפולים במבחנה . המתודולוגיה כוללת את המרכיבים החיוניים הדרושים לקצב מיוציטים, יחד עם מרכיבי תא התא והפלטפורמה. הפרוטוקול המפורט לגישה זו משלב את השלבים למדידת התקצרות נפרקת על ידי זיהוי אורך סרקומר וטרנזיינטים סלולריים Ca²⁺ שנמדדו באמצעות מחוון היחס Fura-2 AM, כמו גם לניתוח נתונים גולמיים.

Introduction

ניתוח תפקוד משאבת הלב דורש לעתים קרובות מגוון גישות כדי לקבל תובנה מספקת, במיוחד עבור מודלים של בעלי חיים של אי ספיקת לב (HF). אקוקרדיוגרפיה או מדידות המודינמיות מספקות תובנה לגבי תפקוד לב in vivo ¹, בעוד שגישות in vitro משמשות לעתים קרובות כדי לזהות אם תפקוד לקוי נובע משינויים במיופילמנט ו/או ב-Ca²⁺ חולף האחראי על עירור צימוד, או פוטנציאל הפעולה, עם פונקציית התכווצות (למשל, צימוד עירור-כיווץ [E-C]). גישות במבחנה מספקות גם הזדמנות לסנן את התגובה התפקודית לנוירוהורמונים, שינויים גנטיים הנגרמים על ידי וקטורים, כמו גם סוכנים טיפוליים פוטנציאליים² לפני נקיטת אסטרטגיות טיפול in vivo יקרות ו / או מייגעות.

מספר גישות זמינות כדי לחקור את תפקוד ההתכווצות במבחנה, כולל מדידות כוח בטרבקולה³ שלמה או מיוציטים מחלחלים⁴, כמו גם קיצור לא טעון ו- Ca²⁺ טרנזיינטים במיוציטים שלמים בנוכחות והיעדר HF ^5,6. כל אחת מהגישות הללו מתמקדת בתפקוד התכווצות המיוציטים הלבביים, האחראי ישירות על תפקוד משאבת הלב ^2,7. עם זאת, הניתוח של התכווצות וצימוד E-C יחד מבוצע לרוב על ידי מדידת קיצור אורך השריר ו- Ca 2+ חולפים במיוציטים בוגרים מבודדים, Ca²⁺ סובלניים. המעבדה משתמשת בפרוטוקול מפורט שפורסם כדי לבודד מיוציטים מלבבות חולדות עבור שלב⁸ זה.

גם Ca²⁺ חולף וגם מיופילמנטים תורמים לקיצור והארכה מחדש של מיוציטים שלמים ויכולים לתרום לתפקוד לקוי של התכווצות ^2,7. לפיכך, גישה זו מומלצת כאשר ניתוח פונקציונלי במבחנה דורש מיוציט שלם המכיל את מכונות המחזור Ca²⁺ בתוספת המיופילמנטים. לדוגמה, מיוציטים מבודדים שלמים רצויים לחקר תפקוד התכווצות לאחר שינוי תפקוד המיופילמנט או Ca²⁺ מחזורי באמצעות העברת גנים⁹. בנוסף, גישת מיוציטים שלמים מוצעת לניתוח ההשפעה התפקודית של נוירוהורמונים כאשר חוקרים את ההשפעה של מסלולי איתות שליח שני במורד הזרם ו / או תגובה לסוכנים טיפוליים². מדידה חלופית של כוח תלוי עומס במיוציטים בודדים מבוצעת לרוב לאחר חדירת ממברנה (או עור) בטמפרטורות נמוכות (≤15 מעלות צלזיוס) כדי להסיר את התרומה החולפת Ca²⁺ ולהתמקד בפונקציית מיופילמנט¹⁰. מדידת כוח תלוי עומס בתוספת Ca²⁺ חולפים במיוציטים שלמים היא נדירה בעיקר בשל האתגר המורכב והטכני של גישה¹¹, במיוחד כאשר יש צורך בתפוקה גבוהה יותר, כגון למדידת תגובות לאיתות נוירוהורמונים או כמסך לסוכנים טיפוליים. הניתוח של טרבקולה לבבית מתגבר על אתגרים טכניים אלה, אך עשוי להיות מושפע גם משינויים שאינם מיוציטים, פיברוזיס ו/או מטריצה חוץ-תאית². כל אחת מהגישות שתוארו לעיל דורשת תכשיר המכיל מיוציטים בוגרים מכיוון שמיוציטים ילודים ומיוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים בלתי ניתנים להשראה (iPSCs) עדיין אינם מבטאים את ההשלמה המלאה של חלבוני מיופילמנט בוגרים ובדרך כלל חסרים את רמת ארגון המיופילמנט הקיימת במיוציטים בצורת מוט בוגר². נכון להיום, עדויות ב- iPSCs מצביעות על כך שהמעבר המלא לאיזופורמים בוגרים עולה על יותר מ -134 ימים בתרבית¹².

בהתחשב בהתמקדות של אוסף זה ב- HF, הפרוטוקולים כוללים גישות וניתוח כדי להבדיל בין תפקוד התכווצות במיוציטים שלמים כושלים לעומת מיוציטים שלמים שאינם נכשלים. דוגמאות מייצגות מסופקות ממיוציטים של חולדות שנחקרו 18-20 שבועות לאחר כריתה על-כלייתית, שתוארה קודם^{לכן 5,13}. לאחר מכן נעשות השוואות למיוציטים מחולדות שטופלו בבושה.

הפרוטוקול ופלטפורמת ההדמיה המתוארים כאן משמשים לניתוח וניטור שינויים בקיצור ו- Ca²⁺ חולפים במיוציטים לבביים בצורת מוט במהלך התפתחות HF. לצורך ניתוח זה, 2 x 10⁴ Ca 2+-סובלניים, מיוציטים בצורת מוט מצופים על²² מ"מ 2 מ^{"מ 2} כיסויי זכוכית מצופים למינין (CSs) ומתורבתים לילה, כפי שתואר קודם^{לכן 8}. הרכיבים שהורכבו עבור פלטפורמת הדמיה זו, יחד עם המדיה והמאגרים המשמשים להדמיה אופטימלית, מסופקים בטבלת החומרים. מדריך לניתוח נתונים באמצעות תוכנה והתוצאות המייצגות מסופקים גם כאן. הפרוטוקול הכולל מחולק לתתי-סעיפים נפרדים, כאשר שלושת החלקים הראשונים מתמקדים במיוציטים של חולדות מבודדות ובניתוח נתונים, ולאחר מכן ניסויים ארעיים של Ca²⁺ וניתוח נתונים במיוציטים.

Protocol

מחקרים שבוצעו על מכרסמים עקבו אחר מדיניות שירות בריאות הציבור בנושא טיפול הומני ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מישיגן. לצורך מחקר זה, מיוציטים בודדו מחולדות ספראג-דאולי ו-F344BN בנות 3-34 חודשים במשקל ≥-200 גרם⁵. נעשה שימוש בשיעורי זכר ונקבה כאחד.

1. קצב מיוציטים למחקרי תפקוד התכווצות

1. הכינו מדיה טרייה מבוססת M199 עבור כל קבוצה של מיוציטים מבודדים (טבלת חומרים). יום אחד לפני הקצב, צלחת 2 x 10⁴ Ca 2+-סובלני, בצורת מוט מיוציטים על²² מ"מ 2 מ"מ² כיסויי זכוכית מצופים למינין (CSs), כפי שתואר קודם^{לכן 8}.
2. כדי להכין את התאים, משרים כל תא ב-10% אקונומיקה למשך שעה אחת. לאחר מכן, יש לשטוף את התאים במי ברז זורמים למשך 30-45 דקות, ולאחר מכן מים מזוקקים שהוחלפו כל 5 דקות למשך 30 דקות, ולאחר מכן מים שעברו דה-יוניזציה הוחלפו כל 5 דקות למשך 30 דקות, ושטיפה אחרונה במים שעברו דה-יוניזציה.
3. יבשו את התאים על משטח נקי במשך 20-30 דקות (איור משלים 1A-C). לאחר מכן, UV לטפל בתאים בארון biosafety במשך 5 דקות לכל כיוון (סה"כ = 20 דקות). שלב זה אינו נחוץ עבור תאים מעוקרים מראש.
   אזהרה: יש לעזוב את האזור כדי למזער את החשיפה לקרינת UV.
4. הסר את המכסה מהתא, הוסף 3 מ"ל של מדיה מבוססת M199 (ראו טבלת חומרים) לכל באר (איור משלים 1B), החלף את הכיסוי וחמם את התא באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 ו- 20% O₂.
5. יש לחטא מלקחיים במעקר חרוזים חמים בטמפרטורה של 250 מעלות צלזיוס למשך 20-25 שניות. העבירו את תא הגירוי שחומם מראש מהאינקובטור לארון בטיחות ביולוגית.
6. העבירו כל כיסוי (CS) המכיל מיוציטים לבביים לבארות בודדות בתא הגירוי באמצעות מלקחיים סטריליים. העבר CSs ארבעה בכל פעם, ולאחר מכן חימום במשך 10 דקות לפני ההעברה של ארבעת CSs הנותרים כדי לשמור על טמפרטורת המדיה.
7. הצמידו שקעי בננה לתא הגירוי בקצה אחד (איור משלים 1C) ולממריץ בקצה השני (איור משלים 1D).
8. הגדר את תדר הגירוי ל-0.2 הרץ והגדר את המתח (~12 V) כדי להשיג התכווצות ב~10%-20% מכל המיוציטים הלבביים בצורת מוט בתוך באר. כדי לקבוע את מספר המיוציטים המתכווצים, מקם את התא מתחת למיקרוסקופ הפוך עם הגדלה של 4x עד 10x.
9. מקמו את תא הגירוי באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO₂ (איור משלים 1E). שנה את המדיה כל 12 שעות באמצעות מדיה שחוממה מראש בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂ למשך 20-25 דקות. המשך בגירוי חשמלי למשך עד 3 ימים כאשר המדיה מוחלפת כל 12 שעות.

2. ניתוח תפקוד התכווצות של מיוציטים לבביים של חולדות בוגרות

1. מחממים מראש חבילת ג'ל ומדיה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפני הניסוי.
2. הפעל את רכיבי פלטפורמת הפונקציה המכווצת המפורטים בטבלת החומרים ומוצגים באיור משלים 2, עם תשומת לב מיוחדת לרכיבי המפתח, הכוללים טבלה נגד רטט (איור משלים 2A-1) עם מיקרוסקופ הפוך עם מסנן אדום עמוק (590 ננומטר) (איור משלים 2A-2,3) ומצלמת CCD (איור משלים 2A-4) המחוברים לבקר CCD (איור משלים 2A-5 ו- איור משלים 2C-5) ומשולב עם מחשב PC (איור משלים 2B-14).
3. הרכבת צינורות לתוך המשאבה הפריסטלטית (איור משלים 2A-8; איור משלים 2A-8), העבירו את אריזת הג'ל שחוממה מראש למחזיק הצינור (איור משלים 2A-9), והפעילו את הוואקום (איור משלים 2A-11) ואת הכוח לממריץ התא (איור משלים 2B-13).
4. הנח צינור של 50 מ"ל עם מדיה במחזיק הצינור המבודד (איור משלים 2A-9) והתחל זלוף במהירות של ~0.5 מ"ל/דקה דרך צינורות המשאבה הפריסטלטיים (איור משלים 2E-8).
5. הוסף כמות קטנה של מדיה שחוממה מראש לסירת משקל קטנה (~ 2 מ"ל). מעבירים CS אחד המכיל מיוציטים מתא הגירוי לסירת השקילה. החזירו את תא הגירוי ל-37 מעלות צלזיוס באינקובטור 5% CO₂ .
6. הסר את ה- CS מסירת השקילה ונגב בעדינות את החלק התחתון. העבירו את ה-CS לתא CS משומן טרי (איור משלים 2A,F-10; חץ שחור) והוסיפו בעדינות טיפת מדיה (~200 μL) על ה-CS.
7. הניחו תושבת אלקטרודת פלטינה מעל ה-CS (איור משלים 2F; חץ אפור) והניחו CS חדש מעל החלק העליון באמצעות מלקחיים. הניחו תושבת עליונה (איור משלים 2F; חץ לבן) מעל כריך CS ולאחר מכן התקינו שניים או ארבעה ברגים עם ראש מחבת #0 כדי לסיים את הרכבת התא.
8. לאחר שהמדיה נוכחת לאורך צינורות המשאבה, חברו את הצינורות למחמם המקדים, ולאחר מכן חברו את החימום המקדים לתא CS שהורכב בשלב 2.7. יש להתחיל בזלוף במהירות של 0.5 מ"ל/דקה ולהניח מגבון רקמות מתחת לתא כדי לוודא שאין דליפות.
9. מקם את תא CS במתאם הבמה. המדיה המנומרת נאספת בקצה הנגדי של התא עם צינורות המחוברים למערכת ואקום. הפעל את מערכת החימום (איור משלים 2A,D-7) ושזור את התא, המטרה והחימום המקדים למשך ~5-10 דקות כדי להשיג טמפרטורת מדיה קבועה של 37 מעלות צלזיוס. דמיינו את המיוציטים עם מטרת טבילת המים פי 40 במיקרוסקופ במהלך זמן שיווי משקל זה.
10. הפעל את מגרה הקצב (איור משלים 2B-13) על ידי הגדרת המתח לפי 1.5 מההגדרה הדרושה ל-80% מהתאים בצורת מוט כדי להתכווץ, שהוא בדרך כלל 35-40 V. הגדר את תדר הגירוי ל-0.2 הרץ כדי למטב את תפקוד ההתכווצות ואת הישרדות המיוציטים.
11. לאסוף עקבות קיצור התכווצות והארכה מחדש ממיוציטים מחלחלים וקצביים באופן רציף. כדי לאסוף מדידות מקוצרות, השתמש במצלמת CCD (איור משלים 2A-4) המחוברת לבקר CCD (איור משלים 2B-5,C) ולמחשב ייעודי עם לוח בקר קלט/פלט (איור משלים 2B-14; ראו טבלת חומרים). הפלטפורמה מודדת התקצרות סרקומר במיוציטים של חולדות, אם כי תוצאות דומות מתקבלות ממדידות מיוציטים שנאספו מהקצוות האורכיים של מיוציטים (ראו Ecklerle et ^al.14).
12. כדי לאסוף עקבות קיצור sarcomere, פתח את התוכנה במחשב, בחר אישור ולאחר מכן קובץ > חדש. הכן תבנית מסך על-ידי בחירה באפשרות מעקבים > עריכת מגבלות משתמש > אורך Sarcomere ולאחר מכן הגדרת ערכי מקסימום ומינימום, שהם בדרך כלל בין 2.0 מיקרומטר ל- 1.5 מיקרומטר. כייל את מצלמת ה-CCD עם גרטיקולה של 0.01 מ"מ לפני ביצוע מדידות במיוציטים (איור 1D).
13. כדי להקליט מעקבים באורך סרקומר, בחר קובץ > חדש. זהה מיוציט מתכווץ ומקם את המיוציט לאורך ציר האורך של המצלמה כך שתבנית הסטריאציה תהיה אנכית (איור 1B).
14. השתמש בעכבר המחשב כדי למקם את תיבת אזור העניין (ROI) (תיבה ורודה) מעל המיוציטים (איור 1C). בחר אסוף והתחל כדי להקליט פונקציית חוזה. קיצור שיא של 60 שניות מכל מיוציט בתדרי גירוי נמוכים (≤0.5 הרץ).
15. רשום קיצור סרקומר מ-5-10 תאים לכל CS. בצע מדידות בתא אחד/CS אם המחקרים כוללים טיפול באגוניסטים/אנטגוניסטים. הכינו מדיה נפרדת שחוממה מראש ופיסת צינורות פרפוזיה ייעודית אחרת הטעונה במשאבה פריסטלטית רב-ערוצית ובצעו את השלבים 2.9.-2.14. כדי למדוד את ההשפעה של אספקת תרופות או נוירוהורמונים על תפקוד התכווצות מיוציטים.
16. כדי למדוד את הקיצור על פני טווח תדרים, קצב מיוציטים בכל תדר כדי לקבל קיצור מצב יציב לפני הקלטה⁵. עבור מחקרים אלה, הכפילו את קצב הזליפה והתחילו להקליט 15-20 שניות לאחר גירוי בתדר חדש כדי לקבל תגובות התכווצות עקביות במצב יציב עבור תדרים בטווח של 0.2 הרץ ו-2 הרץ. בדרך כלל, רשמו לא יותר מ-2 מיוציטים/CS לקיצור בטווח הנתון של תדרי הגירוי.
17. הקלט לפחות 7 צירים לתא כדי לקבל נתונים אמינים בממוצע אותות בעת ניתוח ההקלטות (ראה שלב 3.).

3. ניתוח נתונים של תפקוד התכווצות במיוציטים מבודדים

1. כדי להתחיל, בחר קובץ, בחר מעקב מוקלט ולאחר מכן בחר פתח. בחר Tab 1 (צד שמאל) של מעקב הבסיס ולאחר מכן הגדר את החלונית הצהובה בחלק העליון של העקיבה ל- Sarc-Length. בחר מעקבים ותבנית המסך שהוכנה בשלב 2.12.
2. כדי להכין תבנית ניתוח, בחר פעולות, אפשרויות ניתוח חולף מונוטוני, סימן אירוע TTL בתיבה הגדרת t0, וכן את האפשרויות הבאות מהתפריט: קו בסיס (אורך סרקומר במנוחה), מהירות יציאה ביחס ל- t0 (dep v), שיא (גובה שיא ו- %גובה שיא/קו בסיס או bl%peak h), מהירות החזרה יחסית ל- tPeak (ret v), זמן לשיא 50% (TTP 50%) באמצעות t0, וזמן לבסיס 50% (TTR_50%) באמצעות tPeak. שמור אפשרויות ניתוח אלה על-ידי בחירה באפשרות תבניות > שמור תבנית ניתוח עם מזהה. טען תבנית ניתוח זו לפני ניתוח כל מעקב.
3. כדי להתחיל בניתוח נתונים, בחר סימנים > שער > הוסף המרה > ארעית מטווח ניתוח של סימן אירוע >. כעת הגדר את טווח הזמן מ-0.01 שניות ל-1.20 שניות עבור מיוציטים בקצב של 0.2 הרץ (איור 2A, סימנים אדומים בחלק התחתון של העקבה הגולמית). בחר טווח זמן קצר יותר עבור מיוציטים מגורה בתדרים גבוהים יותר.
4. הפק מעקב ממוצע אותות על-ידי בחירת פעולות > אירועים ממוצעים. הקלטה ממוצעת של אות מופיעה מתחת לעקבות הבסיס המקוריות.
5. בחר Tab 1 של המעקב הממוצע של האות (הצד השמאלי של המסך) ולאחר מכן בחר סימנים בתפריט העליון, ולאחר מכן הוסף ארעי. בחר פעולות מהתפריט העליון ו- Monotonic Transient Analysis כדי להציג את הערכים הממוצעים של האות עבור אורך סרקומר בסיסי, גובה שיא, bl%peak h, dep v, ret v, TTP 50% ו- TTR_50% בלוח התצוגה הממוצע של האות.
6. העבר כל ניתוח ארעי של sarcomere לגיליון אלקטרוני לצורך ניתוח מרוכב של מיוציטים מרובים על-ידי בחירה באפשרות ייצוא > ניתוח חולף מונוטוני > זרם לוח. הדבק נתונים אלה בגיליון האלקטרוני עבור כל מעקב.
7. להעתקת המעקב הממוצע של האות, בחרו 'ייצוא > 'מעקב נוכחי' > 'אפשרויות > אפשרויות' והגדירו את המקומות העשרוניים ל- 5, לאחר מכן בחרו 'מפריד טאבים' ולחצו על 'אישור' ו'אישור'. הדבק את העקבות הממוצעים של האותות עבור כל הקלטת מיוציטים בגיליון אלקטרוני שני.

4. רישום Ca²⁺ חולפים במיוציטים לבביים בוגרים של חולדות

1. לפני מדידת טרנזיינטים Ca 2+, הפעל את רכיבי הפלטפורמה המתוארים בשלב 2.2., יחד עם רכיבי הדמיה פלואורסצנטיים נוספים (ראה רכיבים נוספים לניתוח הדמיה של Ca²⁺ בטבלת החומרים; איור משלים 2א-5,6; 2ב-12).
2. הכן תמיסת מלאי Fura-2AM המכילה 1 mM Fura-2AM בתוספת 0.5 M probenecid ב dimethylsulfoxide (DMSO). Probenecid ממזער דליפת Fura-2AM¹⁵.
3. יש לדלל את תמיסת המלאי ל-5 μM Fura-2AM ו-2.5 mM probenecid ב-2.5 מ"ל של מדיה (ראו טבלת חומרים) בבאר אחת של צלחת בעלת 6 בארות. הוסיפו מדיה של 2.5 מ"ל בלבד (ללא Fura-2AM) לשלוש בארות נוספות בצלחת, כסו את הצלחת ברדיד אלומיניום וחממו את המדיה ל-37 מעלות צלזיוס.
4. מעבירים CS המכיל מיוציטים מתא הקצב לבאר המכילה Fura-2AM, מכסים ומחזירים את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ למשך 4 דקות. הרכב צינורות במשאבת הזלוף ושקע עם מדיה במהלך תקופת הטעינה של Fura-2AM, כמתואר בשלב 2.4.
5. כבו או צמצמו את אורות החדר כדי להפחית את הפוטו-הלבנה הפלואורסצנטית ולמטב את האות הפלואורסצנטי. הסר את צלחת 6 בארות מן האינקובטור, ולאחר מכן לשטוף את CS במשך 10 שניות בכל אחת משלוש בארות המכילות מדיה בלבד. מעבירים את ה-CS לסירת שקילה קטנה המכילה מדיה שחוממה מראש (ללא תוספת פורה-2:00).
6. הרכב את ה- CS לתא CS משומן טרי לאחר ניגוב עדין של החלק התחתון של ה- CS. הוסף בעדינות טיפת מדיה ל- CS, ולאחר מכן הרכיב את תושבת האלקטרודה מעל ה- CS, ולאחר מכן CS שני ואת התושבת העליונה. השתמש בברגים עם ראש פאן #0 כדי לסיים את הרכבת תא התא, כמתואר בשלבים 2.6.-2.7.
7. חבר את צינורות המשאבה המלאים במדיה למחמם הקדם, חבר את החימום המקדים לתא CS והנח מתאם שלב, כמתואר בשלב 2.8. אספו את המדיה באמצעות מערכת צינורות הוואקום והפעילו את מערכת החימום (איור משלים 2A,D-7) כדי לאזן את התא ל-37 מעלות צלזיוס, כמתואר בשלבים 2.8.-2.9.
8. הפעל את מגרה הקצב (איור משלים 2B-13) המוגדר ל-35-40 וולט ו-0.2 הרץ, כמתואר בשלב 2.10.
9. לפני הקלטת ארעי Ca²⁺ , הפעל פנס קטן או פנס ספרים המותקן ליד מקלדת המחשב כדי לסייע בהצגת המקלדת. בנוסף, להקליט את הרקע פלואורסצנטי באזור ללא מיוציטים לב. כדי להתחיל, בחר קובץ > התחל > חדש, כמתואר בשלב 2.12.
10. בחר ROI והגדר טאב אחד (או סרגל מעקב, בצד שמאל) עבור נומרטור גולמי וכרטיסייה שנייה עבור מכנה גולמי, המוגדר במרכז העליון של כל טאב. הקלט את הרקע במשך 10-20 שניות. לחצו לחיצה ימנית על העכבר וגררו מעל חלונית אחת של סרגל מעקב כדי לקבל את ערכי הנומרטור והמכנה הגולמיים הממוצעים של האות. הזן ערכים אלה על-ידי בחירה ב - Operations > Constants והזן את ערכי הגולמי.
11. הכן תבנית מסך חדשה כדי לאסוף גם את הקיצור וגם את ארעי Ca²⁺ . עבור אורך סרקומר, בחר Tab 1 והשתמש באותו תהליך כמתואר בשלב 2.13. להדמיית Ca²⁺ , בחר באפשרות Tab 2 > Ratio (מרכז עליון של הטאב) > מעקבים > ערוך מגבלות משתמש כדי להגדיר את הרמות המינימליות והמקסימליות עבור היחס, המוגדרות בדרך כלל בין 1 ל- 5. השתמש באותו תהליך כדי להגדיר את טווחי הנומרטור והמכנה עבור הכרטיסיות 3 ו- 4 (צד שמאל).
12. מקם תיבת החזר על ההשקעה מעל תמונת מיוציטים, כמתואר בשלב 2.14. בחר קובץ > > חדש לאסוף. כעת בחר התחל כדי לאסוף נתוני קיצור ויחס Ca²⁺ . שיא ≥7 התכווצויות/תא לניתוח ממוצע אותות.
13. חזור על הקלטת המעקב ברקע המתוארת בשלב 4.10. לאחר הקלטת 2-4 מיוציטים. בדרך כלל, הקלט 4-5 מיוציטים / CS או פחות מיוציטים אם יש שינויים משמעותיים בקריאת הרקע.

5. ניתוח נתונים של Ca²⁺ ארעיים במיוציטים מבודדים.

1. פתח את הקובץ הרצוי לניתוח ובחר תבניות > תבנית מסך לקיצור בתוספת ארעי Ca²⁺ . לאחר מכן, בחר את הכרטיסיות 1 ו- 2 (משמאל) כדי להציג אורך סרקומר ויחס Ca²⁺ , בהתאמה. בחר פעולות > קבועים והזן את ערכי הנומרטור והמכנה ממעקב הרקע Ca²⁺ .
2. הכן תבניות ניתוח לקיצור בתוספת Ca²⁺ נתונים ארעיים. בחר באפשרות Tab 1 (צד ימין) והשתמש באותו תהליך כמתואר בשלב 3.2. כדי להגדיר את תבנית ניתוח אורך Sarcomere.
3. בחר בכרטיסייה 2 (צד שמאל) ובחר פעולות, אפשרויות ניתוח ארעי מונוטוני, סימן אירוע TTL בתיבה הגדרת t0 והאפשרויות הבאות מהתפריט: קו בסיס (יחס בסיסי), מהירות יציאה יחסית ל- t0 (dep v), שיא (גובה שיא ו- %גובה שיא/קו בסיס או bl%peak h), מהירות דעיכה יחסית ל- tPeak (ret v), זמן לשיא 50% (TTP 50%) באמצעות t0, וזמן לבסיס 50% (TTR_50%) באמצעות tPeak. שמור אפשרויות ניתוח אלה על-ידי בחירה באפשרות תבניות ושמירת תבנית ניתוח באמצעות שם מזהה חדש. טען תבנית ניתוח זו לפני ניתוח כל מעקב.
4. השתמש באותו תהליך כמתואר בשלבים 3.3.-3.6. כדי לממוצע את האות ולאחר מכן לנתח את אורך הסרקומרה, ולאחר מכן את אותם השלבים עבור Ca²⁺ ארעי. קבעו סימנים נפרדים לאורך סרקומר ולמעקב אחר יחס חולף Ca²⁺ .

תוצאות

מחקרי תפקוד התכווצות מבוצעים על מיוציטים של חולדות החל מהיום שלאחר הבידוד (יום 2) ועד 4 ימים לאחר הבידוד. למרות שניתן לרשום מיוציטים יום לאחר הבידוד (כלומר, יום 2), לעתים קרובות נדרשים זמני תרבית ארוכים יותר לאחר העברת גנים או טיפולים כדי לשנות את תפקוד ההתכווצות⁸. עבור מיוציטים ש...

Discussion

פרוטוקול הקצב הכרוני המתואר בשלב 1 מאריך את הזמן השימושי לחקר מיוציטים מבודדים ולהערכת ההשפעה של טיפולים ארוכים יותר. במעבדה שלנו, תוצאות עקביות התקבלו עד 4 ימים לאחר הבידוד בעת מדידת תפקוד התכווצות באמצעות אורך סרקומר על מיוציטים בקצב כרוני. עם זאת, תפקוד התכווצות המיוציטים מתדרדר במהירו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEDIA
Bovine serum albumin	Sigma (Roche)	3117057001	Final concentration = 0.2% (w/v)
Glutathione	Sigma	G-6529	Final concentration = 10 mM
HEPES	Sigma	H-7006	Final concentration = 15 mM
M199	Sigma	M-2520	1 bottle makes 1 L; pH 7.45
NaHCO3	Sigma	S-8875	Final concentration = 4 mM
Penicillin/streptomycin	Fisher	15140122	Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin
REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma	D2650
Fura-2AM	Invitrogen (Molecular Probes)	F1221	50 μg/vial;  Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO;  Final Fura2-AM concentration in media is  5 μM
Probenicid	Invitrogen (Fisher)	P36400	Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM
MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING
#1 22  mm2 glass coverslips	Corning	2845-22
3 x 36 inch cables with banana jacks	Pomona Electronics	B-36-2	Supplemental Figure 1, panel C
37oC Incubator  with 95% O2:5% CO2	Forma	3110	Supplemental Figure 1, panel E.  Multiple models are appropriate
Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp	Forma	1286	Multiple models are appropriate
Forceps - Dumont #5 5/45	Fine Science Tools	11251-35
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	1800-45
Low magnification inverted microscope	Leica	DM-IL	Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes;  4X and 10X objectives recommended
Pacing chamber	Custom		Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22
Stimulator	Ionoptix	Myopacer	Supplemental Figure 1, panel D.
MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS			ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options
Additional components for Ca2+ imaging analysis	Ionoptix	Essential system components: -- Photon counting system            --  Xenon power supply with dual excitation light source            --  Fluorescence interface	- The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera  (panel A #4).                                                                      - The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm  excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6.                                                                                                                                 - The fluorescence interface between the computer and  light source is shown in panel B, #12.
CCD camera with image acquisition  hardware and software (240 frames/s)	Ionoptix	Myocam with CCD controller	Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4  and  panel A #5 & panel C #5 (right), respectively.  The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14).
Chamber stimulator	Ionoptix	Myopacer	Panel B, #13; Alternative:  Grass model S48
Coverslip mounted perfusion chamber	Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws  (arrow, panel F)		Panel A #10 & panel F;   Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller).  Commercial alternatives:  Ionoptix FHD or C-stim cell  chambers; Cell MicroControls culture stimulation system
Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients	Ionoptix	PC with Ionwizard PC board and software	Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric  Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. - A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator.  The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below).
Forceps - Dumont #5 TI	Fine Science Tools	11252-40	Panel F
Insulated tube holder for media	Custom		Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm
Inverted brightfield microscope	Nikon	TE-2000S	Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging.   A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging.
Isolator Table	TMC Vibration Control	30 x 36 inches	Panel A, #1; Desirable:  elevated shelving, Faraday shielding
Microscope eyepieces & objective	Nikon	10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective	Panel A #3; 40X objective:  n.a. 0.08; w.d. 2 mm.  A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below).          NOTE:  water immersion dispensers also are now available for water-based objectives.
Peristaltic pump	Gilson	Minipuls 3	Panel A #8 and panel E
small weigh boat	Fisher	08-732-112
Temperature controller	Cell MicroControls	TC2BIP	Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC.    A preheater and objective heater are recommended for this platform.  A Cell MicroControls HPRE2 preheater and  HLS-1 objective heater are controlled  by the TC2BIP temperature controller for our studies.
Under cabinet LED light with motion sensor	Sylvania	#72423 LED light	Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light..  Alternative:  A clip on flashlight/book light with flexible neck - multiple suppliers are available.
Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter	Fisher	Tygon tubing - E363;  polypropylene Ehrlenmeyer flask - 10-182-50B; Vacuum filter - 09-703-90	Panel A #11