JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف البروتوكول الحالي عزل واستزراع الخلايا الجذعية الوسيطة من شرايين الحبل السري والوريد وهلام وارتون.

Abstract

تعد الخلايا الجذعية الوسيطة للحبل السري (UC-MSCs) مصدرا مهما للخلايا للطب التجديدي. يمكن عزل الخلايا الجذعية الجذعية من الحبل السري هلام وارتون ، وكذلك من الشرايين السرية والوريد السري. تعرف باسم الخلايا الجذعية حول الأوعية الدموية التي يتم الحصول عليها من الشرايين السرية (UCA-PSCs) ، والخلايا الجذعية حول الأوعية الدموية التي تم الحصول عليها من الوريد السري (UCV-PSCs) ، والخلايا الجذعية الوسيطة التي تم الحصول عليها من هلام وارتون (WJ-MSCs). UCA-PSCs و UCV-PSCs هي خلايا محيطية مشتقة من المناطق المحيطة بالأوعية الدموية التي هي أسلاف الخلايا الجذعية الجذعية العزل والزراعة للأنواع الثلاثة من الخلايا هو مصدر مهم لدراسة زرع الخلايا الجذعية وإصلاحها. يركز البروتوكول الحالي على عزل الخلايا واستزراعها من خلال الفصل الميكانيكي والثقافة الملتصقة وزحف الخلية. من خلال هذه التقنية ، يمكن اشتقاق الأنواع الثلاثة المختلفة من الخلايا الجذعية. تم الكشف عن علامات سطح الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم الكشف عن الخلايا الجذعية لإمكانية التمايز متعدد السلالات عن طريق التمايز الشحمي والعظمي والشبيه بالأعصاب ، وهو ما يتوافق مع النمط الظاهري للخلايا الجذعية الجذعية الجذعية. يوسع هذا البروتوكول التجريبي مصدر UC-MSCs. بالإضافة إلى ذلك ، توفر طريقة عزل الخلايا أساسا لمزيد من الدراسة للطب التجديدي والتطبيقات الأخرى.

Introduction

تستخدم الخلايا الجذعية الوسيطة للحبل السري البشري (UC-MSCs) على نطاق واسع في الطب التجديدي بسبب عمليتها غير الغازية ، وانخفاض المناعة ، وعدم وجود نزاع أخلاقي1. في العديد من الدراسات ، يمكن أن تلتصق الخلايا الجذعية الوسيطة UC-المعزولة من هلام وارتون (WJ) بالحائط ، وتخضع للتمايز المتعدد ، وتعبر عن علامات الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) 2. ومع ذلك ، فإن جميع الخلايا الجذعية الجذعية تقريبا تنشأ من المنطقة المحيطة بالأوعيةالدموية 3. الحضجة ، كمجموعة فرعية من الخلايا المحيطة بالأوعية الدموية ، هي خلايا سلفية للخلايا الجذعيةالجذعية 4. لذلك ، يمكن عزل UC-MSCs من الحبل السري WJ ، والشرايين السرية (UCAs) ، والوريد السري (UCV) ، المعروف باسم UCA-PSCs و UCV-PSCs و WJ-MSCs ، على التوالي5. تهدف هذه الطريقة إلى عزل وزراعة الأنواع الثلاثة المختلفة من الخلايا الجذعية. تعتبر عزل وثقافة UCA-PSCs و UCV-PSCs و WJ-MSCs مهمة جدا لتوفير المزيد من مصادر الخلايا الجذعية الجذعية.

تصف الدراسة الحالية العزلة والثقافة والتطبيق المستقبلي ل UCA-PSCs و UCV-PSCs و WJ-MSCs ، والتي لها التصاق خلوي ، وتعبر عن علامات الخلايا الجذعية الجذعية ، ولها تمايز متعدد الاتجاهات. لوحظت الخلايا الجذعية المعزولة تحت الفحص المجهري وتخضعت لزراعة الخلايا ، ومرور الخلايا ، وحفظ الخلايا بالتبريد ، واستعادة الخلايا. كان الأساس المنطقي وراء استخدام هذه التقنية هو زحف الخلايا من الأنسجة. بالمقارنة مع الطريقة السابقة ، مثل قياس التدفق الخلوي أو تقنيات الخرزة المغناطيسية المناعية ، والتي كانت معقدةومكلفة 6 ، يمكن عزل US-MSCs بشكل كبير عن طريق طريقة الفصل الملتصق والزحف الخلوي ؛ تم استخدامها في الدراسة السابقة5. تم إجراء تحليل قياس التدفق الخلوي على الخلايا الجذعية المشتقة للكشف عما إذا كانت هذه الخلايا تعبر عن علامات MSC. تم إدخال التمايز متعدد الاتجاهات للخلايا الجذعية لاكتشاف ما إذا كانت الأنواع الثلاثة من الخلايا لديها القدرة على التمايز إلى خلايا شحمية وبانيات عظم وخلايا عصبية. كان عزل واستزراع ثلاثة أنواع من الخلايا الجذعية من الحبل السري مهما في الاستخدام السريري ومفيدا للباحثين في التطبيقات المستقبلية المتنوعة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية من قبل لجنة أخلاقيات البحث السريري ، المستشفى الثالث التابع ، جامعة سوشو. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من البشر. تم تضمين الأفراد الذين خضعوا للولادة المهبلية الكاملة أو العملية القيصرية في هذه الدراسة للحصول على الحبل السري. يأتي الحبل السري من الأطفال حديثي الولادة الأصحاء دون تحيز بين الجنسين. حصل حديث الولادة على درجة أبغار من 8 إلى 10. درجة أبغار هي اختبار سريع لحديثي الولادة يعطى بعد ولادتهم بفترة وجيزة. يتحقق هذا الاختبار من قوة عضلات الطفل ومعدل ضربات القلب وعلامات أخرى لمعرفة ما إذا كانت هناك حاجة إلى أي رعاية طبية أو طارئة إضافية7. من ناحية أخرى ، تم استبعاد المرضى الذين يعانون من أمراض خطيرة ، مثل القلب أو الكبد أو الكلى أو الأمراض المعدية الأخرى ، من هذه الدراسة.

1. جمع الحبل السري البشري

  1. ضع الحبل السري لحديثي الولادة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) وانقله عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: تم استخدام ثلاثة حبال سرية من ثلاثة متبرعين في هذه الدراسة.
  2. قم بإزالة دم الحبل السري على الفور في ظل ظروف معقمة ، وقم بقص المحور الطويل للأوعية الدموية في 20 سم من الحبل السري. افصل 20 سم المناسبة من الشرايين السرية والوريد ، وقم بإزالة هلام وارتون على السطح بعناية.
    ملاحظة: تم الحصول على مزارع الزرع من كل منطقة ، مفرومة إلى قطع صغيرة (1-2 مم3) لتجنب التلوث المتبادل بين الأنواع الثلاثة من الخلايا الجذعية.
  3. قطع الشرايين السرية والوريد وهلام وارتون إلى حجم 1-2 مم3 وتلقيحها في أطباق زراعة الخلايا 100 مم. قم بإجراء تلقيح الشرايين السرية والوريد وهلام وارتون باستخدام الملقط بعد تقرير منشورسابقا 5. لا تقم بتغطية ألواح الاستزراع مقاس 100 مم.
    ملاحظة: كان الفاصل الزمني بين الشرايين السرية أو الوريد أو هلام وارتون حوالي 1 سم. قد يؤثر وقت التجميع الطويل جدا قبل فصل الخلايا على بقاء الخلية وكميتها. يوصى بفصل الشرايين والوريد عن الحبل السري على الفور. كان وقت التجميع يصل إلى 4 ساعات.

2. عزل واستزراع UCA-PSCs و UCV-PSCs و WJ-MSCs

  1. ضع أطباق زراعة الخلايا رأسا على عقب لمدة 3 ساعات في حاضنة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية لضمان ارتباط الشرايين السرية والوريد وأنسجة هلام وارتون بأطباق زراعة الخلايا بإحكام قبل إضافة وسط الاستزراع.
    1. بعد 3 ساعات ، أعد أطباق زراعة الخلايا إلى وضعها الطبيعي. أضف 5 مل من وسط زراعة الخلايا (LG-DMEM ، 10٪ FBS ، 100 وحدة دولية / مل من البنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، انظر جدول المواد) إلى طبق زراعة الخلايا.
  2. أضف 3 مل و 2 مل من وسط المزرعة إلى طبق زراعة الخليةفي اليوم الثالث والسابع من الأسبوع الأول ، على التوالي. احرص على عدم لمس كتل أنسجة شرايين الحبل السري والوريد وهلام وارتون.
  3. قم بتغيير نصف الوسط السائل مرتين في الأسبوع الثاني والوسط السائل بالكامل مرتين في الأسبوع الثالث.
  4. لاحظ الخلايا التي تزحف خارج كتل الأنسجة في حوالي 7 أيام بعد الزراعة ، ثم تخلص من كتل الأنسجة عندما تندمج الخلايا بنسبة 80٪ في ~ 2 أسبوع.
    1. عندما يتم دمج الخلايا بنسبة 100٪ ، قم بتمريرها بنسبة 1: 3 مع 2 مل من 0.05٪ تريبسين بعد الطرد المركزي عند 600 × جم لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: كانت الخلايا الأولية المعزولة من الحبل السري حوالي 2 × 106 UCA-PSCs ، و 1 × 106 UCV-PSCs ، و 2 × 106 WJ-MSCs. تم عزل 2 × 106 UCA-PSCs و 1 × 106 UCV-PSCs و 2 × 106 WJ-MSCs من 20 سم من الحبل السري. زحفت الخلايا في جميع الحبل السري الثلاثة ، مما يشير إلى أن النتائج بين العزل كانت قابلة للتكرار.
    2. بذر الخلايا ، مع الحفاظ على تركيز 5 × 105/100 سم2 في طبق الاستزراع. حافظ على 5 × 105 خلايا في 1 مل من محلول الحفظ بالتبريد (90٪ FBS ، 10٪ DMSO). تم استخدام خلايا الممر الثالث إلى الخامس في هذه الدراسة.

3. الكشف عن علامات سطح MSC عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. هضم خلايا الجيل الثالث بنسبة 0.05٪ من التربسين للحصول على معلق أحادي الخلية. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 600 × جم لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من المادة الطافية للخلية باستخدام ماصة باستور. ثم أعد تعليق 1 × 105 خلايا في 100 ميكرولتر من PBS (1٪ FBS). يقيم رقم الخلية عن طريق عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم بعد تقرير منشورسابقا 8.
  2. احتضان الخلايا 1 × 105 مع الأجسام المضادة المختلفة للفيكوريثرون ضد CD13 (FITC ، 0.1 مجم / مل) ، CD34 (FITC ، 0.1 مجم / مل) ، CD45 (FITC ، 0.1 مجم / مل) ، CD73 (FITC ، 0.1 مجم / مل) ، و HLA-DR (FITC ، 0.1 مجم / مل) في الظلام لمدة 30 دقيقة. بالنسبة للعناصر الضابطة ، احتضان 1 × 105 خلايا باستخدام FITC-IgG (FITC Mouse Anti-Human IgG ، 0.1 مجم / مل) (انظر جدول المواد).
  3. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 600 × جم لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ثم تخلص من المادة الطافية للخلية باستخدام ماصة باستور. أعد تعليق 1 × 105 خلايا في 500 ميكرولتر من PBS (1٪ FBS) ، واكتشفها عن طريق قياس التدفق الخلوي ، وتحليلها بواسطة FlowJo2 (انظر جدول المواد).

4. تمايز UCA-PSCs و UCV-PSCs و WJ-MSCs إلى خلايا شحمية

  1. تلقيح خلايا الجيل الثالث في ألواح 24 بئرا بكثافة 6 × 104 خلايا / سم2 مع 500 ميكرولتر من وسط الخلية (LG-DMEM ، 10٪ FBS ، 100 وحدة دولية / مل بنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، انظر جدول المواد) لكل بئر في حاضنة ثاني أكسيد الكربون5٪ عند 37 درجة مئوية.
  2. قم بتغيير وسط الخلية بعد 24 ساعة ، وقم بتغيير مجموعة التحكم إلى وسط الخلية (LG-DMEM ، 10٪ FBS ، 100 وحدة دولية / مل بنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين). قم بإجراء التجارب بعد دمج الخلايا بنسبة 80٪ في ألواح 24 بئرا.
    ملاحظة: تم تغيير الخلايا في المجموعات التي تسببت في تكوين الشحم إلى وسيط تحريض شحمي (مجموعة التمايز الشحمية ، انظر جدول المواد). تم تغيير وسط الخلايا في كلتا المجموعتين كل 3 أيام.
  3. لاحظ قطرات الدهون في الخلايا بعد حوالي 21 يوما من التحريض في مجموعة الحث الشحمي ثم إنهاء الحث الشحمي.
    ملاحظة: تم استبدال الوسط الشحمي بوسط زراعة الخلايا لإنهاء الحث الدهني2،5. بالإضافة إلى ذلك ، لم تظهر الخلايا في المجموعة الضابطة أي تغيير كبير.
  4. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق ثم ثبتها بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة 5 دقائق لكل منها.
  5. تخلص من PBS وجفف الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة تقريبا. ثم أضف 500 ميكرولتر من محلول الزيت الأحمر O (0.5٪) (انظر جدول المواد) إلى البئر لمدة 10 دقائق.
  6. قم بإزالة محلول الزيت الأحمر O واغسل الخلايا باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها. راقب الخلايا تحت المجهر.

5. تمايز الخلايا الجذعية إلى بانيات العظم

  1. ضع 500 ميكرولتر من الجيلاتين 0.1٪ (انظر جدول المواد) لكل بئر في ألواح استزراع 24 بئرا وتخلص منها بعد 30 دقيقة.
  2. قم بتلقيح 6 × 104 / سم2 من خلايا الجيل الثالث في ألواح استزراع 24 بئرا ، وأضف 500 ميكرولتر وسط زراعة الخلايا أو وسط تحريض العظم (مجموعة التمايز العظمي ، انظر جدول المواد) إلى كل بئر في حاضنة ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية. في المجموعة الضابطة ، قم بتغيير وسط زراعة الخلايا كل 3 أيام ، مع استبدال وسط تحريض العظم في مجموعة التمايز العظمي كل 3 أيام.
  3. بعد 3-4 أسابيع ، تحقق من وجود ترسب الكالسيوم الأسود في الخلايا. اغسل البئر باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  4. ثبت الخلايا في درجة حرارة الغرفة بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 15 دقيقة واغسلها باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها. أضف محلول تلطيخ أحمر الأيزارين (1٪) إلى البئر لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، ثم تخلص منه.
  5. بعد التجفيف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، راقب الخلايا تحت المجهر.

6. تمايز الخلايا الجذعية إلى خلايا عصبية

  1. قم بتلقيح خلايا الجيل الثالث 6 × 104 / سم2 في ألواح استزراع 24 بئرا ، حيث تم وضع شرائح الغطاء المعقمة المعالجة ب L-polylysine. ضع أوراق تسلق الخلايا (انظر جدول المواد) في الألواح المكونة من 24 بئرا لتمييز الخلايا إلى خلايا عصبية. زراعة الخلايا على صفائح تسلق الخلية.
  2. بعد ذلك ، أضف 500 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا إلى البئر ، واستبدل وسط زراعة الخلية ب 500 ميكرولتر من وسط الحث العصبي9 (انظر جدول المواد) بعد 24 ساعة.
  3. بعد الحث لمدة 24 ساعة ، أضف 10-7 مول / لتر من ATRA و 10 نانوغرام / مل من bFGF (انظر جدول المواد) إلى المحلول للحفاظ على التمايز المستحث للخلايا العصبية.
  4. إنهاء الحث عند تشكيل نقاط الاشتباك الخلوية الواضحة. تحقق من وجود نقاط الاشتباك العصبي الخلوية الواضحة باستخدام تقنية الفحص المجهري (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: تم استخدام تلطيخ التألق المناعي لتحديد العلامات الخاصة بالخلايا العصبية للإنولاز الخاص بالخلايا العصبية (NSE ، انظر جدول المواد) ، وهي علامة على الخلايا العصبية2.
  5. إجراء التصوير متحد البؤر على أوراق تسلق الخلايا.

7. تلطيخ التألق المناعي

  1. بعد التخلص من محلول زراعة الخلايا ، اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها.
  2. ثم أضف 500 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد إلى البئر ، وقم بتثبيت الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 45 دقيقة.
  3. اغسل الخلايا باستخدام PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها.
  4. تخلل الخلايا ب 100 ميكرولتر من 0.5٪ Triton-X في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  5. اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر PBS مع 1٪ BSA ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها.
  6. احتضان الخلايا ب 500 ميكرولتر من PBS مع 3٪ BSA و 0.1٪ Triton X-100 لكل بئر عند 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة لمنع موقع الارتباط غير المحدد.
  7. قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي ضد NSE (1: 100 ، انظر جدول المواد) باستخدام PBS (1: 100) الذي يحتوي على 1٪ BSA و 0.1٪ Triton X-100 ، واحتضان الخلايا بالجسم المضاد الأساسي طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  8. بعد التخلص من الجسم المضاد الأساسي ، اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من PBS الذي يحتوي على 1٪ BSA ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها.
  9. تمييع الجسم المضاد الثانوي الفلوري (الماعز المضاد للفأر IgG H & L ، Alexa Fluor 488 ، انظر Tabel of Materials) باستخدام PBS (1: 200) الذي يحتوي على 1٪ BSA و 0.1٪ Triton X-100 عند 1: 200 ، واحتضان الخلايا بالجسم المضاد الثانوي عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 60 دقيقة.
  10. اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من PBST (PBS يحتوي على 0.1٪ Tween-20) لكل بئر ثلاث مرات في الظلام لمدة 5 دقائق لكل بئر.
  11. ثم أضف 200 ميكرولتر من تلطيخ DAPI (مخفف PBST ، 0.1 ميكروغرام / مل) إلى البئر لتلطيخ النواة في درجة حرارة الغرفة بدون ضوء لمدة 5 دقائق.
  12. اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من PBST ثلاث مرات في الظلام لمدة 5 دقائق لكل منها.
  13. أضف عامل التبريد المضاد للمضان إلى الشريحة ثم قم بتغطية الشريحة برفق بغطاء زجاجي. أضف قطرات طلاء الأظافر حول زجاج الغطاء لإصلاحه.
  14. راقب الزجاج باستخدام مجهر ليزر متحد البؤر. استخدم إعدادات الفحص المجهري التالية: القناة الخضراء مع ليزر 488 نانومتر وقناة DAPI مع 405 نانومتر.

8. اختبار الانتشار

  1. بذرة 2 × 103 خلايا لكل بئر في 96 بئر من الأطباق. أضف 100 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا في كل بئر.
  2. أضف 10 ميكرولتر من مجموعة عد الخلايا -8 (CCK-8 ، انظر جدول المواد) في كل بئر.
  3. بعد يومين من الحضانة ، قم بقياس قيمة OD عند 450 نانومتر على قارئ صفيحة دقيقة في الأيام 1-7.
  4. تحليل قيم OD لأنواع مختلفة من الخلايا الجذعية باستخدام البرامج الإحصائية (انظر جدول المواد) وتقديمها كوسيلة ± SD. إجراء تحليل أحادي الاتجاه للتباين (ANOVA). ضع في اعتبارك أن قيمة P < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

عزل واستزراع UCA-PSCs و UCV-PSCs و WJ-MSCs من الحبل السري
تم فصل الشرايين السرية والوريد السري وهلام وارتون ميكانيكيا عن الحبل السري وتقطيعها إلى 2-3 سم3 قطع. كانت المسافة بين الشرايين أو الوريد أو كتل أنسجة الهلام في وارتون حوالي 1 سم ، مرتبة على شكل خماسي (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

عزلت هذه الدراسة ثلاثة أنواع مختلفة من الخلايا من شرايين الحبل السري والوريد وهلام وارتون. كان الحبل السري عبارة عن نفايات توصيل ، وكان استخدامه بسيطا وآمنا وبدون نزاع أخلاقي5. UC-MSCs أصلية ولديها قدرة تمايز قوية1. أظهرت الدراسات السابقة أن كمية UC-...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

يرغب المؤلفون في الإعراب عن تقديرهم للدعم المقدم من مشروع البحث الأساسي لمكتب تشانغتشو للعلوم والتكنولوجيا بموجب المنحة رقم CJ20200110 (إلى YJY) ، والمؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة في الصين (82001629 ، XQS) ، وبرنامج الشباب لمؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة جيانغسو (BK20200116 ، XQS) ، وتمويل أبحاث ما بعد الدكتوراه في مقاطعة جيانغسو (2021K277B ، XQS).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Adipogenic differentiation kitGibcoA1007001Multidirectional differentiation
Alizarin red staining solutionSigmaA5533Multidirectional differentiation
Antibody against CD13Thermo Fisher ScientificMA1-12034flow analysis
Antibody against CD34BD Biosciences560942flow analysis
Antibody against CD45BD Biosciences561865flow analysis
Antibody against CD73BD Biosciences940294flow analysis
Antibody against HLA-DRBD Biosciences555560flow analysis
Anti-fluorescence quenching agentAbcamAB103748Immunofluorescence
Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)abcamab150113Multidirectional differentiation
ATRASTEMCELL Technologies302-79-4cell culture
bFGFGibco13256029Multidirectional differentiation
BSASigmaV900933Immunofluorescence
Cell incubatorThermo Fisher ScientificHERAcell 240icell culture
Cell-counting kit-8DojindoCK04cell proliferation
CentrifugeThermo Fisher ScientificSorvall™ MTX-150cell culture
DAPISigma10236276001Immunofluorescence
DMSOSigmaD1435cell culture
FBSGibco10099141cell culture
FITC Mouse Anti-Human IgGBD Biosciences560952flow analysis
Flow CytometerThermo Fisher ScientificA24864flow analysis
Fluorescence microscopeThermo Fisher ScientificIM-5flow analysis
GelatinSigma48722Multidirectional differentiation
Leica MicroscopeLeicaDM500Multidirectional differentiation
LG-DMEM mediumGibco11-885-084cell culture
Microplate readerThermo Fisher ScientificA51119500Ccell proliferation
Neurogenic inductionGibcoA1647801Multidirectional differentiation
Oil red O solutionSigmaO1516Multidirectional differentiation
Osteogenic inductionCyagenHUXXC-90021Multidirectional differentiation
ParaformaldehydeSangon Biotech30525-89-4Immunofluorescence
Pasteur pipetteBiosharpBS-XG-03Lcell culture
PBS (phosphate buffered saline)HycloneSH30256.LScell culture
Penicillin streptomycinHycloneSV30010cell culture
Primary antibody against NSESanta Cruz Biotechnologysc-292097Multidirectional differentiation
SPSS 22.0IBMSPSS 22.0Statistical analysis
The cell climbing sheetsCITOTEST Scientific80346-0910Multidirectional differentiation
TritonX-100Sangon Biotech9002-93-1Immunofluorescence
TrypsinGibco25300120cell culture

References

  1. Zhang, Y., et al. Comparison of the biological characteristics of umbilical cord mesenchymal stem cells derived from the human heterosexual twins. Differentiation. 114, 1-12 (2020).
  2. Yang, Y., et al. Transplantation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells on a collagen scaffold improves ovarian function in a premature ovarian failure model of mice. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 55 (4), 302-311 (2019).
  3. Sepulveda, R. V., et al. Canine umbilical cord perivascular tissue: A source of stem cells for therapy and research. Research in Veterinary Science. 129, 193-202 (2020).
  4. Ahmed, T. A., Shousha, W. G., Abdo, S. M., Mohamed, I. K., El-Badri, N. Human adipose-derived pericytes: biological characterization and reprogramming into induced pluripotent stem cells. Cellular Physiology and Biochemistry. 54 (2), 271-286 (2020).
  5. Xu, L., et al. Different angiogenic potentials of mesenchymal stem cells derived from umbilical artery, umbilical vein, and Wharton's jelly. Stem Cells International. 2017, 3175748(2017).
  6. Garikipati, V. N. S., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stem cells from human fetus heart. PLoS ONE. 13 (2), -192244(2018).
  7. Simon, L. V., Hashmi, M. F., Bragg, B. N. APGAR Score. StatPearls. , Treasure Island, FL. (2022).
  8. Adler, E. M., Gough, N. R., Blundon, J. A. Differentiation of PC12 cells. Science's STKE. 2006 (351), (2006).
  9. Liang, X., et al. Bisphenol A and several derivatives exert neural toxicity in human neuron-like cells by decreasing neurite length. Food and Chemical Toxicology. 135, 111015(2020).
  10. Salehinejad, P., et al. Comparison of different methods for the isolation of mesenchymal stem cells from human umbilical cord Wharton's jelly. In Vitro Cellular & Developmental Biology Animal. 48 (2), 75-83 (2012).
  11. Ding, D. C., Chang, Y. H., Shyu, W. C., Lin, S. Z. Human umbilical cord mesenchymal stem cells: a new era for stem cell therapy. Cell Transplant. 24 (3), 339-347 (2015).
  12. Han, Y. F., et al. Optimization of human umbilical cord mesenchymal stem cell isolation and culture methods. Cytotechnology. 65 (5), 819-827 (2013).
  13. Esteves, C. L., et al. Equine mesenchymal stromal cells retain a pericyte-like phenotype. Stem Cells and Development. 26 (13), 964-972 (2017).
  14. Nagamura-Inoue, T., He, H. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells: Their advantages and potential clinical utility. World Journal of Stem Cells. 6 (2), 195-202 (2014).
  15. Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. BioMed Research International. 2013, 916136(2013).
  16. Carvalho, M. M., Teixeira, F. G., Reis, R. L., Sousa, N., Salgado, A. J. Mesenchymal stem cells in the umbilical cord: phenotypic characterization, secretome and applications in central nervous system regenerative medicine. Current Stem Cell Research & Therapy. 6 (3), 221-228 (2011).
  17. Harichandan, A., Sivasubramaniyan, K., Buhring, H. J. Prospective isolation and characterization of human bone marrow-derived MSCs. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 129, 1-17 (2013).
  18. Zhang, H., et al. Acceleration of fracture healing by overexpression of basic fibroblast growth factor in the mesenchymal stromal cells. STEM CELLS Translational Medicine. 6 (10), 1880-1893 (2017).
  19. Caplan, A. I. New MSC: MSCs as pericytes are Sentinels and gatekeepers. Journal of Orthopaedic Research. 35 (6), 1151-1159 (2017).
  20. Caplan, A. I. MSCs: the sentinel and safe-guards of injury. Journal of Cellular Physiology. 231 (7), 1413-1416 (2016).
  21. Tigges, U., Komatsu, M., Stallcup, W. B. Adventitial pericyte progenitor/mesenchymal stem cells participate in the restenotic response to arterial injury. Journal of Vascular Research. 50 (2), 134-144 (2013).
  22. Herrmann, M., et al. Pericyte plasticity-comparative investigation of the angiogenic and multilineage potential of pericytes from different human tissues. European Cells and Materials. 31, 236-249 (2016).
  23. Ahmed, T. A., El-Badri, N. Pericytes: The role of multipotent stem cells in vascular maintenance and regenerative medicine. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1079, 69-86 (2018).
  24. Greenberg, J. I., et al. A role for VEGF as a negative regulator of pericyte function and vessel maturation. Nature. 456 (7223), 809-813 (2008).
  25. Lin, S. L., et al. Targeting endothelium-pericyte cross talk by inhibiting VEGF receptor signaling attenuates kidney microvascular rarefaction and fibrosis. American Journal of Pathology. 178 (2), 911-923 (2011).
  26. Failla, C. M., Carbo, M., Morea, V. Positive and negative regulation of angiogenesis by soluble vascular endothelial growth factor receptor-1. International Journal of Molecular Sciences. 19 (5), 1306(2018).
  27. Kim, J. M., et al. Perivascular progenitor cells derived from human embryonic stem cells exhibit functional characteristics of pericytes and improve the retinal vasculature in a rodent model of diabetic retinopathy. STEM CELLS Translational Medicine. 5 (9), 1268-1276 (2016).
  28. Mills, S. J., Cowin, A. J., Kaur, P. Pericytes, mesenchymal stem cells and the wound healing process. Cells. 2 (3), 621-634 (2013).
  29. Dar, A., et al. Multipotent vasculogenic pericytes from human pluripotent stem cells promote recovery of murine ischemic limb. Circulation. 125 (1), 87-99 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

UC MSCs UCA PSCs UCV PSCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved