Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
* Эти авторы внесли равный вклад
В настоящем протоколе описывается выделение и культивирование мезенхимальных стволовых клеток из артерий пуповины, вены и желе Уортона.
Мезенхимальные стволовые клетки пуповины (ЯК-МСК) являются важным источником клеток для регенеративной медицины. ЯК-МСК могут быть выделены из пуповины, желе Уортона, а также из пупочных артерий и пупочной вены. Они известны как периваскулярные стволовые клетки, полученные из пупочных артерий (UCA-PSCs), периваскулярные стволовые клетки, полученные из пупочной вены (UCV-PSCs), и мезенхимальные стволовые клетки, полученные из желе Уортона (WJ-MSCs). UCA-PSCs и UCV-PSCs представляют собой перициты, полученные из периваскулярных областей, которые являются предшественниками МСК. Выделение и культивирование трех видов клеток является важным источником для изучения трансплантации и репарации стволовых клеток. Настоящий протокол сосредоточен на выделении и культивировании клеток путем механического разделения, адгезивной культуры и выползания клеток. С помощью этой методики можно получить три различных типа стволовых клеток. Маркеры клеточной поверхности были обнаружены с помощью проточной цитометрии. У стволовых клеток обнаружен потенциал многолинейной дифференцировки путем адипогенной, остеогенной и нейроподобной дифференцировки, что согласуется с фенотипом МСК. Этот экспериментальный протокол расширяет источник UC-MSCs. Кроме того, метод выделения клеток обеспечивает основу для дальнейшего изучения регенеративной медицины и других приложений.
Мезенхимальные стволовые клетки пуповины человека (ЯК-МСК) широко используются в регенеративной медицине из-за их неинвазивной работы, низкой иммуногенности и отсутствия этических споров1. Во многих исследованиях ЯК-МСК, выделенные из желе Уортона (WJ), могут прикрепляться к стенке, подвергаться мультидифференцировке и экспрессировать маркеры мезенхимальных стволовых клеток (МСК)2. Тем не менее, почти все МСК происходят из периваскулярной области3. Перициты, как подмножество периваскулярных клеток, являются прогениторными клетками МСК4. Таким образом, ЯК-МСК могут быть выделены из пуповины WJ, пупочных артерий (НЦА) и пупочной вены (НЦВ), известных как ПСК УЦА, БЦВ-ПСК и МСК WJ, соответственно5. Этот метод был направлен на выделение и культивирование трех различных типов стволовых клеток. Изоляция и культивирование ПСК УЦА, UCV-ПСК и WJ-MSC очень важны для обеспечения большего количества источников МСК.
В настоящем исследовании описывается выделение, культивирование и будущее применение ПСК UCA, UCV-PSC и WJ-МСК, которые обладают клеточной адгезией, экспрессируют маркеры МСК и имеют разнонаправленную дифференцировку. Выделенные стволовые клетки наблюдали под микроскопией и подвергали клеточной культуре, прохождению клеток, криоконсервации клеток и восстановлению клеток. Обоснованием использования этого метода было выползание клеток из ткани. По сравнению с предыдущими методами, такими как проточная цитометрия или иммуномагнитные методы шариков, которые были сложнымии дорогостоящими6, УЗИ-МСК могут быть массивно выделены методом адгезивного разделения и сканирования клеток; Они были использованы в предыдущем исследовании5. Анализ полученных стволовых клеток был проведен с помощью проточной цитометрии, чтобы определить, экспрессируют ли эти клетки маркеры МСК. Была введена многонаправленная дифференцировка стволовых клеток, чтобы определить, обладают ли три вида клеток потенциалом к дифференцировке в адипоциты, остеобласты и нейробласты. Выделение и культивирование трех типов стволовых клеток из пуповины было важным в клиническом использовании и полезным для исследователей для различных будущих применений.
Все экспериментальные процедуры были одобрены Комитетом по этике клинических исследований Третьей аффилированной больницы Университета Сучжоу. От людей было получено информированное письменное согласие. В настоящее исследование были включены лица с доношенными вагинальными родами или кесаревым сечением для получения пуповины. Пуповина поступает от здоровых новорожденных без гендерных предубеждений. У новорожденного был балл по шкале Апгар 8-10. Шкала Апгар — это быстрый тест для новорожденных, проводимый вскоре после их рождения. Этот тест проверяет мышечный тонус ребенка, частоту сердечных сокращений и другие признаки, чтобы определить, требуется ли дополнительная медицинская или неотложная помощь7. С другой стороны, пациенты с основными заболеваниями, такими как болезни сердца, печени, почек или другие инфекционные заболевания, были исключены из настоящего исследования.
1. Забор пуповины человека
2. Выделение и культивирование UCA-PSC, UCV-PSC и WJ-MSC
3. Определение поверхностных маркеров МСК методом проточной цитометрии
4. Дифференцировка ПСК UCA, UCV-ПСК и WJ-МСК в адипоциты
5. Дифференцировка стволовых клеток в остеобласты
6. Дифференцировка стволовых клеток в нейроны
7. Иммунофлуоресцентное окрашивание
8. Пробирный анализ
Выделение и бактериологическое исследование ПСК УЦА, UCV-ПСК и WJ-МСК из пуповины
Пупочные артерии, пупочная вена и студень Уортона механически отделяли от пуповины и разрезали на 2-3 смпо 3 части. Расстояние между артериями, веной или блоками желейной тка...
В этом исследовании были выделены три различных вида клеток из артерий пуповины, вены и желе Уортона. Пуповина была отходом доставки, и ее использование было простым, безопасным и не вызывало этическихспоров. ЯК-МСК являются оригинальными и обладают силь?...
Авторам нечего раскрывать.
Авторы выражают признательность за поддержку со стороны Проекта фундаментальных исследований Чанчжоуского научно-технического бюро под номером CJ20200110 (YJY), Национального фонда естественных наук Китая (82001629, XQS), Молодежной программы Фонда естественных наук провинции Цзянсу (BK20200116, XQS) и Финансирования постдокторских исследований провинции Цзянсу (2021K277B, XQS).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adipogenic differentiation kit | Gibco | A1007001 | Multidirectional differentiation |
Alizarin red staining solution | Sigma | A5533 | Multidirectional differentiation |
Antibody against CD13 | Thermo Fisher Scientific | MA1-12034 | flow analysis |
Antibody against CD34 | BD Biosciences | 560942 | flow analysis |
Antibody against CD45 | BD Biosciences | 561865 | flow analysis |
Antibody against CD73 | BD Biosciences | 940294 | flow analysis |
Antibody against HLA-DR | BD Biosciences | 555560 | flow analysis |
Anti-fluorescence quenching agent | Abcam | AB103748 | Immunofluorescence |
Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | abcam | ab150113 | Multidirectional differentiation |
ATRA | STEMCELL Technologies | 302-79-4 | cell culture |
bFGF | Gibco | 13256029 | Multidirectional differentiation |
BSA | Sigma | V900933 | Immunofluorescence |
Cell incubator | Thermo Fisher Scientific | HERAcell 240i | cell culture |
Cell-counting kit-8 | Dojindo | CK04 | cell proliferation |
Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | Sorvall™ MTX-150 | cell culture |
DAPI | Sigma | 10236276001 | Immunofluorescence |
DMSO | Sigma | D1435 | cell culture |
FBS | Gibco | 10099141 | cell culture |
FITC Mouse Anti-Human IgG | BD Biosciences | 560952 | flow analysis |
Flow Cytometer | Thermo Fisher Scientific | A24864 | flow analysis |
Fluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific | IM-5 | flow analysis |
Gelatin | Sigma | 48722 | Multidirectional differentiation |
Leica Microscope | Leica | DM500 | Multidirectional differentiation |
LG-DMEM medium | Gibco | 11-885-084 | cell culture |
Microplate reader | Thermo Fisher Scientific | A51119500C | cell proliferation |
Neurogenic induction | Gibco | A1647801 | Multidirectional differentiation |
Oil red O solution | Sigma | O1516 | Multidirectional differentiation |
Osteogenic induction | Cyagen | HUXXC-90021 | Multidirectional differentiation |
Paraformaldehyde | Sangon Biotech | 30525-89-4 | Immunofluorescence |
Pasteur pipette | Biosharp | BS-XG-03L | cell culture |
PBS (phosphate buffered saline) | Hyclone | SH30256.LS | cell culture |
Penicillin streptomycin | Hyclone | SV30010 | cell culture |
Primary antibody against NSE | Santa Cruz Biotechnology | sc-292097 | Multidirectional differentiation |
SPSS 22.0 | IBM | SPSS 22.0 | Statistical analysis |
The cell climbing sheets | CITOTEST Scientific | 80346-0910 | Multidirectional differentiation |
TritonX-100 | Sangon Biotech | 9002-93-1 | Immunofluorescence |
Trypsin | Gibco | 25300120 | cell culture |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены