Isolierung und Kultivierung von drei Arten von mesenchymalen Stammzellen der Nabelschnur

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen aus den Nabelschnurarterien, der Vene und dem Wharton-Gelee.

Zusammenfassung

Mesenchymale Stammzellen (UC-MSCs) der Nabelschnur sind eine wichtige Zellquelle für die regenerative Medizin. UC-MSCs können sowohl aus der Nabelschnur, dem Wharton-Gelee, als auch aus den Nabelarterien und der Nabelvene isoliert werden. Sie sind als perivaskuläre Stammzellen bekannt, die aus Nabelarterien (UCA-PSCs), perivaskuläre Stammzellen aus der Nabelvene (UCV-PSCs) gewonnen werden, und mesenchymale Stammzellen, die aus Wharton-Gelee gewonnen werden (WJ-MSCs). UCA-PSCs und UCV-PSCs sind Perizyten, die aus perivaskulären Regionen stammen, die Vorläufer von MSCs sind. Die Isolierung und Kultivierung der drei Zellarten ist eine wichtige Quelle für die Untersuchung der Stammzelltransplantation und -reparatur. Das vorliegende Protokoll konzentriert sich auf die Isolierung und Kultivierung von Zellen durch mechanische Trennung, adhärente Kultur und Zellauskriechen. Durch diese Technik können die drei verschiedenen Arten von Stammzellen gewonnen werden. Zelloberflächenmarker wurden mittels Durchflusszytometrie nachgewiesen. Die Stammzellen wurden durch adiogene, osteogene und neuronale Differenzierung auf ein Multilinien-Differenzierungspotenzial nachgewiesen, was mit dem Phänotyp der MSCs übereinstimmt. Dieses experimentelle Protokoll erweitert die Quelle von UC-MSCs. Darüber hinaus bietet die Zellisolierungsmethode eine Grundlage für weitere Studien der regenerativen Medizin und anderer Anwendungen.

Einleitung

Mesenchymale Stammzellen (UC-MSCs) der menschlichen Nabelschnur werden in der regenerativen Medizin aufgrund ihrer nicht-invasiven Wirkung, ihrer geringen Immunogenität und ihres Mangels an ethischen Streitigkeiten häufig eingesetzt¹. In vielen Studien können sich UC-MSCs, die aus Wharton-Gelee (WJ) isoliert wurden, an die Wand anheften, eine Mehrfachdifferenzierung durchlaufen und Marker von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) exprimieren2. Fast alle MSCs stammen jedoch aus der perivaskulären Region³. Perizyten, als Untergruppe der perivaskulären Zellen, sind Vorläuferzellen von MSCs⁴. Daher können UC-MSCs aus der Nabelschnur WJ, den Nabelarterien (UCAs) und der Nabelvene (UCV) isoliert werden, die als UCA-PSCs, UCV-PSCs bzw. WJ-MSCs bekannt sind⁵. Diese Methode zielte darauf ab, die drei verschiedenen Arten von Stammzellen zu isolieren und zu kultivieren. Die Isolierung und Kultur von UCA-PSCs, UCV-PSCs und WJ-MSCs sind sehr wichtig, um mehr Quellen für MSCs bereitzustellen.

Die vorliegende Studie beschreibt die Isolierung, Kultur und zukünftige Anwendung von UCA-PSCs, UCV-PSCs und WJ-MSCs, die zelluläre Adhäsion aufweisen, die Marker von MSCs exprimieren und eine multidirektionale Differenzierung aufweisen. Die isolierten Stammzellen wurden mikroskopisch beobachtet und Zellkultur, Zellpassage, Kryokonservierung und Zellrückgewinnung unterzogen. Der Grund für die Anwendung dieser Technik waren Zellen, die aus dem Gewebe herauskriechen. Im Vergleich zu den bisherigen Methoden, wie z.B. der Durchflusszytometrie oder immunmagnetischen Bead-Techniken, die aufwendig und teuer waren⁶, können die US-MSCs durch die adhärente Trenn- und Zellkriechenmethode massiv isoliert werden; Diese wurden in der vorangegangenen Studie^{verwendet 5}. Die abgeleiteten Stammzellen wurden durchflusszytometrisch analysiert, um festzustellen, ob diese Zellen MSC-Marker exprimieren. Es wurde eine multidirektionale Differenzierung der Stammzellen eingeführt, um festzustellen, ob die drei Zellarten das Potenzial haben, sich in Adipozyten, Osteoblasten und Neuroblasten zu differenzieren. Die Isolierung und Kultivierung von drei Arten von Stammzellen aus der Nabelschnur waren wichtig für den klinischen Einsatz und hilfreich für Forscher für vielfältige zukünftige Anwendungen.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren wurden von der Ethikkommission für klinische Forschung, Third Affiliated Hospital, Soochow University, genehmigt. Die schriftliche Einwilligung der Probanden nach Aufklärung wurde eingeholt. Personen mit einer vaginalen Entbindung oder einem Kaiserschnitt wurden in die vorliegende Studie eingeschlossen, um die Nabelschnur zu erhalten. Die Nabelschnur stammt von gesunden Neugeborenen ohne geschlechtsspezifische Vorurteile. Das Neugeborene hatte einen Apgar-Score von 8-10. Der Apgar-Score ist ein Schnelltest für Neugeborene, die kurz nach der Geburt verabreicht werden. Bei diesem Test werden der Muskeltonus, die Herzfrequenz und andere Anzeichen eines Babys überprüft, um festzustellen, ob eine zusätzliche medizinische Versorgung oder eine Notfallversorgung erforderlich ist⁷. Auf der anderen Seite wurden Patienten mit schweren Erkrankungen wie Herz-, Leber-, Nieren- oder anderen Infektionskrankheiten von der vorliegenden Studie ausgeschlossen.

1. Entnahme der menschlichen Nabelschnur

1. Legen Sie die Nabelschnur des Neugeborenen in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) und transportieren Sie sie bei 4 °C.
   HINWEIS: In der vorliegenden Studie wurden drei Nabelschnüre von drei Spendern verwendet.
2. Entnehmen Sie das Nabelschnurblut sofort unter sterilen Bedingungen und schneiden Sie entlang der Längsachse der Blutgefäße in 20 cm Entfernung der Nabelschnur. Trennen Sie die entsprechenden 20 cm der Nabelarterien und der Vene und entfernen Sie vorsichtig das Wharton-Gelee auf der Oberfläche.
   HINWEIS: Aus jeder Region wurden Explantatkulturen gewonnen, die in kleine Stücke (1-2 mm³) gehackt wurden, um eine Kreuzkontamination zwischen den drei Arten von Stammzellen zu vermeiden.
3. Schneiden Sie die Nabelarterien, die Vene und das Wharton-Gelee auf eine Größe von 1-2 mm³ und impfen Sie sie in 100 mm Zellkulturschalen. Führen Sie die Inokulation der Nabelarterien, der Vene und des Wharton-Gelees mit einer Pinzette nach einem zuvor veröffentlichten Bericht^{durch 5}. Die 100 mm Kulturplatten nicht vorbeschichten.
   HINWEIS: Das Intervall zwischen den Nabelarterien, der Vene oder dem Wharton-Gelee betrug etwa 1 cm. Eine zu lange Entnahmezeit vor der Zelltrennung kann die Lebensfähigkeit und Menge der Zellen beeinträchtigen. Es wird empfohlen, die Arterien und die Vene sofort von der Nabelschnur zu trennen. Die Abholzeit betrug bis zu 4 h.

2. Isolierung und Kultivierung von UCA-PSCs, UCV-PSCs und WJ-MSCs

1. Stellen Sie die Zellkulturschalen 3 Stunden lang kopfüber in einen 5 %_{CO 2} -Inkubator bei 37 °C, um sicherzustellen, dass die Nabelarterien, die Vene und das Wharton-Geleegewebe fest an den Zellkulturschalen haften, bevor das Kulturmedium hinzugefügt wird.
   1. Nach 3 Stunden stellen Sie die Zellkulturschalen wieder in den normalen Platz. Geben Sie 5 ml Zellkulturmedium (LG-DMEM, 10 % FBS, 100 IE/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin, siehe Materialtabelle) in die Zellkulturschale.
2. Geben Sie 3 ml bzw. 2 ml des Kulturmediums am 3^. bzw. 7^. Tag der ersten Woche in die Zellkulturschale. Achten Sie darauf, die Gewebeblöcke der Nabelschnurarterien, der Venen und des Wharton-Gelees nicht zu berühren.
3. Wechseln Sie in der zweiten Woche zweimal die Hälfte des flüssigen Mediums und in der dritten Woche zweimal das gesamte flüssige Medium.
4. Beobachten Sie, wie die Zellen etwa 7 Tage nach der Kultur aus den Gewebeblöcken kriechen, und verwerfen Sie die Gewebeblöcke, wenn die Zellen nach ~2 Wochen zu 80 % verschmolzen sind.
   1. Wenn die Zellen zu 100 % verschmolzen sind, passieren Sie sie in einem Verhältnis von 1:3 mit 2 ml 0,05 % Trypsin nach Zentrifugation bei 600 x g für 4 min bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Die primären Zellen, die aus einer Nabelschnur isoliert wurden, waren etwa 2 x 10⁶ UCA-PSCs, 1 x 10⁶ UCV-PSCs und 2 x 10⁶ WJ-MSCs. Die 2 x 10⁶ UCA-PSCs, 1 x 10⁶ UCV-PSCs und 2 x 10⁶ WJ-MSCs wurden aus 20 cm Nabelschnur isoliert. Die Zellen krochen in allen drei Nabelschnüren heraus, was darauf hindeutete, dass die Ergebnisse zwischen den Isolierungen wiederholbar waren.
   2. Die Zellen unter Beibehaltung einer Konzentration von 5 x 10⁵/100^cm2 in der Kulturschale aussäen. Bewahren Sie die 5 x 10⁵ Zellen in 1 mL Kryokonservierungslösung (90% FBS, 10% DMSO) auf. In der vorliegenden Studie wurden Zellen der dritten bis fünften Passage verwendet.

3. Nachweis von MSC-Oberflächenmarkern mittels Durchflusszytometrie

1. Verdauen Sie die Zellen der dritten Generation mit 0,05 % Trypsin, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Die Zellen werden bei 600 x g für 4 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Zellüberstand mit einer Pasteurpipette entsorgt. Dann resuspendieren Sie 1 x 10⁵ Zellen in 100 μl PBS (1% FBS). Bestimmt die Zellzahl, indem die Zellen mit einem Hämozytometer nach einem zuvor veröffentlichten Bericht gezählt^{werden 8}.
2. Inkubieren Sie die 1 x 10⁵ Zellen mit verschiedenen Phycoerythrin-Antikörpern gegen CD13 (FITC, 0,1 mg/mL), CD34 (FITC, 0,1 mg/mL), CD45 (FITC, 0,1 mg/mL), CD73 (FITC, 0,1 mg/mL) und HLA-DR (FITC, 0,1 mg/mL) im Dunkeln für 30 min. Für Kontrollen werden 1 x 10⁵ Zellen mit FITC-IgG (FITC Mouse Anti-Human IgG, 0,1 mg/ml) inkubiert (siehe Materialtabelle).
3. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 600 x g für 4 min bei Raumtemperatur und entsorgen Sie dann den Zellüberstand mit einer Pasteurpipette. 1 x 10⁵ Zellen in 500 μl PBS (1 % FBS) resuspendieren, mittels Durchflusszytometrie nachweisen und mit FlowJo² analysieren (siehe Materialtabelle).

4. Differenzierung von UCA-PSCs, UCV-PSCs und WJ-MSCs in Adipozyten

1. Die Zellen der dritten Generation werden in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 6 x 10⁴ Zellen/^cm2 mit 500 μl Zellmedium (LG-DMEM, 10 % FBS, 100 IE/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin, siehe Materialtabelle) pro Vertiefung in einem 5 % CO_{2 -} Inkubator bei 37 °C inokuliert.
2. Wechseln Sie das Zellmedium nach 24 h und wechseln Sie die Kontrollgruppe auf Zellmedium (LG-DMEM, 10 % FBS, 100 IE/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin). Führen Sie die Experimente durch, nachdem die Zellen zu 80 % in 24-Well-Platten verschmolzen sind.
   HINWEIS: Die Zellen in den Gruppen, die die Adipogenese induzierten, wurden auf ein adipogenes Induktionsmedium umgestellt (adipogenes Differenzierungskit, siehe Materialtabelle). Das Medium der Zellen wurde in beiden Gruppen alle 3 Tage gewechselt.
3. Beobachten Sie Lipidtröpfchen in Zellen etwa 21 Tage nach der Induktion in der adipogenen Induktionsgruppe und beenden Sie dann die adipogene Induktion.
   HINWEIS: Das adipogene Medium wurde durch Zellkulturmedium ersetzt, um die adipogene Induktion^{zu beenden 2,5}. Darüber hinaus zeigten die Zellen in der Kontrollgruppe keine signifikante Veränderung.
4. Waschen Sie die Zellen dreimal 5 min lang mit PBS und fixieren Sie sie dann 15 min lang mit 4% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur. Waschen Sie dann die Zellen dreimal mit PBS für jeweils 5 Minuten.
5. Entsorgen Sie das PBS und trocknen Sie die Zellen ca. 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie dann 500 μl ölrote O-Lösung (0,5 %) (siehe Materialtabelle) für 10 Minuten in die Vertiefung.
6. Entfernen Sie die ölrote O-Lösung und waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 Minuten mit PBS. Beobachten Sie die Zellen unter dem Mikroskop.

5. Differenzierung der Stammzellen in Osteoblasten

1. Geben Sie 500 μl 0,1 % Gelatine (siehe Materialtabelle) pro Well in 24-Well-Kulturplatten und entsorgen Sie sie nach 30 Minuten.
2. Imimpieren Sie 6 x 10⁴/^cm2 Zellen der dritten Generation in 24-Well-Kulturplatten und geben Sie 500 μl Zellkulturmedium oder osteogenes Induktionsmedium (Osteogenic Differentiation Kit, siehe Table of Materials) in jede Vertiefung in einem 5 % CO₂ -Inkubator bei 37 °C. In der Kontrollgruppe ist das Zellkulturmedium alle 3 Tage zu wechseln, während in der osteogenen Differenzierungsgruppe alle 3 Tage das osteogene Induktionsmedium ausgetauscht wird.
3. Überprüfen Sie nach 3-4 Wochen auf schwarze Kalziumablagerungen in den Zellen. Waschen Sie die Mulde dreimal für jeweils 5 Minuten mit PBS.
4. Fixieren Sie die Zellen 15 min lang bei Raumtemperatur mit 4% Paraformaldehyd und waschen Sie sie dreimal für jeweils 5 min mit PBS. Geben Sie die Alizarinrot-Färbelösung (1%) für 20 Minuten bei Raumtemperatur in die Vertiefung und entsorgen Sie sie dann.
5. Nach 30 min Trocknung bei Raumtemperatur die Zellen unter dem Mikroskop beobachten.

6. Differenzierung der Stammzellen in Neuronen

1. Die 6 x 10⁴/cm² Zellen der dritten Generation wurden in 24-Well-Kulturplatten geimpft, wobei die mit L-Polylysin behandelten sterilen Deckfolien ersetzt wurden. Legen Sie die Zellkletterblätter (siehe Materialtabelle) in die 24-Well-Platten, um die Zellen in Neuronen zu differenzieren. Kultivieren Sie die Zellen auf den Zellkletterblättern.
2. Geben Sie dann 500 μl Zellkulturmedium in die Vertiefung und ersetzen Sie das Zellkulturmedium nach 24 h durch 500 μl neurogenes Induktionsmedium⁹ (siehe Materialtabelle).
3. Nach 24-stündiger Induktion werden der Lösung ^10-7 mol/l ATRA und 10 ng/ml bFGF (siehe Materialtabelle) zugesetzt, um die induzierte Differenzierung der Neuronen aufrechtzuerhalten.
4. Beenden Sie die Induktion, wenn offensichtliche zelluläre Synapsen gebildet werden. Überprüfen Sie die offensichtlichen zellulären Synapsen mit Hilfe der Mikroskopietechnik (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Die Immunfluoreszenzfärbung wurde verwendet, um neuronenspezifische Marker der neuronenspezifischen Enolase (NSE, siehe Materialtabelle) zu identifizieren, die ein Marker für Neuronen^{ist 2}.
5. Führen Sie eine konfokale Bildgebung an den Zellkletterblättern durch.

7. Immunfluoreszenz-Färbung

1. Nach dem Verwerfen der Zellkulturlösung waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 min mit 500 μl PBS.
2. Geben Sie dann 500 μl 4% Paraformaldehyd in die Vertiefung und fixieren Sie die Zellen 45 Minuten lang bei Raumtemperatur.
3. Waschen Sie die Zellen dreimal für jeweils 5 Minuten mit PBS.
4. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 100 μL 0,5% Triton-X bei Raumtemperatur für 5 min.
5. Waschen Sie die Zellen mit 500 μL PBS mit 1% BSA dreimal für jeweils 5 min.
6. Inkubieren Sie die Zellen mit 500 μl PBS mit 3 % BSA und 0,1 % Triton X-100 pro Vertiefung bei 37 °C für 45 Minuten, um die unspezifische Bindungsstelle zu blockieren.
7. Der Primärantikörper gegen NSE (1:100, siehe Materialtabelle) wird mit PBS (1:100) verdünnt, das 1 % BSA und 0,1 % Triton X-100 enthält, und die Zellen werden über Nacht bei 4 °C mit dem Primärantikörper inkubiert.
8. Nach dem Verwerfen des Primärantikörpers werden die Zellen dreimal für jeweils 5 Minuten mit 500 μl PBS mit 1 % BSA gewaschen.
9. Verdünnen Sie den fluoreszierenden Sekundärantikörper (goat Anti-Mouse IgG H&L, Alexa Fluor 488, siehe Materialtabelle) mit PBS (1:200) mit 1 % BSA und 0,1 % Triton X-100 bei 1:200 und inkubieren Sie die Zellen mit dem Sekundärantikörper bei 37 °C im Dunkeln für 60 min.
10. Waschen Sie die Zellen mit 500 μL PBST (PBS enthält 0,1 % Tween-20) pro Vertiefung dreimal im Dunkeln für jeweils 5 Minuten.
11. Geben Sie dann 200 μl DAPI-Färbung (PBST verdünnt, 0,1 μg/ml) in die Vertiefung, um den Zellkern bei Raumtemperatur ohne Licht 5 Minuten lang zu färben.
12. Waschen Sie die Zellen mit 500 μL PBST dreimal im Dunkeln für jeweils 5 min.
13. Geben Sie das Antifluoreszenzlöschmittel auf den Objektträger und decken Sie den Objektträger dann vorsichtig mit einem Deckglas ab. Gib Nagellacktropfen um das Deckglas, um es zu fixieren.
14. Betrachten Sie das Glas mit einem konfokalen Lasermikroskop. Verwenden Sie die folgenden Mikroskopieeinstellungen: grüner Kanal mit 488 nm Laser und DAPI-Kanal mit 405 nm.

8. Proliferations-Assay

1. 2 x 10³ Zellen pro Well in 96-Well-Platten aussäen. Geben Sie 100 μl Zellkulturmedium in jede Vertiefung.
2. Geben Sie 10 μl Zellzählkit-8 (CCK-8, siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung.
3. Messen Sie nach 2 Tagen Inkubation den OD-Wert bei 450 nm auf einem Mikroplatten-Reader an den Tagen 1-7.
4. Analysieren Sie die OD-Werte der verschiedenen Stammzelltypen mit Hilfe einer statistischen Software (siehe Materialtabelle) und stellen Sie sie als Mittelwert ± SD dar. Führen Sie eine unidirektionale Varianzanalyse (ANOVA) durch. Betrachten Sie den P-Wert < 0,05 als statistisch signifikant.

Ergebnisse

Isolierung und Kultur von UCA-PSCs, UCV-PSCs und WJ-MSCs aus der Nabelschnur
Die Nabelarterien, die Nabelvene und das Wharton-Gelee wurden mechanisch von der Nabelschnur getrennt und in 2-3 cm³ Stücke geschnitten. Der Abstand zwischen Arterien, Venen oder Wharton-Gelee-Gewebeblöcken betrug etwa 1 cm und war in einer Quincunx-Form angeordnet (Abbildung 1A-C). Die drei Arten von Stammzellen wur...

Diskussion

In dieser Studie wurden drei verschiedene Arten von Zellen aus den Nabelschnurarterien, der Vene und dem Wharton-Gelee isoliert. Die Nabelschnur war Lieferabfall, und ihre Verwendung war einfach, sicher und ohne ethische Streitigkeiten⁵. UC-MSCs sind originell und haben eine starke Differenzierungsfähigkeit¹. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Menge an UC-MSCs, die durch die Kollagenase-, Trypsin- und Hyaluronidase-Verdauungsmethode ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adipogenic differentiation kit	Gibco	A1007001	Multidirectional differentiation
Alizarin red staining solution	Sigma	A5533	Multidirectional differentiation
Antibody against CD13	Thermo Fisher Scientific	MA1-12034	flow analysis
Antibody against CD34	BD Biosciences	560942	flow analysis
Antibody against CD45	BD Biosciences	561865	flow analysis
Antibody against CD73	BD Biosciences	940294	flow analysis
Antibody against HLA-DR	BD Biosciences	555560	flow analysis
Anti-fluorescence quenching agent	Abcam	AB103748	Immunofluorescence
Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	abcam	ab150113	Multidirectional differentiation
ATRA	STEMCELL Technologies	302-79-4	cell culture
bFGF	Gibco	13256029	Multidirectional differentiation
BSA	Sigma	V900933	Immunofluorescence
Cell incubator	Thermo Fisher Scientific	HERAcell 240i	cell culture
Cell-counting kit-8	Dojindo	CK04	cell proliferation
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	Sorvall™ MTX-150	cell culture
DAPI	Sigma	10236276001	Immunofluorescence
DMSO	Sigma	D1435	cell culture
FBS	Gibco	10099141	cell culture
FITC Mouse Anti-Human IgG	BD Biosciences	560952	flow analysis
Flow Cytometer	Thermo Fisher Scientific	A24864	flow analysis
Fluorescence microscope	Thermo Fisher Scientific	IM-5	flow analysis
Gelatin	Sigma	48722	Multidirectional differentiation
Leica Microscope	Leica	DM500	Multidirectional differentiation
LG-DMEM medium	Gibco	11-885-084	cell culture
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific	A51119500C	cell proliferation
Neurogenic induction	Gibco	A1647801	Multidirectional differentiation
Oil red O solution	Sigma	O1516	Multidirectional differentiation
Osteogenic induction	Cyagen	HUXXC-90021	Multidirectional differentiation
Paraformaldehyde	Sangon Biotech	30525-89-4	Immunofluorescence
Pasteur pipette	Biosharp	BS-XG-03L	cell culture
PBS (phosphate buffered saline)	Hyclone	SH30256.LS	cell culture
Penicillin streptomycin	Hyclone	SV30010	cell culture
Primary antibody against NSE	Santa Cruz Biotechnology	sc-292097	Multidirectional differentiation
SPSS 22.0	IBM	SPSS 22.0	Statistical analysis
The cell climbing sheets	CITOTEST Scientific	80346-0910	Multidirectional differentiation
TritonX-100	Sangon Biotech	9002-93-1	Immunofluorescence
Trypsin	Gibco	25300120	cell culture