三种脐带间充质干细胞的分离与培养

摘要

本方案描述了从脐带动脉、静脉和沃顿氏胶中分离和培养间充质干细胞。

摘要

脐带间充质干细胞 （UC-MSC） 是再生医学的重要细胞来源。UC-MSC 可以从脐带沃顿氏胶以及脐动脉和脐静脉中分离出来。它们被称为从脐动脉获得的血管周围干细胞 （UCA-PSC）、从脐静脉获得的血管周围干细胞 （UCV-PSC） 和从沃顿商学院果冻中获得的间充质干细胞 （WJ-MSC）。UCA-PSCs 和 UCV-PSCs 是来源于 MSC 祖细胞血管周围区域的周细胞。这三种细胞的分离和培养是研究干细胞移植和修复的重要来源。本方案侧重于通过机械分离、贴壁培养和细胞爬出来分离和培养细胞。通过这种技术，可以衍生出三种不同类型的干细胞。通过流式细胞术检测细胞表面标志物。通过成骨、成骨和神经样分化检测干细胞的多系分化潜力，这与 MSCs 的表型一致。该实验方案扩展了 UC-MSC 的来源。此外，细胞分离方法为进一步研究再生医学和其他应用提供了基础。

引言

人脐带间充质干细胞 （UC-MSC） 因其无创手术、低免疫原性和无伦理争议而广泛用于再生医学¹。在许多研究中，从沃顿胶 （WJ） 中分离的 UC-MSC 可以附着在壁上，经历多分化，并表达间充质干细胞 （MSC） 的标志物²。然而，几乎所有 MSC 都起源于血管周围区域³。周细胞作为血管周围细胞的一个亚群，是 MSCs⁴ 的祖细胞。因此，可以从脐带 WJ、脐动脉 （UCA） 和脐静脉 （UCV） 中分离出 UC-MSC，分别称为 UCA-PSC、UCV-PSC 和 WJ-MSC⁵。该方法旨在分离和培养三种不同类型的干细胞。UCA-PSCs、UCV-PSCs 和 WJ-MSCs 的分离和培养对于提供更多的 MSCs 来源非常重要。

本研究描述了 UCA-PSCs、UCV-PSCs 和 WJ-MSCs 的分离、培养和未来应用，它们具有细胞粘附、表达 MSCs 标志物并具有多向分化。在显微镜下观察分离的干细胞，并进行细胞培养、细胞传代、细胞冷冻保存和细胞回收。使用这种技术的基本原理是细胞从组织中爬出。与以前复杂且昂贵的流式细胞术或免疫磁珠技术相比 6，US-MSC 可以通过贴壁分离和细胞爬行法进行大规模分离;这些在前面的研究中被使用⁵。对衍生的干细胞进行流式细胞术分析，以检测这些细胞是否表达 MSC 标志物。引入干细胞的多向分化以检测这三种细胞是否具有分化为脂肪细胞、成骨细胞和神经母细胞的潜力。从脐带中分离和培养三种类型的干细胞在临床应用中很重要，有助于研究人员在未来的各种应用中。

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研究方案

所有实验程序均经苏州大学附属第三医院临床研究伦理委员会批准。从人类受试者那里获得知情书面同意。本研究包括足月阴道分娩或剖宫产的个体以获得脐带。脐带来自健康的新生儿，没有性别偏见。新生儿的 Apgar 评分为 8-10。Apgar 评分是对出生后不久的新生儿进行的快速测试。该测试检查婴儿的肌肉张力、心率和其他体征，以查看是否需要任何额外的医疗或紧急护理⁷。另一方面，患有心脏、肝脏、肾脏或其他传染病等重大疾病的患者被排除在本研究之外。

1. 人体脐带的采集

1. 将新生儿的脐带放入磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 中并在 4 °C 下运输。
   注意：本研究使用了来自三个供体的三根脐带。
2. 在无菌条件下立即取出脐带血，并沿脐带 20 厘米处的长轴血管切开。将适当的 20 厘米脐动脉和静脉分开，小心去除表面的沃顿胶。
   注：从每个区域获得外植体培养物，切成小块 （1-2 mm³），以避免三种干细胞之间的交叉污染。
3. 将脐动脉、静脉和沃顿氏胶切成 1-2 mm³ 的大小，并将它们接种到 100 mm 细胞培养皿中。按照先前发布的报告⁵，使用镊子对脐动脉、静脉和沃顿氏胶进行接种。不要预涂 100 mm 培养板。
   注意：脐动脉、静脉或沃顿氏胶之间的间隔约为 1 厘米。分离细胞前采集时间过长可能会影响细胞活力和数量。建议立即将动脉和静脉与脐带分离。收集时间长达 4 小时。

2. 分离和培养 UCA-PSC、UCV-PSC 和 WJ-MSC

1. 将细胞培养皿在 37 °C 的 5% CO₂ 培养箱中倒置 3 小时，以确保脐动脉、静脉和沃顿氏胶组织在加入培养基之前紧密附着在细胞培养皿上。
   1. 3 小时后，将细胞培养皿放回正常放置位置。向细胞培养皿中加入 5 mL 细胞培养基（LG-DMEM、10% FBS、100 IU/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素，参见 材料表）。
2. 在第一周的^{第 3 天和} 第 7 天分别将 3 mL 和 2 mL 培养基添加到细胞培养皿中。小心不要触摸脐带动脉、静脉和沃顿胶的组织块。
3. 第二周更换一半的液体培养基两次，第三周更换整个液体培养基两次。
4. 观察细胞在培养后约 7 天从组织块中爬出，然后在 ~2 周时细胞 80% 融合时丢弃组织块。
   1. 当细胞 100% 融合时，在室温下以 600 x g 离心 4 分钟后，以 1：3 的比例与 2 mL 0.05% 胰蛋白酶传代。
      注：从脐带分离的原代细胞约为 2 x 10⁶ 个 UCA-PSC、1 x 10⁶ 个 UCV-PSC 和 2 x 10^个 WJ-MSC。从 20 cm 脐带中分离出 2 x 10⁶ 个 UCA-PSCs、1 x 10^个 6 个 UCV-PSCs 和 2 x 10^个 6 WJ-MSCs。细胞在所有三个脐带中爬出，这表明分离之间的结果是可重复的。
   2. 接种细胞，在培养皿中保持 5 x 10⁵/100 cm² 的浓度。将 5 x 10⁵ 个细胞保存在 1 mL 冻存溶液（90% FBS、10% DMSO）中。本研究使用第 3 至第 5 代细胞。

3. 流式细胞术检测 MSC 表面标志物

1. 用 0.05% 胰蛋白酶消化第三代细胞以获得单细胞悬液。在室温下以 600 x g 离心细胞 4 分钟，并使用巴斯德移液器弃去细胞上清液。然后将 1 x 10⁵ 个细胞重悬于 100 μL PBS（1% FBS）中。根据先前发表的报告，使用血细胞计数器对细胞进行计数来评估细胞数量⁸。
2. 将 1 x 10⁵ 个细胞与针对 CD13（FITC，0.1 mg/mL）、CD34（FITC，0.1 mg/mL）、CD45（FITC，0.1 mg/mL）、CD73（FITC，0.1 mg/mL）和 HLA-DR（FITC，0.1 mg/mL）的各种藻红蛋白抗体在黑暗中孵育 30 分钟。对于对照，将 1 x 10⁵ 个细胞与 FITC-IgG（FITC 小鼠抗人 IgG，0.1 mg/mL）一起孵育（参见 材料表）。
3. 在室温下以 600 x g 离心细胞 4 分钟，然后使用巴斯德移液管弃去细胞上清液。将 1 x 10⁵ 个细胞重悬于 500 μL PBS（1% FBS）中，通过流式细胞术检测，并通过 FlowJo² 分析（参见 材料表）。

4. UCA-PSC、UCV-PSC 和 WJ-MSC 分化为脂肪细胞

1. 在 37 °C 的 5% CO₂ 培养箱中，以 6 x 10⁴ 个细胞/cm² 的密度将第三代细胞接种到 24 孔板中，每孔加入 500 μL 细胞培养基（LG-DMEM、10% FBS、100 IU/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素，参见材料表）。
2. 24 小时后更换细胞培养基，并将对照组更改为细胞培养基（LG-DMEM、10% FBS、100 IU/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素）。在细胞 80% 融合在 24 孔板中后进行实验。
   注：将诱导脂肪生成的组中的细胞更换为成脂诱导培养基（成脂分化试剂盒，参见 材料表）。两组细胞培养基每 3 天更换一次。
3. 在成脂诱导组诱导后约 21 天观察细胞中的脂滴，然后终止成脂诱导。
   注：用细胞培养基替换成脂培养基以终止成脂诱导 ^2,5。此外，对照组的细胞没有显示显着变化。
4. 用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟，然后在室温下用 4% 多聚甲醛固定 15 分钟。然后，用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
5. 弃去 PBS 并在室温下干燥细胞约 20 分钟。然后，向孔中加入 500 μL 油红 O 溶液 （0.5%）（参见 材料表）10 分钟。
6. 取出油红 O 溶液，用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。在显微镜下观察细胞。

5. 干细胞分化成骨细胞

1. 将每孔 500 μL 0.1% 明胶（参见 材料表）放入 24 孔培养板中，并在 30 分钟后丢弃。
2. 将 6 x 10⁴/cm² 的第三代细胞接种到 24 孔培养板中，并在 37 °C 的 5% CO₂ 培养箱中向每个孔中加入 500 μL 细胞培养基或成骨诱导培养基（成骨分化试剂盒，参见材料表）。 对照组每 3 天更换一次细胞培养基，同时也每 3 天更换一次成骨分化组的成骨诱导培养基。
3. 3-4 周后，检查细胞中是否有黑钙沉积。用 PBS 洗涤孔 3 次，每次 5 分钟。
4. 在室温下用 4% 多聚甲醛固定细胞 15 分钟，然后用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。在室温下向孔中加入茜素红染色液 （1%） 20 分钟，然后弃去。
5. 在室温下干燥 30 分钟后，在显微镜下观察细胞。

6. 干细胞分化为神经元

1. 将 6 x 10^{个 4}/cm² 第三代细胞接种到 24 孔培养板中，其中预先放置了用 L-聚赖氨酸处理的无菌盖玻片。将细胞攀爬片（参见 材料表）放入 24 孔板中，以将细胞分化为神经元。在细胞攀爬片上培养细胞。
2. 然后，向孔中加入 500 μL 细胞培养基，并在 24 小时后用 500 μL 神经源性诱导培养基⁹ （参见 材料表）替换细胞培养基。
3. 诱导 24 小时后，向溶液中加入 ^10-7 mol/L 的 ATRA 和 10 ng/mL 的 bFGF（参见 材料表）以维持神经元的诱导分化。
4. 当形成明显的细胞突触时终止诱导。使用显微镜技术检查明显的细胞突触（参见 材料表）。
   注：免疫荧光染色用于鉴定神经元特异性烯醇化酶 （NSE，参见 材料表） 的神经元特异性标志物，这是神经元² 的标志物。
5. 对细胞爬升片进行共聚焦成像。

7. 免疫荧光染色

1. 丢弃细胞培养溶液后，用 500 μL PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
2. 然后，向孔中加入 500 μL 4% 多聚甲醛，并在室温下固定细胞 45 分钟。
3. 用 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
4. 在室温下用 100 μL 0.5% Triton-X 透化细胞 5 分钟。
5. 用 500 μL 含 1% BSA 的 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
6. 将细胞与 500 μL PBS 和 3% BSA 和 0.1% Triton X-100 在 37 °C 下孵育 45 分钟，以阻断非特异性结合位点。
7. 用含有 1% BSA 和 0.1% Triton X-100 的 PBS （1：100） 稀释抗 NSE 的一抗（1：100，参见 材料表），并将细胞与一抗在 4 °C 下孵育过夜。
8. 丢弃一抗后，用 500 μL 含 1% BSA 的 PBS 洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
9. 用含有 1% BSA 和 0.1% Triton X-100 的 PBS （1：200） 以 1：200 稀释荧光二抗（山羊抗小鼠 IgG H&L，Alexa Fluor 488，参见 材料表），并在 37 °C 下将细胞与二抗在黑暗中孵育 60 分钟。
10. 用每孔 500 μL PBST（含有 0.1% Tween-20 的 PBS）在黑暗中洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
11. 然后，向孔中加入 200 μL DAPI 染色（PBST 稀释，0.1 μg/mL），在室温下无光对细胞核染色 5 分钟。
12. 用 500 μL PBST 在黑暗中洗涤细胞 3 次，每次 5 分钟。
13. 将抗荧光淬灭剂添加到载玻片中，然后用盖玻片轻轻盖住载玻片。在盖玻片周围滴上指甲油以固定它。
14. 用激光共聚焦显微镜观察玻璃。使用以下显微镜设置：488 nm 激光的绿色通道和 405 nm 的 DAPI 通道。

8. 增殖试验

1. 每孔将 2 x 10³ 个细胞接种到 96 孔板中。向每个孔中加入 100 μL 细胞培养基。
2. 向每个孔中加入 10 μL 细胞计数试剂盒-8（CCK-8，参见 材料表）。
3. 孵育 2 天后，在第 1-7 天在酶标仪上测量 450 nm 处的 OD 值。
4. 使用统计软件分析不同类型干细胞的 OD 值（参见 材料表），并将它们作为 SD ±平均值。执行单因素方差分析 （ANOVA）。将 P 值< 0.05 视为统计显著性。

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结果

从脐带中分离和培养 UCA-PSC、UCV-PSC 和 WJ-MSC
将脐动脉、脐静脉和沃顿氏胶与脐带机械分离，切成 2-3 cm³ 块。动脉、静脉或沃顿氏胶质组织块之间的距离约为 1 厘米，呈梅花形排列（图 1A-C）。通过组织贴壁培养法分离 3 种干细胞⁵.贴壁培养约 1 周后，观察到细胞径向爬出，表现出长纺...

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讨论

本研究从脐带动脉、静脉和沃顿胶中分离出三种不同类型的细胞。脐带是分娩废料，其使用简单、安全且无道德争议⁵.UC-MSCs 是原始的，具有很强的分化能力¹。以前的研究表明，通过胶原酶、胰蛋白酶和透明质酸酶消化法从脐带分离的 UC-MSCs 量并不丰富;干细胞不能在大约 70% 的标本中多次传代，这不能满足临床需求¹⁰?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adipogenic differentiation kit	Gibco	A1007001	Multidirectional differentiation
Alizarin red staining solution	Sigma	A5533	Multidirectional differentiation
Antibody against CD13	Thermo Fisher Scientific	MA1-12034	flow analysis
Antibody against CD34	BD Biosciences	560942	flow analysis
Antibody against CD45	BD Biosciences	561865	flow analysis
Antibody against CD73	BD Biosciences	940294	flow analysis
Antibody against HLA-DR	BD Biosciences	555560	flow analysis
Anti-fluorescence quenching agent	Abcam	AB103748	Immunofluorescence
Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488)	abcam	ab150113	Multidirectional differentiation
ATRA	STEMCELL Technologies	302-79-4	cell culture
bFGF	Gibco	13256029	Multidirectional differentiation
BSA	Sigma	V900933	Immunofluorescence
Cell incubator	Thermo Fisher Scientific	HERAcell 240i	cell culture
Cell-counting kit-8	Dojindo	CK04	cell proliferation
Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	Sorvall™ MTX-150	cell culture
DAPI	Sigma	10236276001	Immunofluorescence
DMSO	Sigma	D1435	cell culture
FBS	Gibco	10099141	cell culture
FITC Mouse Anti-Human IgG	BD Biosciences	560952	flow analysis
Flow Cytometer	Thermo Fisher Scientific	A24864	flow analysis
Fluorescence microscope	Thermo Fisher Scientific	IM-5	flow analysis
Gelatin	Sigma	48722	Multidirectional differentiation
Leica Microscope	Leica	DM500	Multidirectional differentiation
LG-DMEM medium	Gibco	11-885-084	cell culture
Microplate reader	Thermo Fisher Scientific	A51119500C	cell proliferation
Neurogenic induction	Gibco	A1647801	Multidirectional differentiation
Oil red O solution	Sigma	O1516	Multidirectional differentiation
Osteogenic induction	Cyagen	HUXXC-90021	Multidirectional differentiation
Paraformaldehyde	Sangon Biotech	30525-89-4	Immunofluorescence
Pasteur pipette	Biosharp	BS-XG-03L	cell culture
PBS (phosphate buffered saline)	Hyclone	SH30256.LS	cell culture
Penicillin streptomycin	Hyclone	SV30010	cell culture
Primary antibody against NSE	Santa Cruz Biotechnology	sc-292097	Multidirectional differentiation
SPSS 22.0	IBM	SPSS 22.0	Statistical analysis
The cell climbing sheets	CITOTEST Scientific	80346-0910	Multidirectional differentiation
TritonX-100	Sangon Biotech	9002-93-1	Immunofluorescence
Trypsin	Gibco	25300120	cell culture